Name: biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers
Uploaded: 2021-12-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo NIH R01 EY029130 (S.B.) e P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 e pela Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), a Fundação Marfan, e uma bolsa irrestrita ao Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais da Universidade de Washington de Pesquisa para Prevenir a Cegueira. J.R. também recebeu uma bolsa da Universidade de Ciências da Saúde e Farmácia em apoio a este projeto.

Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Estudos Animais da Universidade de Washington e aderiram à Declaração ARVO para o Uso de Animais em Pesquisa Oftalmômica e De Visão.
1. Fabricação de peças especializadas e construção de aparelhos
<ol><li>Fabricação de peças especializadas<ol>
<li>Fabricação da sonda. Segure um capilar de vidro em um ângulo como mostrado no painel esquerdo da Figura 2A. Coloque uma ...

<ol>
	<li>Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+glass:+structural+determinants+of+eye+lens+transparency.">Biological glass: structural determinants of eye lens transparency.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinn's+zonule.">Zinn's zonule.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).</li><li>Dureau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+zonular+diseases.">Pathophysiology of zonular diseases.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent-transforming+growth+factor+beta-binding+protein-2+(LTBP-2)+is+required+for+longevity+but+not+for+development+of+zonular+fibers.">Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers.</a> Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).</li><li>Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fibers,+reticular+fibers+and+elastic+fibers.+A+comprehensive+understanding+from+a+morphological+viewpoint.">Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint.</a> Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+preserving+and+visualizing+the+three-dimensional+structure+of+the+mouse+zonule.">A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule.</a> Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).</li><li>Todorovic, V., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTBPs,+more+than+just+an+escort+service.">LTBPs, more than just an escort service.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).</li><li>Mecham, R. P., Gibson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microfibril-associated+glycoproteins+(MAGPs)+and+the+microfibrillar+niche.">The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche.</a> Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).</li><li>Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eye+development+is+characterized+by+coordinated+expression+of+fibrillin+isoforms.">Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+TGF-&#946;+binding+protein-2+is+essential+for+the+development+of+ciliary+zonule+microfibrils.">Latent TGF-&#946; binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).</li><li>De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+bovine+and+human+ciliary+zonule.">Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).</li><li>Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+supramolecular+organization+of+fibrillin-rich+microfibrils+determines+the+mechanical+properties+of+bovine+zonular+filaments.">The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments.</a> Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).</li><li>Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+mechanical+behaviour+and+estimation+of+the+elastic+properties+of+porcine+zonular+fibres.">Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres.</a> Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).</li><li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+body+in+accommodation.">The ciliary body in accommodation.</a> Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).</li><li>Michael, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+human+lens+zonules+as+a+function+of+age+in+presbyopes.">Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).</li><li>van Alphen, G. W., Graebel, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+tissues+involved+in+accommodation.">Elasticity of tissues involved in accommodation.</a> Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).</li><li>Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+micromechanics+of+elastic+tissue.">The structure and micromechanics of elastic tissue.</a> Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).</li><li>Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+fibrillin-1+in+the+mouse+eye+results+in+ectopia+lentis+and+other+ocular+phenotypes+associated+with+Marfan+syndrome.">Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).</li><li>Weinbaum, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+microfibril-associated+glycoprotein-1+leads+to+complex+phenotypes+in+multiple+organ+systems.">Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).</li><li>Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FBN1+gene+mutations+in+patients+with+ectopia+lentis+and+marfanoid+habitus.">Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).</li></ol>

O zonule é um sistema ECM incomum onde as fibras são organizadas simetricamente e podem ser manipuladas de forma idêntica deslocando a lente ocular ao longo do eixo óptico. O espaço também pode ser facilmente acessado sem interrupção celular, permitindo que as fibras sejam estudadas em um ambiente próximo ao seu estado natal. A técnica de pull-up aproveita esta apresentação de ECM para manipular as fibras delicadas de camundongos, um sistema geneticamente tratável, e quantificar com precisão suas propriedad...

