Name: biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers
Uploaded: 2021-12-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH R01 EY029130 (S.B.) och P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 och Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), Marfan Foundation och ett obegränsat anslag till institutionen för oftalmologi och visuella vetenskaper vid Washington University från Forskning till förhindra blindhet. J.R. fick också ett stipendium från University of Health Sciences and Pharmacy till stöd för detta projekt.

Alla djurförsök godkändes av Washington University Animal Studies Committee och följde ARVO-uttalandet för användning av djur i oftalmisk och visionsforskning.
1. Tillverkning av specialiserade delar och konstruktion av apparater
<ol><li>Tillverkning av specialiserade delar<ol>
<li>Sondtillverkning. Håll en glaskapillär i en vinkel som visas i den vänstra panelen i figur 2A. Placera en låga från en cigarettändare ca 2 cm från ena ä...

<ol>
	<li>Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+glass:+structural+determinants+of+eye+lens+transparency.">Biological glass: structural determinants of eye lens transparency.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinn's+zonule.">Zinn's zonule.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).</li><li>Dureau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+zonular+diseases.">Pathophysiology of zonular diseases.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent-transforming+growth+factor+beta-binding+protein-2+(LTBP-2)+is+required+for+longevity+but+not+for+development+of+zonular+fibers.">Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers.</a> Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).</li><li>Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fibers,+reticular+fibers+and+elastic+fibers.+A+comprehensive+understanding+from+a+morphological+viewpoint.">Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint.</a> Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+preserving+and+visualizing+the+three-dimensional+structure+of+the+mouse+zonule.">A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule.</a> Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).</li><li>Todorovic, V., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTBPs,+more+than+just+an+escort+service.">LTBPs, more than just an escort service.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).</li><li>Mecham, R. P., Gibson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microfibril-associated+glycoproteins+(MAGPs)+and+the+microfibrillar+niche.">The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche.</a> Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).</li><li>Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eye+development+is+characterized+by+coordinated+expression+of+fibrillin+isoforms.">Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+TGF-&#946;+binding+protein-2+is+essential+for+the+development+of+ciliary+zonule+microfibrils.">Latent TGF-&#946; binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).</li><li>De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+bovine+and+human+ciliary+zonule.">Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).</li><li>Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+supramolecular+organization+of+fibrillin-rich+microfibrils+determines+the+mechanical+properties+of+bovine+zonular+filaments.">The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments.</a> Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).</li><li>Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+mechanical+behaviour+and+estimation+of+the+elastic+properties+of+porcine+zonular+fibres.">Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres.</a> Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).</li><li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+body+in+accommodation.">The ciliary body in accommodation.</a> Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).</li><li>Michael, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+human+lens+zonules+as+a+function+of+age+in+presbyopes.">Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).</li><li>van Alphen, G. W., Graebel, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+tissues+involved+in+accommodation.">Elasticity of tissues involved in accommodation.</a> Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).</li><li>Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+micromechanics+of+elastic+tissue.">The structure and micromechanics of elastic tissue.</a> Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).</li><li>Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+fibrillin-1+in+the+mouse+eye+results+in+ectopia+lentis+and+other+ocular+phenotypes+associated+with+Marfan+syndrome.">Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).</li><li>Weinbaum, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+microfibril-associated+glycoprotein-1+leads+to+complex+phenotypes+in+multiple+organ+systems.">Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).</li><li>Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FBN1+gene+mutations+in+patients+with+ectopia+lentis+and+marfanoid+habitus.">Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).</li></ol>

Zonule är ett ovanligt ECM-system där fibrer är ordnade symmetriskt och kan manipuleras identiskt genom att förskjuta ögonlinsen längs den optiska axeln. Utrymmet kan också lätt nås utan cellulära störningar, vilket gör att fibrerna kan studeras i en miljö nära deras ursprungliga tillstånd. Pull-up tekniken drar nytta av denna ECM presentation för att manipulera de känsliga fibrerna från möss, ett genetiskt dragbart system, och exakt kvantifiera deras mekaniska egenskaper. Detta har gjort det möjligt ...

