Name: biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers
Uploaded: 2021-12-16T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers at JoVE.com

Bu çalışma NIH R01 EY029130 (S.B.) ve P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 ve Ines Mandl Araştırma Vakfı (R.P.M.), Marfan Vakfı tarafından desteklenmiş ve Washington Üniversitesi Oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümü'ne Araştırmadan Körlüğü Önlemeye Yönelik Sınırsız Bir Hibe ile desteklenmiştir. J.R. ayrıca bu projeye destek olarak Sağlık Bilimleri ve Eczacılık Üniversitesi'nden hibe aldı.

Tüm hayvan deneyleri Washington Üniversitesi Hayvan Çalışmaları Komitesi tarafından onaylandı ve OFTALMIK ve Vizyon Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Bildirimi'ne bağlı kalındı.
1. Özel parçaların imalatı ve aparatların yapımı
<ol><li>Özel parçaların imalatı<ol>
<li>Sonda imalatı. Şekil 2A'nın sol panelinde gösterildiği gibi bir açıyla cam kılcal damar tutun. Bir ucundan yaklaşık 2 cm uzakl?...

<ol>
	<li>Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+glass:+structural+determinants+of+eye+lens+transparency.">Biological glass: structural determinants of eye lens transparency.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zinn's+zonule.">Zinn's zonule.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 82, 100902 (2021).</li><li>Dureau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathophysiology+of+zonular+diseases.">Pathophysiology of zonular diseases.</a> Current Opinion in Ophthalmology. 19 (1), 27-30 (2008).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent-transforming+growth+factor+beta-binding+protein-2+(LTBP-2)+is+required+for+longevity+but+not+for+development+of+zonular+fibers.">Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers.</a> Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).</li><li>Ushiki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+fibers,+reticular+fibers+and+elastic+fibers.+A+comprehensive+understanding+from+a+morphological+viewpoint.">Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint.</a> Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).</li><li>Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+preserving+and+visualizing+the+three-dimensional+structure+of+the+mouse+zonule.">A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule.</a> Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).</li><li>Todorovic, V., Rifkin, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LTBPs,+more+than+just+an+escort+service.">LTBPs, more than just an escort service.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).</li><li>Mecham, R. P., Gibson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microfibril-associated+glycoproteins+(MAGPs)+and+the+microfibrillar+niche.">The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche.</a> Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).</li><li>Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+eye+development+is+characterized+by+coordinated+expression+of+fibrillin+isoforms.">Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latent+TGF-&#946;+binding+protein-2+is+essential+for+the+development+of+ciliary+zonule+microfibrils.">Latent TGF-&#946; binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils.</a> Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).</li><li>De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+bovine+and+human+ciliary+zonule.">Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).</li><li>Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+supramolecular+organization+of+fibrillin-rich+microfibrils+determines+the+mechanical+properties+of+bovine+zonular+filaments.">The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments.</a> Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).</li><li>Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+mechanical+behaviour+and+estimation+of+the+elastic+properties+of+porcine+zonular+fibres.">Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres.</a> Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).</li><li>Fisher, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+body+in+accommodation.">The ciliary body in accommodation.</a> Transactions of the Ophthalmological Societies of the United Kingdom. 105, 208-219 (1986).</li><li>Michael, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastic+properties+of+human+lens+zonules+as+a+function+of+age+in+presbyopes.">Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).</li><li>van Alphen, G. W., Graebel, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elasticity+of+tissues+involved+in+accommodation.">Elasticity of tissues involved in accommodation.</a> Vision Research. 31 (7-8), 1417-1438 (1991).</li><li>Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+and+micromechanics+of+elastic+tissue.">The structure and micromechanics of elastic tissue.</a> Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).</li><li>Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+deletion+of+fibrillin-1+in+the+mouse+eye+results+in+ectopia+lentis+and+other+ocular+phenotypes+associated+with+Marfan+syndrome.">Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).</li><li>Weinbaum, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+in+microfibril-associated+glycoprotein-1+leads+to+complex+phenotypes+in+multiple+organ+systems.">Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).</li><li>Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FBN1+gene+mutations+in+patients+with+ectopia+lentis+and+marfanoid+habitus.">Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus.</a> British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).</li></ol>

