Name: biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers
Uploaded: 2021-12-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 EY029130 (S.B.) ו- P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 וקרן המחקר אינס מנדל (R.P.M.), קרן מרפן, ומענק בלתי מוגבל למחלקה לרפואת עיניים ומדעי הראייה באוניברסיטת וושינגטון ממחקר למניעת עיוורון. ג'יי.אר גם קיבל מענק מהאוניברסיטה למדעי הבריאות ובית המרקחת לתמיכה בפרויקט זה.

כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים באוניברסיטת וושינגטון ודבקו בהצהרת ARVO לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזון.
1. ייצור חלקים מיוחדים ובניית מנגנון
<ol><li>ייצור של חלקים מיוחדים<ol>
<li>ייצור בדיקה. החזיקו נימי זכוכית בזווית כפי שמוצג בחלונית השמ...

<ol>
	<li>Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+glass:+structural+determinants+of+eye+lens+transparency.">Biological glass: structural determinants of eye lens transparency.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinn's+zonule.">Zinn's zonule.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).</li><li>Dureau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+zonular+diseases.">Pathophysiology of zonular diseases.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent-transforming+growth+factor+beta-binding+protein-2+(LTBP-2)+is+required+for+longevity+but+not+for+development+of+zonular+fibers.">Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers.</a> Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).</li><li>Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fibers,+reticular+fibers+and+elastic+fibers.+A+comprehensive+understanding+from+a+morphological+viewpoint.">Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint.</a> Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+preserving+and+visualizing+the+three-dimensional+structure+of+the+mouse+zonule.">A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule.</a> Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).</li><li>Todorovic, V., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTBPs,+more+than+just+an+escort+service.">LTBPs, more than just an escort service.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).</li><li>Mecham, R. P., Gibson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microfibril-associated+glycoproteins+(MAGPs)+and+the+microfibrillar+niche.">The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche.</a> Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).</li><li>Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eye+development+is+characterized+by+coordinated+expression+of+fibrillin+isoforms.">Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+TGF-&#946;+binding+protein-2+is+essential+for+the+development+of+ciliary+zonule+microfibrils.">Latent TGF-&#946; binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).</li><li>De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+bovine+and+human+ciliary+zonule.">Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).</li><li>Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+supramolecular+organization+of+fibrillin-rich+microfibrils+determines+the+mechanical+properties+of+bovine+zonular+filaments.">The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments.</a> Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).</li><li>Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+mechanical+behaviour+and+estimation+of+the+elastic+properties+of+porcine+zonular+fibres.">Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres.</a> Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).</li><li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+body+in+accommodation.">The ciliary body in accommodation.</a> Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).</li><li>Michael, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+human+lens+zonules+as+a+function+of+age+in+presbyopes.">Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).</li><li>van Alphen, G. W., Graebel, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+tissues+involved+in+accommodation.">Elasticity of tissues involved in accommodation.</a> Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).</li><li>Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+micromechanics+of+elastic+tissue.">The structure and micromechanics of elastic tissue.</a> Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).</li><li>Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+fibrillin-1+in+the+mouse+eye+results+in+ectopia+lentis+and+other+ocular+phenotypes+associated+with+Marfan+syndrome.">Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).</li><li>Weinbaum, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+microfibril-associated+glycoprotein-1+leads+to+complex+phenotypes+in+multiple+organ+systems.">Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).</li><li>Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FBN1+gene+mutations+in+patients+with+ectopia+lentis+and+marfanoid+habitus.">Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).</li></ol>

הזונולה היא מערכת ECM יוצאת דופן שבה סיבים מסודרים באופן סימטרי וניתן לתמרן אותם באופן זהה על ידי הזזת עדשת העין לאורך הציר האופטי. ניתן גם לגשת בקלות לחלל ללא הפרעה תאית, מה שמאפשר ללמוד את הסיבים בסביבה הקרובה למצבם הטבעי. טכניקת המשיכה למעלה מנצלת את מצגת ECM זו כדי לתפעל את הסיבים העדינים ?...

