Name: biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers
Uploaded: 2021-12-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 EY029130 (S.B.) og P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 og Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), Marfan Foundation, og et ubegrenset tilskudd til Department of Ophthalmology and Visual Sciences ved Washington University fra J.R. fikk også stipend fra University of Health Sciences and Pharmacy til støtte for dette prosjektet.

Alle dyreforsøk ble godkjent av Washington University Animal Studies Committee og fulgte ARVO-erklæringen for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning.
1. Fabrikasjon av spesialiserte deler og bygging av apparater
<ol><li>Fabrikasjon av spesialiserte deler<ol>
<li>Sonde fabrikasjon. Hold en glasskapillær i en vinkel som vist på venstre panel i figur 2A. Plasser en flamme fra en sigarettenner ca. 2 cm fra den ene enden og hold den der til ...

<ol>
	<li>Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+glass:+structural+determinants+of+eye+lens+transparency.">Biological glass: structural determinants of eye lens transparency.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinn's+zonule.">Zinn's zonule.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).</li><li>Dureau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+zonular+diseases.">Pathophysiology of zonular diseases.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent-transforming+growth+factor+beta-binding+protein-2+(LTBP-2)+is+required+for+longevity+but+not+for+development+of+zonular+fibers.">Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers.</a> Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).</li><li>Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fibers,+reticular+fibers+and+elastic+fibers.+A+comprehensive+understanding+from+a+morphological+viewpoint.">Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint.</a> Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+preserving+and+visualizing+the+three-dimensional+structure+of+the+mouse+zonule.">A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule.</a> Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).</li><li>Todorovic, V., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTBPs,+more+than+just+an+escort+service.">LTBPs, more than just an escort service.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).</li><li>Mecham, R. P., Gibson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microfibril-associated+glycoproteins+(MAGPs)+and+the+microfibrillar+niche.">The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche.</a> Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).</li><li>Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eye+development+is+characterized+by+coordinated+expression+of+fibrillin+isoforms.">Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+TGF-&#946;+binding+protein-2+is+essential+for+the+development+of+ciliary+zonule+microfibrils.">Latent TGF-&#946; binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).</li><li>De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+bovine+and+human+ciliary+zonule.">Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).</li><li>Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+supramolecular+organization+of+fibrillin-rich+microfibrils+determines+the+mechanical+properties+of+bovine+zonular+filaments.">The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments.</a> Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).</li><li>Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+mechanical+behaviour+and+estimation+of+the+elastic+properties+of+porcine+zonular+fibres.">Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres.</a> Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).</li><li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+body+in+accommodation.">The ciliary body in accommodation.</a> Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).</li><li>Michael, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+human+lens+zonules+as+a+function+of+age+in+presbyopes.">Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).</li><li>van Alphen, G. W., Graebel, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+tissues+involved+in+accommodation.">Elasticity of tissues involved in accommodation.</a> Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).</li><li>Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+micromechanics+of+elastic+tissue.">The structure and micromechanics of elastic tissue.</a> Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).</li><li>Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+fibrillin-1+in+the+mouse+eye+results+in+ectopia+lentis+and+other+ocular+phenotypes+associated+with+Marfan+syndrome.">Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).</li><li>Weinbaum, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+microfibril-associated+glycoprotein-1+leads+to+complex+phenotypes+in+multiple+organ+systems.">Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).</li><li>Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FBN1+gene+mutations+in+patients+with+ectopia+lentis+and+marfanoid+habitus.">Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).</li></ol>

Zonule er et uvanlig ECM-system der fibrene er ordnet symmetrisk og kan manipuleres identisk ved å fortrenge øyelinsen langs den optiske aksen. Plassen kan også lett nås uten cellulær forstyrrelse, slik at fibrene kan studeres i et miljø nær sin opprinnelige tilstand. Pull-up-teknikken drar nytte av denne ECM-presentasjonen for å manipulere de delikate fibrene fra mus, et genetisk gjennomførbart system og nøyaktig kvantifisere deres mekaniske egenskaper. Dette har gjort det mulig for oss å undersøke bidraget ...