Zonule, liflerin simetrik olarak düzenlendiği ve optik eksen boyunca göz merceği yerinden edilerek aynı şekilde manipüle edilebilen alışılmadık bir ECM sistemidir. Alan ayrıca hücresel bozulma olmadan kolayca erişilebilir ve liflerin kendi yerel durumlarına yakın bir ortamda incelenmesini sağlar. Barfiks tekniği, genetik olarak çekişli bir sistem olan farelerden gelen hassas lifleri manipüle etmek ve mekanik özelliklerini doğru bir şekilde ölçmek için bu ECM sunumundan yararlanır. Bu, anahtar ...

Bir omurgalının gözü, görüntüleri retinaya odaklamaya yardımcı olan canlı bir optik lens içerir1. Lens, Şekil 1A'da gösterildiği gibi hassas, radyal yönelimli fiberlerden oluşan bir sistem tarafından optik eksende askıya alınmıştır. Bir uçta, lifler lens ekvatoru ve diğer ucunda siliary gövdenin yüzeyine bağlanır. Uzunlukları farelerde 150 μm ile insanlarda 1 mm arasında değişen mesafelere yayılır. Toplu olarak, bu lifler Zinn2 zonule, siliary zonule veya sadece zonule olarak bilinir. Oküler travma, hastalık ve bazı genetik bozukluklar zonular liflerin bütünlüğünü etkileyebilir3, bu da nihai başarısızlıklarına ve eşlik eden görme kaybına neden olabilir. Farelerde, lifler çoğunlukla fibrilin-2 proteini içeren bir çekirdeğe sahiptir ve fibrilin-14 bakımından zengin bir mantle ile çevrilidir. Zonular lifler göze özgü olmasına rağmen, vücudun başka yerlerinde bulunan elastin bazlı ECM lifleri ile birçok benzerlik taşırlar. İkincisi bir fibrilin-1 mantle5 ile kaplıdır ve zonular liflerle benzer boyutlara sahiptir6. Gizli dönüştürücü büyüme faktörü β bağlayıcı proteinler (LTBP'ler) ve mikrofibril ilişkili glikoprotein-1 (MAGP-1) gibi diğer proteinler, her iki lif türüyle de ilişkili olarak bulunur7,8,9,10,11. Zonular liflerin elastik modülü 0.18-1.50 MPa12,13,14,15,16 aralığındadır, elastin bazlı liflerinkiyle karşılaştırılabilir (0.3-1.2 MPa)17. Bu mimari ve mekanik benzerlikler, zonule ilişkili proteinlerin rollerine ilişkin herhangi bir içgörünün diğer ECM elastik liflerdeki rollerini aydınlatabileceğine inanmamıza neden olur.
Burada açıklanan yöntemi geliştirmenin temel amacı, kalıtsal göz hastalığının ilerlemesinde spesifik zonular proteinlerin rolü hakkında fikir edinmektir. Genel yaklaşım, vahşi tip farelerdeki zonular liflerin viskoelastik özelliklerini, zonular proteinleri kodlayan genlerde hedeflenen mutasyonları taşıyan farelerinkilerle karşılaştırmaktır. Zonular liflerin elasto-mekanik özelliklerini ölçmek için daha önce çeşitli yöntemler kullanılmış olsa da, hepsi çok daha büyük hayvanların gözleri için tasarlanmıştır12,13,14,15,16. Bu modeller genetik olarak çekişli olmadığı için; farelerin küçük ve narin gözlerine daha uygun deneysel bir yöntem geliştirmeye çalıştık.
Fare zonular liflerinin viskoelastisitesini değerlendirmek için geliştirdiğimiz yöntem, Şekil 1'de görsel olarak özetlenen barfiks tahlil4,18 olarak adlandırdığımız bir tekniktir. Barfiks yönteminin ayrıntılı bir açıklaması ve sonuçların analizi aşağıda verilmiştir. Projede kullanılan üç boyutlu (3D) baskılı parçalar da dahil olmak üzere cihazın yapımını anlatarak başlıyoruz. Daha sonra, gözleri deney için elde etmek ve hazırlamak için kullanılan protokolü detaylandırıyoruz. Son olarak, zonular liflerin viskoelastik özelliklerinin belirlenmesi için veri elde etme konusunda adım adım talimatlar sunuyoruz. Temsili Sonuçlar bölümünde, MAGP-119'dan yoksun farelerden zonular liflerin viskoelastik özellikleri ve yaşla eşleşen vahşi tip hayvanlardan elde edilen bir kontrol seti ile ilgili yöntemimizle daha önce yayınlanmamış verileri paylaşıyoruz. Son olarak, yöntemin avantajları ve sınırlamaları hakkında genel açıklamalar ve çevresel ve biyokimyasal faktörlerin ECM liflerinin viskoelastik özelliklerini nasıl etkilediğini ortaya çıkarabilecek potansiyel deneyler için önerilerle sonlandırıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/4-20 hex screws 3/4 inch long</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>SH25S075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4-20 nut</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D SLA printer</td>
			<td>Anycubic</td>
			<td>Photon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-40 screws 3/8 inch long, 2</td>
			<td>Hardware store</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B120-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate (super) glue</td>
			<td>Loctite</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Scale accurate to 0.01 g</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>OHAUS Scout 220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas cigarette lighter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inspection/dissection microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: SM-4NTP</td>
			<td>Working distance ~ 15 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator, Economy 4-axis</td>
			<td>WPI</td>
			<td>Kite-L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized micrometer</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>Z812B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative cylindrical lens</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LK1431L1</td>
			<td>-75 mm focal length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes, 50 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder, 3 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post, 4 inches</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TR4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale logging software</td>
			<td>Vernier</td>
			<td>LoggePro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KDC101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo motor controller software</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>APT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted base, 1</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slotted bases, 2</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stand for micromanipular</td>
			<td>WPI</td>
			<td>M-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-camera for microscope</td>
			<td>Amscope</td>
			<td>SKU: MD500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV activated glue with UV source</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biological preparation and mechanical technique for determining viscoelastic properties of zonular fibers

