Name: biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers
Uploaded: 2021-12-16T13:30:00
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Questo lavoro è stato supportato da NIH R01 EY029130 (S.B.) e P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 e Dalla Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), dalla Marfan Foundation, e da una sovvenzione illimitata al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive della Washington University da Research to Prevent Blindness. J.R. ha anche ricevuto una sovvenzione dall'Università di Scienze della Salute e Farmacia a sostegno di questo progetto.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per gli studi sugli animali della Washington University e hanno aderito alla Dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva.
1. Fabbricazione di parti specializzate e costruzione di apparecchi
<ol><li>Fabbricazione di parti specializzate<ol>
<li>Fabbricazione di sonde. Tenere un capillare di vetro ad angolo, come mostrato nel pannello di sinistra della Figu...

<ol>
	<li>Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+glass:+structural+determinants+of+eye+lens+transparency.">Biological glass: structural determinants of eye lens transparency.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinn's+zonule.">Zinn's zonule.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).</li><li>Dureau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+zonular+diseases.">Pathophysiology of zonular diseases.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent-transforming+growth+factor+beta-binding+protein-2+(LTBP-2)+is+required+for+longevity+but+not+for+development+of+zonular+fibers.">Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers.</a> Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).</li><li>Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fibers,+reticular+fibers+and+elastic+fibers.+A+comprehensive+understanding+from+a+morphological+viewpoint.">Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint.</a> Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+preserving+and+visualizing+the+three-dimensional+structure+of+the+mouse+zonule.">A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule.</a> Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).</li><li>Todorovic, V., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTBPs,+more+than+just+an+escort+service.">LTBPs, more than just an escort service.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).</li><li>Mecham, R. P., Gibson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microfibril-associated+glycoproteins+(MAGPs)+and+the+microfibrillar+niche.">The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche.</a> Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).</li><li>Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eye+development+is+characterized+by+coordinated+expression+of+fibrillin+isoforms.">Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+TGF-&#946;+binding+protein-2+is+essential+for+the+development+of+ciliary+zonule+microfibrils.">Latent TGF-&#946; binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).</li><li>De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+bovine+and+human+ciliary+zonule.">Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).</li><li>Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+supramolecular+organization+of+fibrillin-rich+microfibrils+determines+the+mechanical+properties+of+bovine+zonular+filaments.">The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments.</a> Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).</li><li>Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+mechanical+behaviour+and+estimation+of+the+elastic+properties+of+porcine+zonular+fibres.">Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres.</a> Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).</li><li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+body+in+accommodation.">The ciliary body in accommodation.</a> Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).</li><li>Michael, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+human+lens+zonules+as+a+function+of+age+in+presbyopes.">Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).</li><li>van Alphen, G. W., Graebel, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+tissues+involved+in+accommodation.">Elasticity of tissues involved in accommodation.</a> Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).</li><li>Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+micromechanics+of+elastic+tissue.">The structure and micromechanics of elastic tissue.</a> Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).</li><li>Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+fibrillin-1+in+the+mouse+eye+results+in+ectopia+lentis+and+other+ocular+phenotypes+associated+with+Marfan+syndrome.">Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).</li><li>Weinbaum, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+microfibril-associated+glycoprotein-1+leads+to+complex+phenotypes+in+multiple+organ+systems.">Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).</li><li>Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FBN1+gene+mutations+in+patients+with+ectopia+lentis+and+marfanoid+habitus.">Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).</li></ol>

La zonula è un insolito sistema ECM in cui le fibre sono disposte simmetricamente e possono essere manipolate in modo identico spostando la lente dell'occhio lungo l'asse ottico. Lo spazio può anche essere facilmente accessibile senza interruzioni cellulari, consentendo alle fibre di essere studiate in un ambiente vicino al loro stato nativo. La tecnica pull-up sfrutta questa presentazione ECM per manipolare le fibre delicate dei topi, un sistema geneticamente trattabile, e quantificare con precisione le loro propriet?...