Øyet til en virveldyr inneholder en levende optisk linse som hjelper til med å fokusere bilder på netthinnen1. Linsen er suspendert på den optiske aksen av et system med delikate, radialorienterte fibre, som illustrert i figur 1A. I den ene enden festes fibrene til linseekvator og i den andre til overflaten av ciliary kroppen. Lengdene spenner over avstander fra 150 μm hos mus til 1 mm hos mennesker. Samlet er disse fibrene kjent som zonule av Zinn2, ciliary zonule, eller bare zonule. Okulære traumer, sykdom og visse genetiske lidelser kan påvirke integriteten til zonulære fibre3, noe som resulterer i deres eventuelle svikt og tilhørende tap av syn. Hos mus har fibrene en kjerne som hovedsakelig består av proteinfibrillin-2, omgitt av en mantel rik på fibrillin-14. Selv om zonulære fibre er unike for øyet, har de mange likheter med elastinbaserte ECM-fibre som finnes andre steder i kroppen. Sistnevnte er dekket av en fibrillin-1 mantel5 og har lignende dimensjoner som zonulære fibre6. Andre proteiner, som latent-transformerende vekstfaktor β-bindende proteiner (LTBPer) og mikrofibril-assosiert glykoprotein-1 (MAGP-1), finnes i forbindelse med begge typer fibre7,8,9,10,11. Den elastiske modulen av zonulære fibre er i området 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, sammenlignbar med elastinbaserte fibre (0,3-1,2 MPa)17. Disse arkitektoniske og mekaniske likhetene får oss til å tro at enhver innsikt i rollene til zonule-assosierte proteiner kan bidra til å belyse deres roller i andre ECM elastiske fibre.
Hovedformålet med å utvikle metoden beskrevet her er å få innsikt i rollen som spesifikke zonulære proteiner i utviklingen av arvelig øyesykdom. Den generelle tilnærmingen er å sammenligne de viskoelastiske egenskapene til zonulære fibre i ville mus med mus som bærer målrettede mutasjoner i gener som koder zonulære proteiner. Mens flere metoder tidligere har blitt brukt til å måle de elasto-mekaniske egenskapene til zonulære fibre, ble alle designet for øynene til mye større dyr12,13,14,15,16. Som slike modeller er ikke genetisk gjennomførbare; vi forsøkte å utvikle en eksperimentell metode som var bedre egnet til musens små og delikate øyne.
Metoden vi utviklet for å vurdere viskoelastisiteten til musezonulære fibre er en teknikk vi refererer til som pull-up-analysen4,18, som oppsummeres visuelt i figur 1. En detaljert beskrivelse av pull-up-metoden og analysen av resultatene er gitt nedenfor. Vi begynner med å beskrive konstruksjonen av apparatet, inkludert de tredimensjonale (3D)-trykte delene som brukes i prosjektet. Deretter detaljerer vi protokollen som brukes til å skaffe og forberede øynene til eksperimentet. Til slutt gir vi trinnvise instruksjoner om hvordan du får tak i data for bestemmelse av de viskoelastiske egenskapene til zonulære fibre. I delen Representative Results deler vi tidligere upubliserte data innhentet med vår metode på de viskoelastiske egenskapene til zonulære fibre fra mus som mangler MAGP-119, samt et kontrollsett hentet fra alderstilpassede villdyr. Til slutt konkluderer vi med generelle bemerkninger om fordelene og begrensningene ved metoden, og forslag til potensielle eksperimenter som kan belyse hvordan miljømessige og biokjemiske faktorer påvirker de viskoelastiske egenskapene til ECM-fibre.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4-20 hex screws 3/4 inch long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4-20 nut</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D SLA printer</td>
			<td>Anycubic</td>
			<td>Photon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 screws 3/8 inch long, 2</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B120-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (super) glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale accurate to 0.01 g</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>OHAUS Scout 220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas cigarette lighter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inspection/dissection microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: SM-4NTP</td>
			<td>Working distance ~ 15 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator, Economy 4-axis</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Kite-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micrometer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Z812B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LK1431L1</td>
			<td>-75 mm focal length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 50 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder, 3 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post, 4 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale logging software</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>LoggePro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KDC101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller software</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted base, 1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted bases, 2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand for micromanipular</td>
			<td>WPI</td>
			<td>M-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-camera for microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: MD500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV activated glue with UV source</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers

Elastisitet er avgjørende for funksjonen til vev som blodkar, muskler og lunger. Denne egenskapen er hovedsakelig avledet fra den ekstracellulære matrisen (ECM), proteinnettverket som binder celler og vev sammen. Hvordan de elastiske egenskapene til et ECM-nettverk forholder seg til sammensetningen, og om avslappingsegenskapene til ECM spiller en fysiologisk rolle, er spørsmål som ennå ikke er fullstendig adressert. En del av utfordringen ligger i den komplekse arkitekturen til de fleste ECM-systemer og vanskeligheten med å isolere ECM-komponenter uten å gå på kompromiss med strukturen. Et unntak er zonule, et ECM-system som finnes i øynene til vertebrater. Zonule består av fibre hundrevis til tusenvis av mikrometer i lengde som spenner over det cellefrie rommet mellom linsen og øyeveggen. I denne rapporten beskriver vi en mekanisk teknikk som utnytter den svært organiserte strukturen til zonule for å kvantifisere sine viskoelastiske egenskaper og for å bestemme bidraget av individuelle proteinkomponenter. Metoden innebærer disseksjon av et fast øye for å eksponere linsen og zonule og bruker en pull-up teknikk som strekker zonulære fibrene likt mens spenningen overvåkes. Teknikken er relativt billig, men likevel følsom nok til å oppdage endringer i viskoelastiske egenskaper til zonulære fibre hos mus som mangler spesifikke zonulære proteiner eller med aldring. Selv om metoden som presenteres her først og fremst er designet for å studere okulær utvikling og sykdom, kan den også fungere som en eksperimentell modell for å utforske bredere spørsmål om de viskoelastiske egenskapene til elastiske ECM-er og rollen til eksterne faktorer som ionisk konsentrasjon, temperatur og interaksjoner med signalmolekyler.

Pull-up teknikken beskrevet her gir en grei tilnærming for å bestemme viskoelastiske egenskaper av zonulære fibre hos mus. Kort sagt, museøyet blir først bevart ved injeksjon av et fikseringsmiddel ved fysiologisk intraokulært trykk. Denne tilnærmingen opprettholder øyets naturlige inflasjon og holder fibrene riktig forspentet (fiksering ble ansett som akseptabelt etter at foreløpige eksperimenter viste at det ikke endret elastisiteten eller styrken til fibrene betydelig). Baksiden av museøyet fjernes deretter ...

Watch this Scientific Journal Video about Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers at JoVE.com

Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers

Protokollen beskriver en metode for studiet av ekstracellulær matriseviskoelastisitet og dens avhengighet av proteinsammensetning eller miljøfaktorer. Matrisesystemet som er målrettet er musesonule. Utførelsen av metoden er demonstrert ved å sammenligne den viskoelastiske oppførselen til ville zonulære fibre med de som mangler mikrofibril-assosiert glykoprotein-1.

Biologisk forberedelse og mekanisk teknikk for å bestemme viskoelastiske egenskaper til zonulære fibre

Elasticity is essential to the function of tissues such as blood vessels, muscles, and lungs. This property is derived mostly from the extracellular ...