Elastikiyet kan damarları, kaslar ve akciğerler gibi dokuların işlevi için gereklidir. Bu özellik çoğunlukla hücre ve dokuları birbirine bağlayan protein meshwork olan hücre dışı matristen (ECM) türetilmiştir. Bir ECM ağının elastik özelliklerinin bileşimiyle nasıl ilişkili olduğu ve ECM'nin gevşeme özelliklerinin fizyolojik bir rol oynayıp oynamadığı, henüz tam olarak ele alınmamış sorulardır. Zorluğun bir kısmı, çoğu ECM sisteminin karmaşık mimarisinde ve ECM bileşenlerinin yapılarından ödün vermeden izole edilmesindeki zorlukta yatmaktadır. Bunun bir istisnası, omurgalıların gözünde bulunan bir ECM sistemi olan zonule'dir. Zonule, lens ve göz duvarı arasındaki hücresiz boşluğu kapsayan yüzlerce ila binlerce mikrometre uzunluğunda liflerden oluşur. Bu raporda, viskoelastik özelliklerini ölçmek ve bireysel protein bileşenlerinin katkısını belirlemek için zonulün son derece organize yapısından yararlanan mekanik bir tekniği açıklıyoruz. Yöntem, lensi ve zonuleyi açığa çıkarmak için sabit bir gözün diseksiyonu içerir ve gerginlikleri izlenirken zonular lifleri eşit olarak uzatan bir barfiks tekniği kullanır. Teknik nispeten ucuzdur, ancak belirli zonular proteinlerden yoksun veya yaşlanmaya sahip farelerde zonular liflerin viskoelastik özelliklerindeki değişiklikleri tespit edecek kadar hassastır. Burada sunulan yöntem öncelikle oküler gelişim ve hastalığı incelemek için tasarlanmış olsa da, elastik ECM'lerin viskoelastik özellikleri ve iyonik konsantrasyon, sıcaklık ve sinyal molekülleriyle etkileşimler gibi dış faktörlerin rolü ile ilgili daha geniş soruları keşfetmek için deneysel bir model olarak da hizmet edebilir.