L'occhio di un vertebrato contiene una lente ottica vivente che aiuta a mettere a fuoco le immagini sulla retina1. La lente è sospesa sull'asse ottico da un sistema di fibre delicate e orientate radialmente, come illustrato nella Figura 1A. Ad un'estremità, le fibre si attaccano all'equatore della lente e, all'altra, alla superficie del corpo ciliare. Le loro lunghezze coprono distanze che vanno da 150 μm nei topi a 1 mm negli esseri umani. Collettivamente, queste fibre sono conosciute come la zonula di Zinn2, la zonula ciliare o semplicemente la zonula. Traumi oculari, malattie e alcune malattie genetiche possono influenzare l'integrità delle fibre zonulari3, con conseguente eventuale fallimento e conseguente perdita della vista. Nei topi, le fibre hanno un nucleo composto principalmente dalla proteina fibrillina-2, circondata da un mantello ricco di fibrillina-14. Sebbene le fibre zonulari siano uniche per l'occhio, hanno molte somiglianze con le fibre ECM a base di elastina che si trovano altrove nel corpo. Questi ultimi sono coperti da un mantello fibrillin-15 e hanno dimensioni simili alle fibre zonulari6. Altre proteine, come le proteine leganti β che trasformano il latente e la glicoproteina-1 associata alle microfibrille (MAGP-1), si trovano in associazione con entrambi i tipi di fibre7,8,9,10,11. Il modulo elastico delle fibre zonulari è nell'intervallo di 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, paragonabile a quello delle fibre a base di elastina (0,3-1,2 MPa)17. Queste somiglianze architettoniche e meccaniche ci portano a credere che qualsiasi intuizione sui ruoli delle proteine associate agli zonuli possa aiutare a chiarire i loro ruoli in altre fibre elastiche ECM.
Lo scopo principale dello sviluppo del metodo qui descritto è quello di ottenere informazioni sul ruolo di specifiche proteine zonulari nella progressione della malattia ereditaria degli occhi. L'approccio generale è quello di confrontare le proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari nei topi wild-type con quelle dei topi portatori di mutazioni mirate nei geni che codificano per le proteine zonulari. Mentre diversi metodi sono stati utilizzati in precedenza per misurare le proprietà elasto-meccaniche delle fibre zonulari, tutti sono stati progettati per gli occhi di animali molto più grandi12,13,14,15,16. In quanto tali modelli non sono geneticamente trattabili; abbiamo cercato di sviluppare un metodo sperimentale che fosse più adatto agli occhi piccoli e delicati dei topi.
Il metodo che abbiamo sviluppato per valutare la viscoelasticità delle fibre zonulari di topo è una tecnica a cui ci riferiamo come pull-up assay4,18, che è riassunto visivamente nella Figura 1. Di seguito viene fornita una descrizione dettagliata del metodo pull-up e l'analisi dei risultati. Iniziamo descrivendo la costruzione dell'apparato, comprese le parti tridimensionali (stampate in 3D) utilizzate nel progetto. Successivamente, descriviamo in dettaglio il protocollo utilizzato per ottenere e preparare gli occhi per l'esperimento. Infine, forniamo istruzioni dettagliate su come ottenere dati per la determinazione delle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari. Nella sezione Risultati rappresentativi, condividiamo dati precedentemente non pubblicati ottenuti con il nostro metodo sulle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari di topi privi di MAGP-119 e un set di controllo ottenuto da animali selvatici di pari età. Infine, concludiamo con osservazioni generali sui vantaggi e i limiti del metodo e suggerimenti per potenziali esperimenti che possano chiarire come i fattori ambientali e biochimici influenzano le proprietà viscoelastiche delle fibre ECM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4-20 hex screws 3/4 inch long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4-20 nut</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D SLA printer</td>
			<td>Anycubic</td>
			<td>Photon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 screws 3/8 inch long, 2</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B120-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (super) glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale accurate to 0.01 g</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>OHAUS Scout 220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas cigarette lighter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inspection/dissection microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: SM-4NTP</td>
			<td>Working distance ~ 15 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator, Economy 4-axis</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Kite-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micrometer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Z812B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LK1431L1</td>
			<td>-75 mm focal length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 50 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder, 3 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post, 4 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale logging software</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>LoggePro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KDC101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller software</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted base, 1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted bases, 2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand for micromanipular</td>
			<td>WPI</td>
			<td>M-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-camera for microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: MD500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV activated glue with UV source</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers

L'elasticità è essenziale per la funzione di tessuti come vasi sanguigni, muscoli e polmoni. Questa proprietà deriva principalmente dalla matrice extracellulare (ECM), la rete proteica che lega insieme cellule e tessuti. Come le proprietà elastiche di una rete ECM si relazionano alla sua composizione, e se le proprietà di rilassamento dell'ECM svolgono un ruolo fisiologico, sono domande che devono ancora essere completamente affrontate. Parte della sfida risiede nella complessa architettura della maggior parte dei sistemi ECM e nella difficoltà di isolare i componenti ECM senza comprometterne la struttura. Un'eccezione è la zonule, un sistema ECM che si trova nell'occhio dei vertebrati. La zonula comprende fibre da centinaia a migliaia di micrometri di lunghezza che coprono lo spazio privo di cellule tra la lente e la parete oculare. In questo rapporto, descriviamo una tecnica meccanica che sfrutta la struttura altamente organizzata della zonula per quantificare le sue proprietà viscoelastiche e per determinare il contributo dei singoli componenti proteici. Il metodo prevede la dissezione di un occhio fisso per esporre la lente e la zonula e impiega una tecnica di pull-up che allunga le fibre zonulari allo stesso modo mentre la loro tensione viene monitorata. La tecnica è relativamente economica ma abbastanza sensibile da rilevare alterazioni nelle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari in topi privi di proteine zonulari specifiche o con l'invecchiamento. Sebbene il metodo qui presentato sia progettato principalmente per studiare lo sviluppo e la malattia oculare, potrebbe anche servire come modello sperimentale per esplorare domande più ampie riguardanti le proprietà viscoelastiche degli ECM elastici e il ruolo di fattori esterni come la concentrazione ionica, la temperatura e le interazioni con le molecole di segnalazione.

La tecnica di pull-up qui descritta fornisce un approccio semplice per determinare le proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari nei topi. In breve, l'occhio del topo viene prima preservato mediante iniezione di un fissativo alla pressione intraoculare fisiologica. Questo approccio mantiene l'inflazione naturale dell'occhio e mantiene le fibre correttamente pretensionate (la fissazione è stata ritenuta accettabile dopo che esperimenti preliminari hanno dimostrato che non alterava significativamente l'elasticità o l...

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Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers

Il protocollo descrive un metodo per lo studio della viscoelasticità della matrice extracellulare e della sua dipendenza dalla composizione proteica o da fattori ambientali. Il sistema di matrice bersaglio è la zonula del topo. Le prestazioni del metodo sono dimostrate confrontando il comportamento viscoelastico delle fibre zonulari wild-type con quelle prive di glicoproteina-1 associata alle microfibrille.

Preparazione biologica e tecnica meccanica per la determinazione delle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari

Elasticity is essential to the function of tissues such as blood vessels, muscles, and lungs. This property is derived mostly from the extracellular ...