העין של בעל חוליות מכילה עדשה אופטית חיה המסייעת למקד תמונות ברשתית1. העדשה תלויה על הציר האופטי על ידי מערכת של סיבים עדינים, רדיאליים, כפי שמודגם באיור 1A. בקצה אחד, הסיבים מתחברים לקו המשווה של העדשה, ובקצה השני, אל פני השטח של הגוף הסילארי. האורכים שלהם משתרעים על פני מרחקים הנעים בין 150 מיקרומטר בעכברים ל 1 מ"מ בבני אדם. באופן קולקטיבי, סיבים אלה ידועים בשם zonule של Zinn2, zonule ciliary, או פשוט zonule. טראומה עינית, מחלות והפרעות גנטיות מסוימות יכולות להשפיע על שלמות הסיבים הזונולריים3, וכתוצאה מכך כישלונם הסופי ואובדן הראייה הנלווה אליהם. בעכברים, הסיבים יש ליבה המורכבת בעיקר של פיברילין חלבון-2, מוקף מעטפת עשירה פיברילין-14. למרות סיבים זונולריים ייחודיים לעין, הם נושאים קווי דמיון רבים סיבי ECM מבוססי אלסטין שנמצאו במקומות אחרים בגוף. אלה האחרונים מכוסים על ידי פיברילין-1 מעטפת5 ויש להם ממדים דומים סיבים זונולריים6. חלבונים אחרים, כגון פקטורי גדילה β חלבון מחייב β (LTBPs) וגליקופרוטאין-1 הקשור למיקרופיבריל (MAGP-1), נמצאים בשיתוף עם שני סוגי הסיבים7,8,9,10,111 הקשורים למיקרופיבריל. מודולוס אלסטי של סיבים זונולריים הוא בטווח של 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16, דומה לזה של סיבים מבוססי אלסטין (0.3-1.2 MPa)17. קווי דמיון ארכיטקטוניים ומכאניים אלה מובילים אותנו להאמין כי כל תובנה לגבי התפקידים של חלבונים הקשורים לזונולה עשויה לעזור להבהיר את תפקידם בסיבים אלסטיים אחרים של ECM.
המטרה העיקרית של פיתוח השיטה המתוארת כאן היא לקבל תובנות על התפקיד של חלבונים זונולריים ספציפיים בהתקדמות של מחלת עיניים תורשתית. הגישה הכללית היא להשוות את המאפיינים הוויסקואלסטיים של סיבים זונולריים בעכברים מסוג בר עם אלה של עכברים הנושאים מוטציות ממוקדות בגנים המקודדים חלבונים זונולריים. בעוד מספר שיטות שימשו בעבר כדי למדוד את המאפיינים האלסטו-מכניים של סיבים זונולריים, כולם תוכננו לעיניים של בעלי חיים גדולים בהרבה12,13,14,15,16. כמו מודלים כאלה אינם ניתנים למתיחה גנטית; ביקשנו לפתח שיטה ניסיונית שמתאימה יותר לעיניים הקטנות והעדינות של העכברים.
השיטה שפיתחנו להערכת הצמיגות של הסיבים הזונוריים של העכבר היא טכניקה שאנו מכנים "בדיקת משיכה למעלה4,18", המסוכמת חזותית באיור 1. תיאור מפורט של שיטת המשיכה למעלה וניתוח התוצאות מסופק להלן. אנו מתחילים בתיאור בניית המנגנון, כולל החלקים המודפסים התלת מימדיים (3D) המשמשים בפרויקט. לאחר מכן, אנו מפרטים את הפרוטוקול המשמש להשגת והכנת העיניים לניסוי. לבסוף, אנו מספקים הוראות שלב אחר שלב כיצד להשיג נתונים לקביעת המאפיינים הצמיגיים של סיבים זונולריים. בסעיף תוצאות מייצגות, אנו משתפים נתונים שלא פורסמו בעבר שהושגו בשיטה שלנו על התכונות הצמיגיות של סיבים זונולריים מעכברים חסרי MAGP-119, כמו גם ערכת בקרה המתקבלת מחיות בר תואמות גיל. לבסוף, אנו מסיימים עם הערות כלליות על היתרונות והמגבלות של השיטה, והצעות לניסויים פוטנציאליים שעשויים להבהיר כיצד גורמים סביבתיים וביוכימיים משפיעים על המאפיינים הוויסקואלסטיים של סיבי ECM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4-20 hex screws 3/4 inch long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4-20 nut</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D SLA printer</td>
			<td>Anycubic</td>
			<td>Photon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 screws 3/8 inch long, 2</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B120-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (super) glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale accurate to 0.01 g</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>OHAUS Scout 220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas cigarette lighter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inspection/dissection microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: SM-4NTP</td>
			<td>Working distance ~ 15 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator, Economy 4-axis</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Kite-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micrometer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Z812B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LK1431L1</td>
			<td>-75 mm focal length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 50 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder, 3 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post, 4 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale logging software</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>LoggePro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KDC101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller software</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted base, 1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted bases, 2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand for micromanipular</td>
			<td>WPI</td>
			<td>M-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-camera for microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: MD500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV activated glue with UV source</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers

גמישות חיונית לתפקוד של רקמות כגון כלי דם, שרירים וריאות. מאפיין זה נגזר בעיקר מהמטריצה החוץ-תאית (ECM), רשת החלבון המחברת תאים ורקמות יחד. כיצד המאפיינים האלסטיים של רשת ECM מתייחסים להרכב שלה, והאם תכונות ההרפיה של ECM ממלאות תפקיד פיזיולוגי, הן שאלות שטרם טופלו במלואן. חלק מהאתגר טמון בארכיטקטורה המורכבת של רוב מערכות ה- ECM והקושי לבודד רכיבי ECM מבלי להתפשר על המבנה שלהם. יוצא מן הכלל אחד הוא zonule, מערכת ECM נמצא בעין של בעלי חוליות. הזונולה כוללת סיבים באורך של מאות עד אלפי מיקרומטרים המשתרעים על פני החלל נטול התאים בין העדשה לקיר העין. בדו"ח זה, אנו מתארים טכניקה מכנית המנצלת את המבנה המאורגן ביותר של הזונול כדי לכמת את תכונותיו הוויסקולאסטיות ולקבוע את תרומתם של רכיבי חלבון בודדים. השיטה כוללת ניתוח של עין קבועה כדי לחשוף את העדשה ואת zonule ומשתמשת בטכניקת משיכה למעלה המותחת את הסיבים הזונולריים באותה מידה בזמן שהמתח שלהם מנוטר. הטכניקה זולה יחסית אך רגישה מספיק כדי לזהות שינויים בתכונות ויסקולסטיות של סיבים זונולריים בעכברים חסרי חלבונים זונולריים ספציפיים או עם הזדקנות. למרות שהשיטה המוצגת כאן מיועדת בעיקר לחקר התפתחות העין ומחלות, היא יכולה לשמש גם כמודל ניסיוני לחקר שאלות רחבות יותר לגבי התכונות הצמיגיות של ECM אלסטיים ותפקידם של גורמים חיצוניים כגון ריכוז יוני, טמפרטורה ואינטראקציות עם מולקולות איתות.

טכניקת המשיכה למעלה המתוארת כאן מספקת גישה פשוטה לקביעת תכונות ויסקולאסטיות של סיבים זונולריים בעכברים. בקצרה, עין העכבר נשמרת לראשונה על ידי הזרקת קבוע בלחץ תוך עיני פיזיולוגי. גישה זו שומרת על האינפלציה הטבעית של העין ושומרת על הסיבים כראוי מראש מתוחים (קיבעון נחשב מקובל לאחר ניסויים ר?...

Watch this Scientific Journal Video about Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers at JoVE.com

Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers

הפרוטוקול מתאר שיטה לחקר צמיגות מטריצה חוץ-תאית ותלותה בהרכב החלבון או בגורמים סביבתיים. מערכת המטריצה הממוקדת היא זונולה של העכבר. הביצועים של השיטה מודגמים על ידי השוואת ההתנהגות הצמיגית של סיבים זונולריים מסוג בר עם אלה חסרים מיקרופיבריל הקשורים גליקופרוטאין-1.

הכנה ביולוגית וטכניקה מכנית לקביעת תכונות ויסקולסטיות של סיבים זונולריים

Elasticity is essential to the function of tissues such as blood vessels, muscles, and lungs. This property is derived mostly from the extracellular ...