Burada açıklanan barfiks tekniği, farelerdeki zonular liflerin viskoelastik özelliklerini belirlemek için basit bir yaklaşım sağlar. Kısacası, fare gözü ilk olarak fizyolojik göz içi basıncında bir fiksatif enjeksiyonu ile korunur. Bu yaklaşım gözün doğal enflasyonuni korur ve lifleri düzgün bir şekilde önceden gergin tutar (ön deneyler liflerin elastikiyetini veya gücünü önemli ölçüde değiştirmediğini gösterdikten sonra fiksasyon kabul edilebilir görülmüştür). Fare gözünün ar...

Watch this Scientific Journal Video about Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers at JoVE.com

Biological Preparation and Mechanical Technique for Determining Viscoelastic Properties of Zonular Fibers

Protokol, hücre dışı matris viskoelastisitesinin incelenmesi ve protein bileşimine veya çevresel faktörlere bağımlılığı için bir yöntem tanımlamaktadır. Hedeflenen matris sistemi fare zonule'sidir. Yöntemin performansı, vahşi tip zonular liflerin viskoelastik davranışı ile mikrofibril ilişkili glikoprotein-1'den yoksun olanlar karşılaştırılarak gösterilmiştir.

Zonular Liflerin Viskoelastik Özelliklerinin Belirlenmesinde Biyolojik Hazırlık ve Mekanik Teknik

Elasticity is essential to the function of tissues such as blood vessels, muscles, and lungs. This property is derived mostly from the extracellular ...

