Name: high-throughput optical controlling and recording calcium signal in ipsc-derived cardiomyocytes for toxicity testing and phenotypic drug screening
Uploaded: 2022-03-31T13:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening at JoVE.com

ونشكر البروفيسور روبرت كامبل من جامعة طوكيو على مشاطرته المواد والمناقشات القيمة؛ الدكتور شيا لين هو في الجهاز الجزيئي للدعم الفني.

تم توفير اعتلال عضلة القلب غير المضغوط (LVNC) المريض iPSC المشتقة من الخلايا العضلية القلبية (iPSC-CM) من قبل مستشفى جامعة تايوان الوطنية. وجاء جمع عينات المرضى لإعادة برمجتها على iPSC وبروتوكولات الصيانة14 لأغراض البحث وفقا لإعلان هلسنكي الصادر عن الجمعية العالمية للأرصاد الجوية (المبادئ الأخلاقية للبحوث الطبية التي تشمل البشر) وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية: مكتب لجنة أخلاقيات البحث في NTUH (#201612099RINC). تم الحصول على iPSC-CM أخرى من البائعين التجاريين. لا يتطلب استخدام مشتقات iPSC أذونات محددة في مؤسستنا.
1. iPSC المستمدة من إعداد الخلايا العضلية القلبية
<ol><li>قم بإعداد اللوحة متعددة الآبار قبل إزالة iPSC-CM من التخزين البارد للذوبان. قم بتغطية كل بئر من الصفيحة الدقيقة المكونة من 96 بئرا بمحلول 100 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل من الفيبرونيكتين / 0.2٪ من الجيلاتين (انظر جدول المواد) لتغطية جميع الأسطح جيدا.</li>
	<li>احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في حاضنة رطبة.</li>
	<li>قم بتسخين الوسط (انظر جدول المواد) إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل ذوبان الخلايا. ملاحظة: يصف هذا البروتوكول درجة حرارة الغرفة بأنها 25 درجة مئوية.</li>
	<li>انقل iPSC-CM من خزان تخزين النيتروجين السائل إلى حمام مائي 37 درجة مئوية. ملاحظة: عادة ما يتم شحن iPS-CMs على الثلج الجاف بواسطة مصادر أكاديمية أو تجارية. يتم نقلها إلى تخزين النيتروجين السائل عند الاستلام حتى الاستخدام.</li>
	<li>قم بإزالة القارورة قبل أن يذوب الجليد بالكامل ورش القارورة بنسبة 75٪ من الإيثانول.</li>
	<li>خذ القارورة إلى خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية وانقل محتوياتها برفق إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل يحتوي على 9 مل من وسط درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>الطرد المركزي للخلايا في 200 × غرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>تخلص من المادة الفائقة بواسطة ماصة وأعد تعليق الخلايا بلطف في 1 مل من الوسط مع 10 ميكرومتر من مثبطات ROCK (Y27632) (انظر جدول المواد). ملاحظة: تجنب السحب المتكرر للخلايا المذابة لضمان أقصى قدر من استعادة الخلايا.</li>
	<li>قم بإزالة محلول الطلاء من البئر وأضف 50 ميكرولتر من الوسط مع 10 ميكرومتر من مثبط ROCK بسرعة.</li>
	<li>تأكد من عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد التربان الأزرق باستخدام مقياس الدم15.</li>
	<li>خلايا اللوحة في لوحة مطلية 96 بئرا بكثافة 100,000-150,000 خلية / سم2 ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة16.</li>
	<li>بعد 24 ساعة ، تأكد من أن الخلايا المتصلة بسطح اللوحة على اتصال بالخلايا الأخرى. ملاحظة: الخلايا المفردة تعيش بشكل سيئ في الثقافة طويلة الأجل وعادة ما تتصرف بشكل أكثر تباينا.</li>
	<li>استبدال وسط الصيانة قبل التسخين كل 2 أيام. ملاحظة: بالنسبة للعلاج الدوائي طويل الأجل ، تم تغيير LVNC iPSC-CM مع بدائل نصف متوسطة مع ، أو بدون ، أدوية جزيء صغير كل 2 أيام.</li>
</ol>2. التعبير عن مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا
<ol><li>بعد طلاء الخلايا لمدة 72 ساعة ، قم بإذابة مجموعات GECIs الفيروسية (انظر جدول المواد) على الجليد.</li>
	<li>قم بإعداد حل مخزون مجموعة فيروسية 2x مع وسيط الصيانة.</li>
	<li>تحضير الخلايا للعدوى عن طريق ضبط الحجم المتوسط إلى 100 ميكرولتر لكل بئر. أضف 100 ميكرولتر من المحلول الفيروسي المخلوط مسبقا واحتضنه لمدة 8-16 ساعة عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>استبدل بوسط 200 ميكرولتر تم تسخينه مسبقا بعد الحضانة.</li>