החשיבות של השיטה שלנו טמונה ביכולתה לענות על השאלה, מה הם המאפיינים viscoelastic של סיבים זונולריים, הסיבים להשעות את העדשה בתוך העין? היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שהיא יכולה לכמת את המאפיינים הוויסקואלסטיים של הסיבים הזונולריים הקטנים והעדינים מעכברים עם וללא שינויי גנים ממוקדים. מוטציות בגנים קידוד חלבונים מיקרופיבריים בבסיס מספר תנאים סינדרומיים תורשתיים.באמצעות הטכניקה שלנו, אנו יכולים לחקור כיצד מוטציות ספציפיות משנות את התכונות הביומכניות של המיקרופיברילים. כדי להתחיל, לאחר המתת חסד העכבר, להסיר את העיניים באמצעות מלקחיים עדינים. הכנס את קצה מחט הקיבעון דרך דופן העין ומקם אותה במרכז ההומור הזגוגי, תוך הקפדה שלא לפגוע בעדשה.להעביר בזהירות את העין המשופדת לצינור מלא 4% paraformaldehyde ו פוספט חוצץ מלוחים. פתח את השסתום המחבר את המחט למאגר מקובע הממוקם 25 ס"מ מעל המדגם אשר שומר על לחץ חיובי שווה ערך ל 15 עד 20 מילימטרים של כספית בתוך העין במהלך תקופת הקיבעון ולהשאיר את המדגם לתקן בן לילה. למחרת, להסיר את מחט הקיבעון ולשטוף את העין במשך 10 דקות מלוחים חוצצים פוספט.על ידי שימוש במספריים כירורגיים עיניים ומיקרוסקופ סטריאו, לעשות חתך בעובי מלא בדופן העין ליד ראש עצב הראייה. להרחיב את החתך קדימה לכיוון קו המשווה ולאחר מכן סביב היקף קו המשווה של העין תוך חסכון בזהירות את תהליכי ciliary עדינים וסיבים זונולריים הקשורים. חשוף את המשטח האחורי של העדשה על ידי הסרת החלק האחורי של כדור הארץ.מוציאים את העין המנותחת מתמיסת החיץ באמצעות מלקחיים ומניחים אותה על מגבון משימה יבש כשהקרנית פונה כלפי מטה. גרור בעדינות את הקרנית מעל פני השטח של המגבון כדי לייבש אותו. החל טיפה של דבק מיידי לתחתית צלחת פטרי 50 מילימטר ולתקן את הפלטפורמה אליו.מניחים את המנה על צלחת הבמה של מיקרוסקופ סטריאו, כך הבאר עם הדבק הוא בתצוגה. כדי להתאים את העין בבארות הפלטפורמה של צלחת פטרי, להוסיף שלושה microliters של דבק מיידי. בזהירות למקם אותו לתוך הבאר במהירות להתאים, כך האחורי של העדשה פונה כלפי מעלה.ייבשו את הצד החשוף של העדשה על ידי הכתמה עדינה עם הפינה של ניגוב יבש. למדידת התגובה הוויסקולאסטית הזונורית, הפעל את קנה המידה, הנח את צלחת הפטרי בקנה המידה, ולאחר מכן התחל את תוכנית רישום קנה המידה ואת תוכנת המצלמה. הפעל את בקר הסרוומוטור.הפעל את יישום הבקר במחשב והגדר את פרמטרי התנועה עם מרווחים של 50 מיקרומטר. צור כיפוף של 90 מעלות במוט נימי. החלק את הנימים המכופפים לתוך מחזיק הבדיקה הנימית והידק את הברגים המאבטחים.לקצה הנימי, מוסיפים חרוז קטן של דבק ריפוי UV. הזז את קצה הבדיקה הנימית באמצעות ההתאמות הידניות על המניפולטור והנח אותו ישירות מעל החלק העליון של העדשה. באמצעות בדיקה חזותית קדמית ותצוגה צדדית באמצעות מצלמת מיקרוסקופ, בדוק כי החלק התחתון של דבק UV מופיע מרוכז מעל החלק העליון של העדשה.תוך כדי התבוננות במצלמה, הנמיכו את קצה הבדיקה עד שדבק ה- UV ייצור קשר עם העדשה ויכסה 1/3 עד 1/2 מהמשטח העליון שלה. לרפא את הדבק באמצעות מקור אור UV כיווני כמעט גלוי של 380 עד 400 אורך גל ננומטר ועוצמה של כמילי-ואט אחד. מוסיפים את תמיסת PBS לצלחת הפטרי עד שהעין מכוסה לעומק של שני מילימטרים לפחות.מניחים עדשה גלילית מול המיקרוסקופ ובאופן קרוב לצלחת פטרי מבלי לגעת בה. בו-זמנית, הפעל את הרישום בתוכנית שעון עצר. צלם תמונה של העין והגשוש באמצעות המצלמה.לאחר 60 שניות, התחל תזוזה של 50 מיקרומטר. חזור על הפעולה כל 60 שניות עד להשלמת הניסוי כפי שצוין על ידי שבירת כל הסיבים הזונוריים. שמור את נתוני רישום קנה המידה עם השלמת הפעלה וייצא אותם לתבנית גיליון אלקטרוני תואמת.כמו כן, שמור את תמונות העדשה שהושגו במהלך הריצה. יבא את הנתונים לגיליון אלקטרוני. באמצעות קריאת קנה המידה הראשונה והאחרונה, אינטרפולציה של הסחף בקריאה ברקע לאורך זמן עקב אידוי, ולאחר מכן הפחת את הרקע האינטרפולציה מהקריאה בכל נקודת זמן.לאחר ביצוע הבדיקה ותיקון לאידוי, הגרף של הנתונים הצמיגיים הפוך. הגודל של הכוחות המיידיים והרגועים גדל עם כל צעד עד כ 1,000 שניות, ואז יורד כמו הסיבים הזונולריים מתחילים לשבור עד נקודת הזמן 1, 500 השניה הוא הגיע כאשר כל הסיבים שבורים. להדגמה זו, התגובה הצמיגית עבור סוג פראי ו MAGP-1 עכברים לקויים הושוו גם.בזמן הראשוני של אפס עד 600 שניות, הגרפים דומים זה לזה דבר המצביע על כך שהתכונות הצמיגיות של הסיבים הזונולריים לא שונו באופן משמעותי. עם זאת, בעכבר נוקאאוט MAGP-1, הסיבים לשבור בטרם עת. כוחות שבירת סיבים זונולריים הושגו בשיטת משיכה למעלה עבור MAGP-1 לעומת עכברים מסוג בר בשלבים בני חודש ושנה.התוצאות הצביעו על כך שחוזק הסיבים עולה עם הגיל לעכברים מסוג בר. כל מגע מקרי עם צלחת פטרי במהלך שלבים אלה עלול לגרום לקיר העין לזוז ביחס לעדשת העין, מה שעלול לפגוע בסיבים הזונולריים. בדיקה מושכת זו מסייעת בזיהוי חלבונים התורמים לחוזק המתיחה של מיקרופיברילים.נשתמש במידע זה כדי לבנות מודלים מציאותיים יותר של פנים הסיבים הזונולריים.