Yöntemimizin önemi, soruyu cevaplama yeteneğinde yatmaktadır, zonular liflerin viskoelastik özellikleri nelerdir, göz içindeki lensi askıya alan lifler? Tekniğimizin ana avantajı, hedefli gen modifikasyonları olan ve olmayan farelerden gelen küçük ve hassas zonular liflerin viskoelastik özelliklerini ölçebilmesidir. Mikrofibril proteinleri kodlayan genlerdeki mutasyonlar, kalıtsal birkaç syndromik koşulun altında yatırmaktadır.Tekniğimizi kullanarak, spesifik mutasyonların mikrofibrillerin biyomekanik özelliklerini nasıl değiştirdiğini araştırabiliriz. Başlamak için, fareyi ötenazi sonrası, ince tokmaklar kullanarak gözleri çıkarın. Bir fiksasyon iğnesinin ucunu gözün duvarına yerleştirin ve lense zarar vermemeye dikkat ederek vitreus mizahının ortasına yerleştirin.Saplanmış gözü% 4 paraformaldehit ve fosfat tamponlu salin ile dolu bir tüpe dikkatlice aktarın. İğneyi, sabitleme süresi boyunca göz içinde 15 ila 20 milimetre cıvaya eşdeğer pozitif basınç sağlayan numunenin 25 santimetre üzerinde bulunan sabitlenmiş bir rezervuara bağlayan vanayı açın ve numuneyi bir gecede sabitlemek için bırakın. Ertesi gün, fiksasyon iğnesini çıkarın ve gözü fosfat tamponlu salin içinde 10 dakika yıkayın.Oftalmik cerrahi makas ve stereo mikroskop kullanarak, optik sinir kafasının yakınındaki göz duvarında tam kalınlıkta bir kesi yapın. Hassas silier işlemleri ve ilişkili zonular lifleri dikkatlice tutarken, kesimi ekvatora doğru ve daha sonra gözün ekvatoral çevresine doğru uzatın. Dünyanın arkasını çıkararak lensin arka yüzeyini açığa çıkarın.Parçalanmış gözü forseps kullanarak tampon çözeltisinden çıkarın ve kornea aşağı bakacak şekilde kuru bir görev mendilinin üzerine yerleştirin. Korneayı kurutmak için silecek yüzeyinin üzerine hafifçe sürükleyin. 50 milimetrelik Petri kabının dibine bir damla anında tutkal uygulayın ve platformu sabitlayın.Kabı stereo mikroskobun sahne plakasına yerleştirin, böylece tutkallı kuyu görüntülenir. Gözü Petri kabının platform kuyularına yerleştirmek için üç mikrolitre anında tutkal ekleyin. Dikkatlice kuyuya yerleştirin ve lensin arkası yukarı doğru dönecek şekilde hızla ayarlayın.Lensin açıkta kalan tarafını kuru bir silmenin köşesiyle hafifçe şişirerek kurulayın. Zonular viskoelastik tepkiyi ölçmek için teraziyi açın, Petri kabını tartıya yerleştirin, ardından ölçek günlüğü programını ve kamera yazılımını başlatın. Servomotor kumandasını aç.Bilgisayarda denetleyici uygulamasını başlatın ve hareket parametrelerini 50 mikrometre artışlarla ayarlayın. Kılcal çubukta 90 derece büküm oluşturun. Bükülmüş kılcal damarı kılcal prob tutucusuna kaydırın ve sabitleme vidalarını sıkın.Kılcal uçlara küçük bir UV kürleme tutkalı ekleyin. Manipülatördeki manuel ayarlamaları kullanarak kılcal probun ucunu hareket ettirİn ve doğrudan lensin üstüne yerleştirin. Ön görsel inceleme ve mikroskop kamerası kullanarak yan görünüm sayesinde, UV tutkalının alt kısmının lensin üst kısmına ortalanmış olarak göründüğünü inceleyin.Kameradan bakarken, UV tutkal lensle temas edene ve üst yüzeyinin 1/3 ila 1/2'sini kaplayana kadar prob ucunu küt atlayın. Tutkal, 380 ila 400 nanometre dalga boyu yöne yakın bir UV ışık kaynağı ve yaklaşık bir miliwatt yoğunluk kullanarak kürlayın. Göz en az iki milimetre derinliğe kadar kaplanana kadar Petri kabına PBS çözeltisi ekleyin.Mikroskobun önüne ve Petri kabına dokunmadan yakın bir şekilde silindirik bir lens yerleştirin. Aynı zamanda, bir zamanlayıcı programında günlüğe kaydetmeyi başlatın. Kamerayı kullanarak gözün ve sondanın fotoğrafını çekin.60 saniye sonra, 50 mikrometre yer değiştirmeye başlayın. Deney tamamlanana kadar her 60 saniyede bir tekrarlayın, tüm zonular liflerin kırılmasıyla belirtildiği gibi. Bir çalıştırma tamamlandıktan sonra ölçek günlüğü verilerini kaydedin ve uyumlu bir elektronik tablo biçimine verin.Ayrıca, çalıştırma sırasında elde edilen lens resimlerini kaydedin. Verileri elektronik tabloya alın. İlk ve son ölçek okumasını kullanarak, buharlaşma nedeniyle zaman içinde arka plan okumasındaki sürüklenmeyi enterpolasyona tabi edin, ardından enterpolasyonlu arka planı her zaman noktasında okumadan çıkarın.Tahlil yapıldıktan ve buharlaşma için düzeltildikten sonra, viskoelastik verilerin grafiği ters çevrilir. Anlık ve rahat kuvvetlerin büyüklüğü, yaklaşık 1.000 saniyeye kadar her adımda artar, daha sonra zonular lifler tüm lifler kırıldığında 1.500 saniyelik zaman noktasına ulaşılana kadar kırılmaya başladığında düşer. Bu gösteri için, vahşi tip ve MAGP-1 eksikliği olan fareler için viskoelastik yanıt da karşılaştırıldı.Sıfır ila 600 saniyelik ilk zamanda, grafikler birbirine benzer ve zonular liflerin viskoelastik özelliklerinin önemli ölçüde değiştirilmediğini düşündürür. Bununla birlikte, MAGP-1 nakavt faresinde, lifler zamanından önce kırılır. Zonular lif kırma kuvvetleri, magp-1 için bir aylık ve bir yıllık aşamalarda vahşi tip farelere karşı barfiks yöntemi ile elde edildi.Sonuçlar, liflerin gücünün yabani tip fareler için yaşla birlikte arttığını gösterdi. Bu adımlar sırasında Petri kabı ile herhangi bir yanlışlıkla temas, göz duvarının göz merceğine göre kaymasına neden olabilir ve zonular liflere zarar verebilir. Bu barfibril tahlil, mikrofibrillerin gerilme mukavemetine katkıda bulunan proteinlerin tanımlanmasına yardımcı olur.Bu bilgileri, zonular liflerin iç kısmının daha gerçekçi modellerini oluşturmak için kullanacağız.