L'importanza del nostro metodo sta nella sua capacità di rispondere alla domanda, quali sono le proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari, le fibre che sospendono la lente all'interno dell'occhio? Il vantaggio principale della nostra tecnica è che può quantificare le proprietà viscoelastiche delle piccole e delicate fibre zonulari di topi con e senza modificazioni geniche mirate. Le mutazioni nei geni che codificano per le proteine delle microfibrille sono alla base di diverse condizioni sindromiche ereditarie.Utilizzando la nostra tecnica, possiamo studiare come mutazioni specifiche alterano le proprietà biomeccaniche delle microfibrille. Per iniziare, dopo l'eutanasia del mouse, rimuovere gli occhi usando una pinza fine. Inserire la punta di un ago di fissaggio attraverso la parete dell'occhio e posizionarla al centro dell'umore vitreo, facendo attenzione a non danneggiare la lente.Trasferire con attenzione l'occhio impalato in un tubo riempito con 4% di paraformaldeide e soluzione salina tamponata con fosfato. Aprire la valvola che collega l'ago a un serbatoio fissato situato a 25 centimetri sopra il campione che mantiene una pressione positiva equivalente a 15-20 millimetri di mercurio all'interno dell'occhio durante il periodo di fissazione e lasciare il campione da fissare durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere l'ago di fissazione e lavare l'occhio per 10 minuti in soluzione salina tamponata con fosfato.Impiegando forbici chirurgiche oftalmiche e uno stereomicroscopio, eseguire un'incisione a tutto spessore nella parete dell'occhio vicino alla testa del nervo ottico. Estendere il taglio in avanti verso l'equatore e poi intorno alla circonferenza equatoriale dell'occhio risparmiando attentamente i delicati processi ciliari e le fibre zonulari associate. Esporre la superficie posteriore della lente rimuovendo il retro del globo.Rimuovere l'occhio sezionato dalla soluzione tampone usando una pinza e posizionarlo su una salvietta asciutta con la cornea rivolta verso il basso. Trascinare delicatamente la cornea sulla superficie della salvietta per asciugarla. Applicare una goccia di colla istantanea sul fondo di una capsula di Petri da 50 millimetri e fissare la piattaforma ad essa.Posizionare il piatto sulla piastra del palco dello stereomicroscopio in modo che il pozzo con la colla sia in vista. Per accogliere l'occhio nei pozzetti della piattaforma della capsula di Petri, aggiungere tre microlitri di colla istantanea. Posizionalo con attenzione nel pozzetto e regolalo rapidamente in modo che la parte posteriore dell'obiettivo sia rivolta verso l'alto.Asciugare il lato esposto della lente tamponando delicatamente con l'angolo di una salvietta asciutta. Per misurare la risposta viscoelastica zonulare, accendere la bilancia, posizionare la capsula di Petri sulla bilancia, quindi avviare il programma di registrazione della bilancia e il software della fotocamera. Accendere il controller del servomotore.Avviare l'applicazione controller sul computer e impostare i parametri di movimento con incrementi di 50 micrometri. Create una piegatura di 90 gradi in un'asta capillare. Far scivolare il capillare piegato nel portasonda capillare e stringere le viti di fissaggio.Alla punta capillare, aggiungere una piccola perla di colla per polimerizzazione UV. Spostare la punta della sonda capillare utilizzando le regolazioni manuali sul manipolatore e posizionarla direttamente sopra la parte superiore dell'obiettivo. Attraverso l'ispezione visiva frontale e la vista laterale utilizzando una telecamera al microscopio, esaminare che la parte inferiore della colla UV appaia centrata sulla parte superiore dell'obiettivo.Mentre si guarda attraverso la fotocamera, abbassare la punta della sonda fino a quando la colla UV non entra in contatto con l'obiettivo e copre da 1/3 a 1/2 della sua superficie superiore. Polimerizzare la colla utilizzando una sorgente di luce UV direzionale quasi visibile di lunghezza d'onda da 380 a 400 nanometri e un'intensità di circa un milliwatt. Aggiungere la soluzione PBS alla capsula di Petri fino a coprire l'occhio ad una profondità di almeno due millimetri.Posizionare una lente cilindrica davanti al microscopio e in modo vicino alla capsula di Petri senza toccarla. Allo stesso tempo, avviare la registrazione in un programma timer. Scatta una foto dell'occhio e della sonda usando la fotocamera.Dopo 60 secondi, iniziare uno spostamento di 50 micrometri. Ripeti ogni 60 secondi fino al completamento dell'esperimento come indicato dalla rottura di tutte le fibre zonulari. Salva i dati di registrazione della scala al termine di un'esecuzione ed esportali in un formato di foglio di calcolo compatibile.Inoltre, salvare le immagini dell'obiettivo ottenute durante la corsa. Importare i dati in un foglio di calcolo. Usando la prima e l'ultima lettura in scala, interpolare la deriva nella lettura di fondo nel tempo a causa dell'evaporazione, quindi sottrarre lo sfondo interpolato dalla lettura in ogni punto temporale.Dopo aver eseguito il test e la correzione per l'evaporazione, il grafico dei dati viscoelastici viene invertito. L'entità delle forze istantanee e rilassate aumenta ad ogni passo fino a circa 1.000 secondi, quindi diminuisce quando le fibre zonulari iniziano a rompersi fino a raggiungere il punto temporale di 1.500 secondi quando tutte le fibre sono rotte. Per questa dimostrazione, è stata confrontata anche la risposta viscoelastica per topi wild type e con deficit di MAGP-1.Al tempo iniziale da zero a 600 secondi, i grafici si assomigliano suggerendo che le proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari non sono state significativamente alterate. Tuttavia, nel topo knockout MAGP-1, le fibre si rompono prematuramente. Le forze di rottura delle fibre zonulari sono state ottenute con il metodo pull-up per MAGP-1 rispetto a topi selvatici a un mese e un anno di vita.I risultati hanno indicato che la forza delle fibre aumenta con l'età per i topi selvatici. Qualsiasi contatto accidentale con la capsula di Petri durante questi passaggi può causare lo spostamento della parete oculare rispetto alla lente dell'occhio, danneggiando potenzialmente le fibre zonulari. Questo test di pull-up aiuta a identificare le proteine che contribuiscono alla resistenza alla trazione delle microfibrille.Useremo queste informazioni per costruire modelli più realistici dell'interno delle fibre zonulari.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Ricerca

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A Probing Device for Quantitatively Measuring the Mechanical Properties of Soft Tissues during Arthroscopy

Un dispositivo di sondaggio per la misurazione quantitativa delle proprietà meccaniche dei tessuti molli durante l'artroscopia

Probing in arthroscopic surgery is performed by pulling or pushing the soft tissue, which provides feedback for understanding the condition of the soft ...