Betydningen av vår metode ligger i dens evne til å svare på spørsmålet, hva er de viskoelastiske egenskapene til zonulære fibre, fibrene som suspenderer linsen inne i øyet? Den største fordelen med teknikken vår er at den kan kvantifisere de viskoelastiske egenskapene til de små og delikate zonulære fibrene fra mus med og uten målrettede genmodifikasjoner. Mutasjoner i gener som koder mikrofibrilproteiner ligger til grunn for flere arvelige syndromiske tilstander.Ved hjelp av vår teknikk kan vi undersøke hvordan spesifikke mutasjoner endrer mikrofibrilenes biomekaniske egenskaper. For å begynne med, post-euthanizing musen, fjern øynene ved hjelp av fine tang. Sett spissen av en fikseringsnål gjennom øyets vegg og plasser den i midten av glasslegemet humor, pass på at du ikke skader linsen.Overfør forsiktig det impalerte øyet til et rør fylt med 4% paraformaldehyd og fosfatbufret saltvann. Åpne ventilen som forbinder nålen til et fiksert reservoar som ligger 25 centimeter over prøven, som opprettholder et positivt trykk tilsvarende 15 til 20 millimeter kvikksølv i øyet i fikseringsperioden og la prøven festes over natten. Neste dag, fjern fikseringsnålen og vask øyet i 10 minutter i fosfatbufret saltvann.Ved å bruke oftalmisk kirurgisk saks og et stereomikroskop, gjør du et full tykkelse snitt i øyets vegg nær synsnervehodet. Utvid kuttet fremover mot ekvator og deretter rundt ekvatoriale omkretsen av øyet mens du forsiktig sparer de delikate ciliary prosessene og tilhørende zonulære fibre. Utsett linsens bakre overflate ved å fjerne baksiden av kloden.Fjern det dissekerte øyet fra bufferløsningen ved hjelp av tang og legg det på en tørr oppgaveserviett med hornhinnen vendt nedover. Dra hornhinnen forsiktig over overflaten av tørken for å tørke den. Påfør en dråpe øyeblikkelig lim på bunnen av en 50 millimeter Petri-tallerken og fest plattformen til den.Plasser parabolen på stereomikroskopets sceneplate slik at brønnen med limet er i sikte. For å imøtekomme øyet i plattformbrønnene på Petri-parabolen, legg til tre mikroliter øyeblikkelig lim. Plasser den forsiktig i brønnen og juster den raskt slik at baksiden av objektivet vender oppover.Tørk den eksponerte siden av linsen ved å blåse forsiktig med hjørnet av en tørr klut. For å måle den zonulære viskoelastiske responsen, slå på skalaen, plasser Petri-parabolen på skalaen, og start deretter skalaloggingsprogrammet og kameraprogramvaren. Slå på servomotorkontrolleren.Start kontrollerprogrammet på datamaskinen og angi bevegelsesparameterne med 50 mikrometers intervaller. Lag 90 graders bøyning i en kapillærstang. Sett den bøyde kapillæren inn i kapillærsonden og stram festeskruene.Til kapillærspissen legger du til en liten perle av UV-herdelim. Beveg spissen av kapillærproben ved hjelp av de manuelle justeringene på manipulatoren og plasser den rett over toppen av objektivet. Gjennom visuell inspeksjon foran og sidevisningen ved hjelp av et mikroskopkamera, undersøk at den nederste delen av UV-limet vises sentrert over toppen av objektivet.Mens du ser gjennom kameraet, senk probespissen til UV-limet kommer i kontakt med linsen og dekker 1/3 til 1/2 av den øvre overflaten. Herd limet ved hjelp av en retningsmessig nesten synlig UV-lyskilde på 380 til 400 nanometerbølgelengde og en intensitet på omtrent en milliwatt. Tilsett PBS-løsning på Petri-parabolen til øyet er dekket til en dybde på minst to millimeter.Plasser en sylindrisk linse foran mikroskopet og på en nær måte til Petri-parabolen uten å berøre den. Samtidig starter du påloggingen i et tidtakerprogram. Ta et bilde av øyet og sonden ved hjelp av kameraet.Etter 60 sekunder begynner du en 50 mikrometer forskyvning. Gjenta hvert 60. Lagre skaleringsloggingsdataene når en kjøring er fullført, og eksporter dem til et kompatibelt regnearkformat.Lagre også objektivbildene som ble tatt under løpeturen. Importere dataene til et regneark. Bruk den første og siste skalaavlesningen til å interpolere driften i bakgrunnsavlesningen over tid på grunn av fordampning, og trekk deretter den interpolerte bakgrunnen fra avlesningen i hvert tidspunkt.Etter å ha utført analysen og korrigert for fordampning, inverteres grafen over viskoelastiske data. Størrelsen på de øyeblikkelige og avslappede kreftene øker med hvert trinn opp til ca 1000 sekunder, og faller deretter når zonulære fibre begynner å bryte til 1500 andre gangs punkt nås når alle fibrene er ødelagt. For denne demonstrasjonen ble den viskoelastiske responsen for vill type og MAGP-1 mangelfulle mus også sammenlignet.Ved første gang på null til 600 sekunder ligner grafene hverandre som antyder at de viskoelastiske egenskapene til de zonulære fibrene ikke ble vesentlig endret. Men i MAGP-1 knockout-musen bryter fibrene for tidlig. Zonular fiber bryte krefter ble oppnådd med pull-up metoden for MAGP-1 versus wild type mus på en måned og et år gamle stadier.Resultatene indikerte at styrken på fibrene øker med alderen for villtype mus. Enhver utilsiktet kontakt med Petri-parabolen under disse trinnene kan føre til at øyeveggen skifter i forhold til øyelinsen, noe som potensielt kan skade zonulære fibrene. Denne pull-up analysen bidrar til å identifisere proteiner som bidrar til strekkfastheten til mikrofibriler.Vi vil bruke denne informasjonen til å bygge mer realistiske modeller av interiøret i zonulære fibre.