Research

JoVE Journal

Medicine

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

İzole İskelet Kası Myo-mekanik Analizi

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

Protocols for Assessing Radiofrequency Interactions with Gold Nanoparticles and Biological Systems for Non-invasive Hyperthermia Cancer Therapy

Non-invaziv Hipertermi Kanser Tedavisi için Altın Nanoparçacıklannm ve Biyolojik Sistemleri ile Radyofrekans Etkileşimleri değerlendirilmesi için Protokoller

Cancer therapies  which are less toxic and invasive than their existing counterparts are highly  desirable. The use of RF electric-fields that penetrate ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glokom uyaran bir de Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Rat Modeli ve Tüm montaj Retina Hazırlık

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

Proximal Cadaveric Femur Preparation for Fracture Strength Testing and Quantitative CT-based Finite Element Analysis

Kırılma Mukavemeti Test ve Kantitatif BT merkezli Sonlu Elemanlar Analizi Proksimal Kadavra Femur Hazırlık

Cadaveric fracture testing is routinely used to understand factors that affect proximal femur strength.  Because ex vivo biological tissues are prone to ...

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

In Vivo Evaluation of the Mechanical and Viscoelastic Properties of the Rat Tongue

Sıçan Dilinin Mekanik ve Viskoelastik Özelliklerinin In Vivo Değerlendirilmesi

The tongue is a highly innervated and vascularized muscle hydrostat on the floor of the mouth of most vertebrates. Its primary functions include ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Mechanical Ventilation Boot Camp Curriculum

Mekanik havalandırma Boot Camp müfredat

Medical management of mechanically ventilated patients is challenging to novice providers. Incorrect management of this population may lead to increased ...

Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

Lipoaspirates mekanik mikronize rejeneratif Terapisi için

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

Determining and Controlling External Power Output During Regular Handrim Wheelchair Propulsion

Düzenli Handrim Tekerlekli Sandalye İtkisi Sırasında Harici Güç Çıkışının Belirlenmesi ve Kontrolü

The use of a manual wheelchair is critical to 1% of the world&#39;s population. Human powered wheeled mobility research has considerably matured, which ...

A Probing Device for Quantitatively Measuring the Mechanical Properties of Soft Tissues during Arthroscopy

Artroskopi Sırasında Yumuşak Dokuların Mekanik Özelliklerini Nicel Olarak Ölçen Bir Sondalama Cihazı

Probing in arthroscopic surgery is performed by pulling or pushing the soft tissue, which provides feedback for understanding the condition of the soft ...