O olho de um vertebrado contém uma lente óptica viva que ajuda a focar imagens na retina1. A lente é suspensa no eixo óptico por um sistema de fibras delicadas e radialmente orientadas, conforme ilustrado na Figura 1A. Em uma extremidade, as fibras se prendem ao equador da lente e, na outra, à superfície do corpo ciliar. Seus comprimentos abrangem distâncias que variam de 150 μm em camundongos a 1 mm em humanos. Coletivamente, essas fibras são conhecidas como o zonule de Zinn2, o zonule ciliar, ou simplesmente o zonule. Traumas oculares, doenças e certos distúrbios genéticos podem afetar a integridade das fibras zonulares3, resultando em sua eventual falha e perda de visão. Em camundongos, as fibras possuem um núcleo composto principalmente pela fibrillina-2 proteica, cercada por um manto rico em fibrillin-14. Embora as fibraszonulares sejam únicas aos olhos, elas possuem muitas semelhanças com as fibras ECM baseadas em elastina encontradas em outros lugares do corpo. Estes últimos são cobertos por um manto de fibrillina-15 e têm dimensões semelhantes às fibraszonulares6. Outras proteínas, como o fator de crescimento transformador latente β proteínas de ligação (LTBPs) e a glicoproteína associada à microfibril-1 (MAGP-1), são encontradas em associação com ambos os tipos de fibras7,8,9,10,11. O módulo elástico das fibraszonulares está na faixa de 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, comparável ao das fibras à base de elastina (0,3-1,2 MPa)17. Essas semelhanças arquitetônicas e mecânicas nos levam a acreditar que qualquer visão sobre os papéis das proteínas associadas ao zonule pode ajudar a elucidar seus papéis em outras fibras elásticas ECM.
O principal objetivo do desenvolvimento do método descrito aqui é obter insights sobre o papel de proteínaszonulares específicas na progressão da doença ocular hereditária. A abordagem geral é comparar as propriedades viscoelásticas das fibraszonulares em camundongos do tipo selvagem com as de camundongos portadores de mutações direcionadas em genes que codificam proteínaszonulares. Embora vários métodos tenham sido utilizados anteriormente para medir as propriedades elasto-mecânicas das fibraszonulares, todos foram projetados para os olhos de animais muito maiores12,13,14,15,16. Como tais modelos não são geneticamente tratáveis; buscamos desenvolver um método experimental mais adequado aos pequenos e delicados olhos dos ratos.
O método que desenvolvemos para avaliar a viscoelasticidade das fibraszonulares do camundongo é uma técnica a que chamamos de ensaio de puxar para cima4,18, que é resumido visualmente na Figura 1. Uma descrição detalhada do método pull-up e a análise dos resultados são fornecidas abaixo. Começamos descrevendo a construção do aparelho, incluindo as peças tridimensionais (3D) impressas usadas no projeto. Em seguida, detalhamos o protocolo usado para a obtenção e preparação dos olhos para o experimento. Por fim, fornecemos instruções passo a passo sobre como obter dados para a determinação das propriedades viscoelásticas das fibras zonulares. Na seção Resultados Representativos, compartilhamos dados inéditos obtidos com nosso método sobre as propriedades viscoelásticas de fibras zonulares de camundongos sem MAGP-119, bem como um conjunto de controle obtido a partir de animais do tipo selvagem com correspondência etária. Por fim, concluímos com observações gerais sobre as vantagens e limitações do método, e sugestões de potenciais experimentos que possam elucidar como fatores ambientais e bioquímicos afetam as propriedades viscoelásticas das fibras ECM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4-20 hex screws 3/4 inch long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4-20 nut</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D SLA printer</td>
			<td>Anycubic</td>
			<td>Photon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 screws 3/8 inch long, 2</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B120-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (super) glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale accurate to 0.01 g</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>OHAUS Scout 220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas cigarette lighter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inspection/dissection microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: SM-4NTP</td>
			<td>Working distance ~ 15 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator, Economy 4-axis</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Kite-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micrometer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Z812B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LK1431L1</td>
			<td>-75 mm focal length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 50 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder, 3 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post, 4 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale logging software</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>LoggePro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KDC101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller software</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted base, 1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted bases, 2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand for micromanipular</td>
			<td>WPI</td>
			<td>M-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-camera for microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: MD500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV activated glue with UV source</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers

A elasticidade é essencial para a função de tecidos como vasos sanguíneos, músculos e pulmões. Esta propriedade é derivada principalmente da matriz extracelular (ECM), a malha proteica que une células e tecidos. Como as propriedades elásticas de uma rede ECM se relacionam com sua composição, e se as propriedades de relaxamento do ECM desempenham um papel fisiológico, são questões que ainda não foram totalmente abordadas. Parte do desafio está na arquitetura complexa da maioria dos sistemas ECM e na dificuldade em isolar componentes ECM sem comprometer sua estrutura. Uma exceção é o zonule, um sistema ECM encontrado no olho de vertebrados. O zonule compreende fibras de centenas a milhares de micrômetros de comprimento que abrangem o espaço livre de células entre a lente e a parede do olho. Neste relatório, descrevemos uma técnica mecânica que aproveita a estrutura altamente organizada do zonule para quantificar suas propriedades viscoelásticas e determinar a contribuição de componentes proteicos individuais. O método envolve dissecção de um olho fixo para expor a lente e o zonule e emprega uma técnica de puxar para cima que estica as fibras zonulares igualmente enquanto sua tensão é monitorada. A técnica é relativamente barata, mas sensível o suficiente para detectar alterações nas propriedades viscoelásticas de fibras zonulares em camundongos sem proteínas zonulares específicas ou com envelhecimento. Embora o método aqui apresentado seja projetado principalmente para estudar o desenvolvimento ocular e doenças, também poderia servir como um modelo experimental para explorar questões mais amplas sobre as propriedades viscoelásticas dos ECM elásticos e o papel de fatores externos como concentração iônica, temperatura e interações com moléculas de sinalização.

A técnica de pull-up descrita aqui fornece uma abordagem simples para determinar propriedades viscoelásticas de fibras zonulares em camundongos. Resumindo, o olho do rato é primeiro preservado pela injeção de um fixador na pressão intraocular fisiológica. Essa abordagem mantém a inflação natural do olho e mantém as fibras adequadamente pré-tensionadas (a fixação foi considerada aceitável após experimentos preliminares demonstrarem que não alterou significativamente a elasticidade ou força das fibras). A...

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Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers

O protocolo descreve um método para o estudo da viscoelasticidade da matriz extracelular e sua dependência da composição proteica ou fatores ambientais. O sistema de matriz alvo é o zonule do rato. O desempenho do método é demonstrado comparando o comportamento viscoelástico das fibraszonulares do tipo selvagem com as que não possuem glicoproteína associada a microfibril-1.

Preparação Biológica e Técnica Mecânica para Determinar Propriedades Viscoelásticas de Fibras Zonulares

Elasticity is essential to the function of tissues such as blood vessels, muscles, and lungs. This property is derived mostly from the extracellular ...