	<li>تصور تعبير GECIs 24 ساعة بعد النقل باستخدام نظام تصوير (انظر جدول المواد). ملاحظة: يصل مستوى التعبير إلى الحد الأقصى عند 48-72 ساعة بعد النقل. يمكن تصوير الخلايا من النقطة الزمنية 24 ساعة. ومع ذلك ، فإن الإشارات التي تم الحصول عليها من GECIs تستمر لأكثر من شهر واحد.</li>
	<li>الحفاظ على الخلايا في الحاضنة المرطبة قبل إجراء الفحوصات الوظيفية.</li>
	<li>إصابة iPSC-CMs (iPSC-CMs المشتقة من المريض من LVNC) بمجموعة فيروسية ChR2-K-GECO (انظر جدول المواد) في اليوم 25 بعد التمايز باستخدام بروتوكول العدوى (الخطوة 2.1-2.6).</li>
</ol>3. تصوير الكالسيوم القائم على الصبغة باستخدام Fluo-4
<ol><li>قم بإذابة مسحوق Fluo-4 (انظر جدول المواد) في DMSO كمحلول مخزون (5 mM).</li>
	<li>قم بتخفيف محلول المخزون إلى تركيز 10 ميكرومتر Fluo-4 في المخزن المؤقت ل Tyrode. ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت ل Tyrode من 1.0 جم / لتر من بيكربونات الصوديوم ، و 0.2 جم / لتر من كلوريد الكالسيوم ، و 0.1 جم / لتر من كلوريد المغنيسيوم ، و 0.2 جم / لتر من كلوريد البوتاسيوم ، و 8.0 جم / لتر من كلوريد الصوديوم ، و 0.05 جم / لتر من فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ، و 1.0 جم / لتر من D-glucose.</li>
	<li>استبدل نصف الوسط ب 10 ميكرومتر من محلول Fluo-4 (مع إعطاء تركيز نهائي قدره 5 ميكرومتر).</li>
	<li>احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.</li>
	<li>اغسل الخلايا باستخدام مخزن Tyrode العازل الذي تم تسخينه مسبقا واستبدله بالوسيط قبل الحصول على الصورة.</li>
	<li>ابدأ التسجيل باستخدام بروتوكول اكتساب البث. ملاحظة: اكتساب الدفق هو الحصول على الصور باستمرار دون فاصل زمني. يبلغ تردد ضرب iPSC-CM حوالي 1 هرتز ، ويستخدم بروتوكول اكتساب التيار هذا لجمع أنماط الضرب.</li>
</ol>4. الحصول على الصور والمقايسات الوظيفية لاختبار السمية وفحص النمط الظاهري
<ol><li>قم بتشغيل جميع أجهزة نظام التصوير عالي المحتوى (انظر جدول المواد).</li>
	<li>تحقق من أن درجة حرارة الغرفة تصل إلى 37 درجة مئوية ، مع مكملات 5٪ CO2 . حافظ على توازن النظام لمدة 2 ساعة قبل الحصول على الصورة. ملاحظة: الانجراف الحراري هو مشكلة كبيرة لملاحظات الخلايا الحية على المدى الطويل ، يمكن ل 1 درجة مئوية تغيير المستوى البؤري بمقدار ~ 1 ميكرومتر ، لذا فإن السماح للعدسة والمرحلة بالوصول إلى درجة الحرارة المستهدفة أمر ضروري قبل الحصول على الصورة.</li>
	<li>افتح برنامج التصوير (انظر جدول المواد) واختر إعداد اللوحة للوحة 96 بئرا.</li>
	<li>ضع صفيحة غير مغطاة ب 96 بئرا في الغرفة وقم بتحميلها بحلقة مانعة لتسرب الخلايا الحية في الأعلى. ملاحظة: حلقة ختم الخلايا الحية هي محول للوصول إلى التوازن البيئي.</li>
	<li>اختر عدسة هدف الغمر المائي 20x (الشكل 1 والشكل 2) و 60x (الشكل 3 والشكل 4) و 20x (الشكل 5) وفقا للدقة المكانية المطلوبة.</li>
	<li>اضبط التركيز البؤري لالتقاط صور واضحة قبل الاكتساب التجريبي.</li>
	<li>حدد 3-5 مناطق عشوائيا لكل بئر لتسجيل نشاط الكالسيوم. ملاحظة: يجب أن تتضمن كل منطقة 20 خلية على الأقل (n ≥ 20).</li>
	<li>اختر الفلاتر المناسبة للمؤشرات المختلفة. FITC 475/536 ل mNG-GECO و mtGCEPIA3 و Oria1-G-GECO ؛ Cy5 631/692 ل NIR-GECO2 ؛ ER 530/593 ل ER-LAR-GECO ؛ تكساس الأحمر 560/624 ل K-GECO.</li>
	<li>اضبط طاقة الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) المناسبة لكل قناة تصوير مستخدمة. ملاحظة: عند تحسين طاقة LED للحصول على التصوير بواسطة نسبة الإشارة (الكثافة المكتشفة للكائن) إلى نسبة الضوضاء (كثافة الخلفية المكتشفة)، يجب أن تكون نسبة S/N أعلى من 2. في هذا البروتوكول ، 10٪ من طاقة LED ل TRITC و FITC ؛ 20٪ ل Cy5 كان نموذجيا.</li>
	<li>اضبط وقت التعرض للكاميرا على 40 مللي ثانية (25 هرتز) كحد أقصى ومدة تسجيل تبلغ 30 ثانية للحصول على تيار لمراقبة انتقالات الكالسيوم التي أبلغت عنها مجسات mNG-GECO و K-GECO المعبر عنها في الخلايا العضلية القلبية (الشكل 1-3 والشكل 5). قم بزيادة طاقة LED إذا كانت الإشارة/الضوضاء <2 بمعدلات إطارات أعلى.</li>