Ett ryggradsdjurs öga innehåller en levande optisk lins som hjälper till att fokusera bilder på näthinnan1. Linsen är upphängd på den optiska axeln av ett system av känsliga, radiellt orienterade fibrer, vilket illustreras i figur 1A. I ena änden fäster fibrerna på linsvatorn och i den andra på ytan av ciliarykroppen. Deras längder sträcker sig från 150 μm hos möss till 1 mm hos människor. Tillsammans är dessa fibrer kända som Zonule av Zinn2, ciliary zonule, eller helt enkelt zonule. Okulär trauma, sjukdom och vissa genetiska störningar kan påverka integriteten hos zonulära fibrer3, vilket resulterar i deras eventuella misslyckande och åtföljande förlust av syn. Hos möss har fibrerna en kärna som till största delen består av proteinet fibrillin-2, omgiven av en mantel rik på fibrillin-14. Även om zonulära fibrer är unika för ögat, bär de många likheter med elastinbaserade ECM-fibrer som finns någon annanstans i kroppen. De senare är täckta av en fibrillin-1 mantel5 och har liknande dimensioner som zonulära fibrer6. Andra proteiner, såsom latent-transformerande tillväxtfaktor β-bindande proteiner (LTBC) och mikrofibril-associerade glykoprotein-1 (MAGP-1), finns i samband med båda typerna av fibrer7,8,9,10,11. Den elastiska modulen av zonulära fibrer ligger i intervallet 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, jämförbar med den för elastinbaserade fibrer (0,3-1,2 MPa)17. Dessa arkitektoniska och mekaniska likheter leder oss att tro att någon insikt i rollerna för zonule-associerade proteiner kan hjälpa till att klargöra deras roller i andra ECM elastiska fibrer.
Huvudsyftet med att utveckla den metod som beskrivs här är att få insikter om specifika zonulära proteiners roll i utvecklingen av ärftlig ögonsjukdom. Det allmänna tillvägagångssättet är att jämföra de viskoelastiska egenskaperna hos zonulära fibrer i vilda möss med möss som bär riktade mutationer i gener som kodar zonulära proteiner. Medan flera metoder tidigare har använts för att mäta de elastomekaniska egenskaperna hos zonulära fibrer, var alla utformade för ögonen på mycket större djur12,13,14,15,16. Som sådana modeller är inte genetiskt dragbara; vi försökte utveckla en experimentell metod som var bättre lämpad för mössens små och känsliga ögon.
Metoden vi utvecklade för att bedöma viskoelasticiteten hos muszonulära fibrer är en teknik som vi hänvisar till som pull-up assay4,18, som sammanfattas visuellt i figur 1. Nedan följer en detaljerad beskrivning av pull-up-metoden och analysen av resultaten. Vi börjar med att beskriva konstruktionen av apparaten, inklusive de tredimensionella (3D)-utskrivna delarna som används i projektet. Därefter beskriver vi protokollet som används för att få och förbereda ögonen för experimentet. Slutligen ger vi steg-för-steg-instruktioner om hur man får data för bestämning av de viskoelastiska egenskaperna hos zonulära fibrer. I avsnittet Representativa resultat delar vi tidigare opublicerade data som erhållits med vår metod om de viskoelastiska egenskaperna hos zonulära fibrer från möss som saknar MAGP-119 samt en kontrolluppsättning som erhållits från åldersmatchade vilda djur. Slutligen avslutar vi med allmänna anmärkningar om metodens fördelar och begränsningar och förslag på potentiella experiment som kan belysa hur miljömässiga och biokemiska faktorer påverkar ECM-fibrernas viskoelastiska egenskaper.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4-20 hex screws 3/4 inch long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4-20 nut</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D SLA printer</td>
			<td>Anycubic</td>
			<td>Photon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 screws 3/8 inch long, 2</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B120-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (super) glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale accurate to 0.01 g</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>OHAUS Scout 220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas cigarette lighter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inspection/dissection microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: SM-4NTP</td>
			<td>Working distance ~ 15 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator, Economy 4-axis</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Kite-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micrometer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Z812B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LK1431L1</td>
			<td>-75 mm focal length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 50 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder, 3 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post, 4 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale logging software</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>LoggePro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KDC101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller software</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted base, 1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted bases, 2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand for micromanipular</td>
			<td>WPI</td>
			<td>M-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-camera for microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: MD500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV activated glue with UV source</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers

Elasticitet är viktigt för funktionen av vävnader som blodkärl, muskler och lungor. Den här egenskapen härleds främst från den extracellulära matrisen (ECM), proteinmaskverket som binder samman celler och vävnader. Hur de elastiska egenskaperna hos ett ECM-nät relaterar till dess sammansättning, och huruvida ECM:s avslappningsegenskaper spelar en fysiologisk roll, är frågor som ännu inte har behandlats fullt ut. En del av utmaningen ligger i den komplexa arkitekturen i de flesta ECM-system och svårigheten att isolera ECM-komponenter utan att kompromissa med deras struktur. Ett undantag är zonule, ett ECM-system som finns i ryggradsdjurens öga. Zonule består av fibrer hundratals till tusentals mikrometer i längd som sträcker sig över det cellfria utrymmet mellan linsen och ögonväggen. I denna rapport beskriver vi en mekanisk teknik som drar nytta av den välorganiserade strukturen i zonule för att kvantifiera dess viskoelastiska egenskaper och för att bestämma bidraget från enskilda proteinkomponenter. Metoden innebär dissekering av ett fast öga för att exponera linsen och zonule och använder en pull-up-teknik som sträcker zonfibrerna lika medan deras spänning övervakas. Tekniken är relativt billig men känslig nog att upptäcka förändringar i viskoelastiska egenskaper hos zonulära fibrer hos möss som saknar specifika zonulära proteiner eller med åldrande. Även om metoden som presenteras här är främst utformad för att studera okulär utveckling och sjukdom, kan den också fungera som en experimentell modell för att utforska bredare frågor om de viskoelastiska egenskaperna hos elastiska ECM och rollen av yttre faktorer som jonisk koncentration, temperatur och interaktioner med signalmolekyler.

Pull-up tekniken som beskrivs här ger ett enkelt tillvägagångssätt för att bestämma viskoelastiska egenskaper hos zonulära fibrer hos möss. Kort sagt bevaras musögat först genom injektion av ett fixativ vid fysiologiskt intraokulärt tryck. Detta tillvägagångssätt upprätthåller den naturliga inflationen i ögat och håller fibrerna ordentligt förspänningade (fixering ansågs acceptabelt efter preliminära experiment visade att det inte förändrade fibrernas elasticitet eller styrka avsevärt). Baksidan ...

Watch this Scientific Journal Video about Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers at JoVE.com

Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers

Protokollet beskriver en metod för studier av extracellulär matris viskoelasticitet och dess beroende av protein sammansättning eller miljöfaktorer. Matrissystemet som är riktat är muszonuleet. Metodens prestanda demonstreras genom att jämföra viskoelastiskt beteende hos vilda zonulära fibrer med de som saknar mikrofibril-associerade glykoprotein-1.

Biologisk beredning och mekanisk teknik för att bestämma viskoelastiska egenskaper hos zonulära fibrer

Elasticity is essential to the function of tissues such as blood vessels, muscles, and lungs. This property is derived mostly from the extracellular ...