Research

JoVE Journal

Medicine

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy

Protokoller for vurdering Radiofrekvens Interaksjoner med gull Nanopartikler og biologiske systemer for ikke-invasiv hypertermi Cancer Therapy

Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaukom-induserende prosedyre i en<em&gt; I Vivo</em&gt; Rat Model og Whole-mount Retina Forberedelse

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Proximal Cadaveric Femur Preparation for Fracture Strength Testing and Quantitative CT-based Finite Element Analysis

Proksimale avdød Femur Forberedelse til Fracture Styrke Testing og kvantitativ CT-basert Finite Element Analysis

Cadaveric fracture testing is routinely used to understand factors that affect proximal femur strength.  Because ex vivo biological tissues are prone to ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In vivo Evaluering av de mekaniske og viskoelastiske egenskapene til rotte tungen

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Vurdering av antikoagulerende og anti-inflammatorisk egenskaper av endotelceller 3D cellekultur og ikke-anticoagulated fullblod

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Mechanical Ventilation Boot Camp Curriculum

Mekanisk ventilasjon Boot Camp læreplanen

Medical management of mechanically ventilated patients is challenging to novice providers. Incorrect management of this population may lead to increased ...

Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

Mekanisk Micronization av Lipoaspirates for regenerativ Therapy

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

Determining and Controlling External Power Output During Regular Handrim Wheelchair Propulsion

Bestemme og kontrollere ekstern utgangseffekt under vanlig handrim rullestol fremdrift

The use of a manual wheelchair is critical to 1% of the world&#39;s population. Human powered wheeled mobility research has considerably matured, which ...

A Probing Device for Quantitatively Measuring the Mechanical Properties of Soft Tissues during Arthroscopy

En sonderingsenhet for kvantitativt måling av de mekaniske egenskapene til bløtvev under artroskopi

Probing in arthroscopic surgery is performed by pulling or pushing the soft tissue, which provides feedback for understanding the condition of the soft ...