Research

JoVE Journal

Medicine

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

מיו מכני ניתוח בשרירי השלד מבודדת

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy

פרוטוקולים להערכת אינטראקציות גל רדיו עם זהב חלקיקים ומערכות ביולוגיות ללא פולשני היפרתרמיה טיפול בסרטן

Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

גלאוקומה וישכנע נוהל בבית<em&gt; In vivo</em&gt; מודל עכברוש ואת כל הר רשתית הכנה

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Proximal Cadaveric Femur Preparation for Fracture Strength Testing and Quantitative CT-based Finite Element Analysis

הכנת עצם הירך הפרוקסימלי cadaveric לשבר חוזק בדיקה כמותית CT מבוססי ניתוח אלמנטים סופיים

Cadaveric fracture testing is routinely used to understand factors that affect proximal femur strength.  Because ex vivo biological tissues are prone to ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

בשנת Vivo הערכה של תכונות מכניות ו Viscoelastic של לשון עכברוש

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

הערכה של מאפייני תאי אנדותל באמצעות תרבית תאים 3D ושאינם-anticoagulated דם קרישה ואנטי דלקתיות

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Mechanical Ventilation Boot Camp Curriculum

אוורור מכני Boot Camp הלימודים

Medical management of mechanically ventilated patients is challenging to novice providers. Incorrect management of this population may lead to increased ...

Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

Micronization מכני של Lipoaspirates לטיפול רגנרטיבית

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

Determining and Controlling External Power Output During Regular Handrim Wheelchair Propulsion

קביעת ושליטה בתפוקת הכוח החיצוני במהלך ההנעה הסדירה של כיסא גלגלים

The use of a manual wheelchair is critical to 1% of the world&#39;s population. Human powered wheeled mobility research has considerably matured, which ...

A Probing Device for Quantitatively Measuring the Mechanical Properties of Soft Tissues during Arthroscopy

מכשיר בודק למדידת תכונות מכניות של רקמות רכות במהלך ארתרוסקופיה

Probing in arthroscopic surgery is performed by pulling or pushing the soft tissue, which provides feedback for understanding the condition of the soft ...