Vikten av vår metod ligger i dess förmåga att svara på frågan, vilka är de viskoelastiska egenskaperna hos zonulära fibrer, fibrerna som suspenderar linsen inuti ögat? Den största fördelen med vår teknik är att den kan kvantifiera de viskoelastiska egenskaperna hos de små och känsliga zonulära fibrerna från möss med och utan riktade genmodifieringar. Mutationer i gener som kodar mikrofibrilproteiner ligger till grund för flera ärftliga syndromiska tillstånd.Med hjälp av vår teknik kan vi undersöka hur specifika mutationer förändrar mikrofibrillernas biomekaniska egenskaper. Till att börja med, efter avlivning av musen, ta bort ögonen med fina tångar. Sätt in spetsen på en fixeringsnål genom ögats vägg och placera den i mitten av glaskroppen, var försiktig så att du inte skadar linsen.Överför försiktigt det spetsiga ögat till ett rör fyllt med 4% paraformaldehyd och fosfatbuffrad saltlösning. Öppna ventilen som förbinder nålen med en fixerad behållare 25 centimeter ovanför provet och som upprätthåller ett positivt tryck som motsvarar 15 till 20 millimeter kvicksilver i ögat under fixeringsperioden och låt provet fixeras över natten. Nästa dag, ta bort fixeringsnålen och tvätta ögat i 10 minuter i fosfatbuffrad saltlösning.Genom att använda oftalmisk kirurgisk sax och ett stereomikroskop, gör ett full tjocklekssnitt i ögats vägg nära det optiska nervhuvudet. Förläng snittet framåt mot ekvatorn och sedan runt ögats ekvatoriella omkrets samtidigt som försiktigt spara de känsliga ciliary processerna och tillhörande zonulära fibrer. Exponera linsens bakre yta genom att ta bort jordglobens baksida.Ta bort det dissekerade ögat från buffertlösningen med tång och placera det på en torr uppgiftsservett med hornhinnan vänd nedåt. Dra försiktigt hornhinnan över ytan av våtservetten för att torka den. Applicera en droppe snabblim på botten av en 50 millimeter Petri-maträtt och fixa plattformen till den.Placera skålen på stereomikroskopets scenplatta så att brunnen med limet är i sikte. För att rymma ögat i petriskålens plattformsbrunnar, tillsätt tre mikroliter av snabblim. Placera den försiktigt i brunnen och justera snabbt så att linsens baksida är vänd uppåt.Torka den exponerade sidan av linsen genom att försiktigt blotta med hörnet av en torrservett. För att mäta zonulärt viskoelastiskt svar, slå på skalan, placera Petri-skålen på skalan och starta sedan skalloggningsprogrammet och kameraprogramvaran. Slå på servomotor styrenheten.Starta styrenhetsprogrammet på datorn och ställ in rörelseparametrarna med steg om 50 mikrometer. Skapa 90 grader böj i en kapillärstång. För in den böjda kapillären i kapillärsondhållaren och dra åt fästskruvarna.Till kapillärspetsen tillsätt en liten pärla av UV-härdningslim. Flytta kapillärsondens spets med hjälp av de manuella justeringarna på manipulatorn och placera den direkt över linsens ovanpå. Genom visuell inspektion fram och sidovyn med hjälp av en mikroskopkamera, undersök att den nedre delen av UV-limet verkar centrerat över linsens ovansida.När du tittar igenom kameran sänker du sondens spets tills UV-limmet kommer i kontakt med objektivet och täcker 1/3 till 1/2 av dess övre yta. Härda limmet med en riktad nära synlig UV-ljuskälla på 380 till 400 nanometers våglängd och en intensitet på cirka en milliwatt. Tillsätt PBS-lösningen till Petri-skålen tills ögat är täckt till ett djup av minst två millimeter.Placera en cylindrisk lins framför mikroskopet och på ett nära sätt till Petri-skålen utan att röra den. Samtidigt startar du inloggningen i ett timerprogram. Ta en bild av ögat och sonden med hjälp av kameran.Efter 60 sekunder, börja en 50 mikrometer förskjutning. Upprepa var 60: e sekund tills experimentet är slutfört enligt vad som indikeras av brott av alla zonulära fibrer. Spara skalloggningsdata när en körning har slutförts och exportera dem till ett kompatibelt kalkylbladsformat.Spara också linsbilderna som erhållits under körningen. Importera data till ett kalkylblad. Använd den första och den sista skalavläsningen, interpolera avvikelsen i bakgrundsavläsningen över tid på grund av avdunstning och subtrahera sedan den interpolerade bakgrunden från avläsningen i varje tidspunkt.Efter att ha utfört analysen och korrigerat för avdunstning inverteras diagrammet över viskoelastiska data. Storleken på de momentana och avslappnade krafterna ökar med varje steg upp till ca 1 000 sekunder och sjunker sedan när zonfibrerna börjar bryta tills 1 500 sekunders tidspunkt uppnås när alla fibrer bryts. För denna demonstration jämfördes också viskoelastiska svaret för vilda typer och MAGP-1 bristfälliga möss.Vid den första tiden av noll till 600 sekunder liknar diagrammen varandra vilket tyder på att de viskoelastiska egenskaperna hos zonulära fibrer inte ändrades väsentligt. Men i MAGP-1 knockout-musen bryts fibrerna i förtid. Zonular fiber bryta krafter erhölls med pull-up metoden för MAGP-1 kontra vilda typ möss på en månad och ett år gamla stadier.Resultaten indikerade att fibrernas styrka ökar med åldern för vilda möss. Oavsiktlig kontakt med Petri-skålen under dessa steg kan orsaka att ögonväggen skiftar i förhållande till ögonlinsen, vilket kan skada zonfibrerna. Denna pull-up-analys hjälper till att identifiera proteiner som bidrar till mikrofibrillernas draghållfasthet.Vi kommer att använda den här informationen för att bygga mer realistiska modeller av insidan av zonulära fibrer.