A importância do nosso método reside na sua capacidade de responder à pergunta, quais são as propriedades viscoelásticas das fibras zonulares, as fibras que suspendem a lente dentro do olho? A principal vantagem de nossa técnica é que ela pode quantificar as propriedades viscoelásticas das pequenas e delicadas fibraszonulares de camundongos com e sem modificações genéticas direcionadas. Mutações em genes que codificam proteínas microfibrilas estão por trás de várias condições sindêmicas herdadas.Usando nossa técnica, podemos investigar como mutações específicas alteram as propriedades biomecânicas dos microfibrils. Para começar, pós-eutanásia do mouse, remova os olhos usando fórceps finos. Insira a ponta de uma agulha de fixação através da parede do olho e posicione-a no centro do humor vítreo, tomando cuidado para não danificar a lente.Transfira cuidadosamente o olho empalado para um tubo cheio de 4% de paraformaldeído e salina tamponada de fosfato. Abra a válvula que conecta a agulha a um reservatório fixado localizado 25 centímetros acima da amostra, que mantém uma pressão positiva equivalente a 15 a 20 milímetros de mercúrio dentro do olho durante o período de fixação e deixe a amostra para corrigir durante a noite. No dia seguinte, remova a agulha de fixação e lave o olho por 10 minutos em soro fisco tamponado.Ao empregar uma tesoura cirúrgica oftálmica e um microscópio estéreo, faça uma incisão de espessura total na parede do olho perto da cabeça do nervo óptico. Estenda o corte para a frente em direção ao equador e, em seguida, em torno da circunferência equatorial do olho, poupando cuidadosamente os delicados processos ciliares e fibraszonulares associadas. Exponha a superfície posterior da lente removendo a parte de trás do globo.Remova o olho dissecado da solução tampão usando fórceps e coloque-o em uma limpeza de tarefa seca com a córnea voltada para baixo. Arraste suavemente a córnea sobre a superfície da limpeza para secá-la. Aplique uma gota de cola instantânea no fundo de uma placa de Petri de 50 milímetros e fixe a plataforma a ela.Coloque o prato na placa do palco do microscópio estéreo para que o poço com a cola esteja à vista. Para acomodar o olho nos poços de plataforma da placa de Petri, adicione três microliters de cola instantânea. Coloque-o cuidadosamente no poço e ajuste rapidamente para que a parte de trás da lente fique virada para cima.Seque o lado exposto da lente manchando suavemente com o canto de uma limpeza seca. Para medir a resposta viscoelástica zonular, ligue a balança, coloque a placa de Petri na escala e inicie o programa de registro de escala e o software da câmera. Ligue o controlador servomotor.Inicie a aplicação do controlador no computador e defina os parâmetros de movimento com incrementos de 50 micrômetros. Crie 90 graus de dobra em uma haste capilar. Coloque o capilar dobrado no suporte da sonda capilar e aperte os parafusos de fixação.Na ponta capilar, adicione uma pequena pérola de cola de cura UV. Mova a ponta da sonda capilar usando os ajustes manuais no manipulador e coloque-a diretamente sobre a parte superior da lente. Através da inspeção visual frontal e da vista lateral usando uma câmera de microscópio, examine que a parte inferior da cola UV aparece centrada sobre a parte superior da lente.Ao olhar através da câmera, baixe a ponta da sonda até que a cola UV faça contato com a lente e cubra de 1/3 a 1/2 de sua superfície superior. Cure a cola usando uma fonte de luz UV quase visível direcional de 380 a 400 nanômetros e uma intensidade de cerca de um miliwatt. Adicione a solução PBS à placa de Petri até que o olho esteja coberto a uma profundidade de pelo menos dois milímetros.Coloque uma lente cilíndrica na frente do microscópio e de uma forma próxima à placa de Petri sem tocá-la. Ao mesmo tempo, inicie o registro em um programa de temporizador. Tire uma foto do olho e da sonda usando a câmera.Após 60 segundos, comece um deslocamento de 50 micrômetros. Repita a cada 60 segundos até que o experimento seja concluído como indicado pela quebra de todas as fibras zonulares. Salve os dados de registro de escala após a conclusão de uma execução e exporte-os para um formato de planilha compatível.Além disso, salve as imagens das lentes obtidas durante a execução. Importe os dados em uma planilha. Usando a leitura da primeira e última escala, interpolar a deriva na leitura de fundo ao longo do tempo devido à evaporação, em seguida, subtrair o fundo interpolado da leitura em cada ponto de tempo.Após a realização do ensaio e correção para evaporação, o gráfico dos dados viscoelásticos é invertido. A magnitude das forças instantâneas e relaxadas aumenta a cada passo até cerca de 1.000 segundos, em seguida, cai à medida que as fibraszonulares começam a quebrar até que o ponto de tempo de 1.500 segundos é atingido quando todas as fibras são quebradas. Para esta demonstração, também foram comparadas as respostas viscoelásticas para tipo selvagem e camundongos deficientes magp-1.No tempo inicial de zero a 600 segundos, os gráficos se assemelham uns aos outros sugerindo que as propriedades viscoelásticas das fibras zonulares não foram significativamente alteradas. No entanto, no rato nocaute MAGP-1, as fibras quebram prematuramente. As forças de quebra de fibras zonulares foram obtidas com o método pull-up para ratos magp-1 versus tipo selvagem em estágios de um mês e um ano de idade.Os resultados indicaram que a força das fibras aumenta com a idade para ratos do tipo selvagem. Qualquer contato acidental com a placa de Petri durante esses passos pode fazer com que a parede do olho mude em relação à lente ocular, potencialmente danificando as fibraszonulares. Este ensaio de pull-up ajuda a identificar proteínas que contribuem para a resistência à tração dos microfibrils.Usaremos essas informações para construir modelos mais realistas do interior das fibras zonulares.

Research

JoVE Journal

Medicine

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

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To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Medicina

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Protocolos para Avaliação de radiofreqüência Interações com Nanopartículas de Ouro e Sistemas biológicos para terapia não-invasiva Câncer Hipertermia

Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma de indução de Procedimento em um<em&gt; In Vivo</em&gt; Modelo de Rato e Whole mount-Retina Preparação

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Avaliação In Vivo das Propriedades Mecanicas e Viscoelásticas da Língua do Rato

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