Research

JoVE Journal

Medicine

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

Myo-mekanisk analys av isolerade skelettmuskler

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy

Protokoll för Bedöma radiofrekvens Interaktioner med guld nanopartiklar och biologiska system för icke-invasiv hypertermi cancerterapi

Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaukom framkallande ordningen i en<em&gt; In Vivo</em&gt; Råttmodell och Hela montering Retina Förberedelse

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Proximal Cadaveric Femur Preparation for Fracture Strength Testing and Quantitative CT-based Finite Element Analysis

Proximal avlidna lårben Förberedelse för brotthållfasthet testning och Kvantitativ CT-baserade Finite Element Analysis

Cadaveric fracture testing is routinely used to understand factors that affect proximal femur strength.  Because ex vivo biological tissues are prone to ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In vivo- utvärdering av råtttavans mekaniska och viskoelastiska egenskaper

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Bedömning av Endothelial celler med hjälp av 3D cellkultur och icke-Antikoagulerat helblod blodförtunnande och antiinflammatoriska egenskaper

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Mechanical Ventilation Boot Camp Curriculum

Mekanisk Ventilation Boot Camp läroplan

Medical management of mechanically ventilated patients is challenging to novice providers. Incorrect management of this population may lead to increased ...

Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

Mekanisk Micronization av Lipoaspirates för regenerativ behandling

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

Determining and Controlling External Power Output During Regular Handrim Wheelchair Propulsion

Bestämma och kontrollera extern uteffekt under vanlig handrimrullstolsframdrivning

The use of a manual wheelchair is critical to 1% of the world&#39;s population. Human powered wheeled mobility research has considerably matured, which ...

A Probing Device for Quantitatively Measuring the Mechanical Properties of Soft Tissues during Arthroscopy

En sonderingsanordning för kvantitativ mätning av de mekaniska egenskaperna hos mjuka vävnader under artroskopi

Probing in arthroscopic surgery is performed by pulling or pushing the soft tissue, which provides feedback for understanding the condition of the soft ...