	<li>بالنسبة للتحفيز البصري الوراثي (الشكل 2 والشكل 3C ، D) ، قم بتحسين الطاقة (عادة 5٪ -10٪) وتردد الضوء الأزرق عند 1 هرتز. ملاحظة: بشكل عام، يدق iPSC-CM البشري تلقائيا حول ~ 1 هرتز، ويحتاج المشغل إلى الوتيرة بشكل أسرع من المعدل التلقائي.</li>
	<li>إذا تم التخطيط لقياسات متسلسلة (الشكل 3) أو موسعة (الشكل 4) ، فتجنب السمية الضوئية بأي ثمن. قد يعني هذا تقليل شدة طاقة الإضاءة والتعويض عن ذلك عن طريق زيادة وقت تعرض الكاميرا ، على سبيل المثال ، إلى 100 مللي ثانية باستخدام بروتوكول الفاصل الزمني المستخدم للمراقبة في الوقت الفعلي ثلاثي القنوات لإشارات Ca2 + تحت الخلوية (الشكل 4).</li>
	<li>استخدم بروتوكول الاستغناء غير المتزامن لإضافة الكافيين 10 mM عبر نظام الموائع الدقيقة التلقائي (انظر جدول المواد) (الشكل 4). ملاحظة: يسمح بروتوكول التوزيع غير المتزامن بالحصول على الصور أثناء إضافة أدوية مثل الكافيين، دون وجود فجوات بين الصور.</li>
	<li>ابدأ الاستحواذ.</li>
</ol>5. إعداد جزيء صغير
<ol><li>أعد تعليق E4031 و dofetilide و verapamil في DMSO وقم بتخفيفها باستخدام المخزن المؤقت ل Tyrode. كان التركيز النهائي ل DMSO في الوسط 0.1٪ (v / v).</li>
	<li>تحضير المحاليل المركبة عند تركيز العمل المطلوب (أي 2x) والتوازن عند 37 درجة مئوية قبل الإضافة. ملاحظة: يعد تقليل تقلبات درجة الحرارة بعد الإضافة المتوسطة أمرا حيويا لأن الانقباض يعتمد على درجة الحرارة ، وتأثير تغير درجة الحرارة سريع.</li>
	<li>ترتيب المركبات إلى الهدف المقابل جيدا.</li>
	<li>أضف 100 ميكرولتر من مركبات القوة المزدوجة (2x) عبر نظام الموائع الدقيقة التلقائي (انظر جدول المواد) إلى الآبار وابدأ في الاستحواذ بعد فترة الحضانة المطلوبة (عادة 15 دقيقة).</li>
</ol>6. معالجة التصوير وتحليله
<ol><li>اعزل منطقة الإشارة عن الخلفية عن طريق اكتشاف ميزة النبض بمرور الوقت تلقائيا باستخدام البرنامج.</li>
	<li>استخدم برنامج تحليل ذروة الكالسيوم (انظر جدول المواد) لتحليل تردد الضرب (BPM) ، إشارة الذروة (السعة) ، مدة الكالسيوم العابرة 50٪ (CTD50) ، مدة عبور الكالسيوم 90٪ (CTD90) ، وقت الارتفاع ، ووقت الاضمحلال (الشكل 1C). ملاحظة: في هذه الإعدادات ، كان التبييض الضوئي واضحا خلال أول 10 ثوان ، ويتم تثبيت الإشارات بعد ذلك. وبالتالي ، تم تحليل ذروة الكالسيوم من 11-30 ثانية. في التسجيلات ثلاثية القنوات (الشكل 4) ، يتم تحديد محيط الخلية يدويا لقياس تغير الكثافة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Connor, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3R+principle:+Advancing+clinical+application+of+human+pluripotent+stem+cells.">The 3R principle: Advancing clinical application of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (2), 21 (2013).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Ovics, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development+and+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+disease+modeling+and+drug+toxicity+screening.">Drug development and the use of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for disease modeling and drug toxicity screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7320 (2020).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).</li><li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Ca(2+)+indicators+directly+inhibit+the+Na,K-ATPase+and+disrupt+cellular+functions.">Fluorescent Ca(2+) indicators directly inhibit the Na,K-ATPase and disrupt cellular functions.</a> Science Signaling. 11 (515), (2018).</li><li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+Ca2++indicator+based+on+circularly+permutated+sea+anemone+red+fluorescent+protein+eqFP578.">A genetically encoded Ca2+ indicator based on circularly permutated sea anemone red fluorescent protein eqFP578.</a> BMC Biology. 16 (1), 9 (2018).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+near-infrared+fluorescent+calcium+ion+indicator.">A genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicator.</a> Nature Methods. 16 (2), 171-174 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+Ca2++indicators+for+use+in+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum.">Red fluorescent genetically encoded Ca2+ indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum.</a> Biochemical Journal. 464 (1), 13-22 (2014).</li><li>Zarowny, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+high-performance+genetically+encoded+Ca2++indicator+based+on+mneongreen+fluorescent+protein.">and high-performance genetically encoded Ca2+ indicator based on mneongreen fluorescent protein.</a> ACS Sensors. 5 (7), 1959-1968 (2020).</li><li>Potekhina, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+with+genetically+encoded+fluorescent+sensors:+today+and+tomorrow.">Drug screening with genetically encoded fluorescent sensors: today and tomorrow.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 148 (2021).</li><li>Chang, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+phenotyping+and+drug+testing+in+single+cardiomyocytes+or+beta-cells+by+calcium+imaging+and+optogenetics.">Non-invasive phenotyping and drug testing in single cardiomyocytes or beta-cells by calcium imaging and optogenetics.</a> PLoS One. 12 (4), 0174181 (2017).</li><li>Chang, Y. -. F., Arai, Y., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+activation+during+detector+&amp;#34;dead+time&amp;#34;+enables+compatible+real-time+fluorescence+imaging.">Optogenetic activation during detector &amp;#34;dead time&amp;#34; enables compatible real-time fluorescence imaging.</a> Neuroscience Research. 73 (4), 341-347 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiomyocyte+and+fibroblast+interaction+using+layer-by-layer+deposition+facilitates+synchronisation+of+cardiac+macro+tissues.">Modulating cardiomyocyte and fibroblast interaction using layer-by-layer deposition facilitates synchronisation of cardiac macro tissues.</a> Soft Matter. 16 (2), 428-434 (2020).</li><li>Leonard, R. G., Talbert, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-channel+blocking+agents.">Calcium-channel blocking agents.</a> Clinical Pharmacology. 1 (1), 17-33 (1982).</li><li>Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+components+of+cardiac+delayed+rectifier+K++current.+Differential+sensitivity+to+block+by+class+III+antiarrhythmic+agents.">Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents.</a> The Journal of General Physiology. 96 (1), 195-215 (1990).</li><li>Lees-Miller, J. P., Duan, Y., Teng, G. Q., Duff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinant+of+high-affinity+dofetilide+binding+to+HERG1+expressed+in+Xenopus+oocytes:+Involvement+of+S6+sites.">Molecular determinant of high-affinity dofetilide binding to HERG1 expressed in Xenopus oocytes: Involvement of S6 sites.</a> Molecular Pharmacology. 57 (2), 367-374 (2000).</li><li>Kamiya, K., Niwa, R., Mitcheson, J. S., Sanguinetti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+HERG+channel+block.">Molecular determinants of HERG channel block.</a> Molecular Pharmacology. 69 (5), 1709-1716 (2006).</li><li>Fukushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+induction+and+long-term+maintenance+of+high+purity+ventricular+cardiomyocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Specific induction and long-term maintenance of high purity ventricular cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 15 (11), 0241287 (2020).</li><li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging.">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophysical Journal. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li><li>Suzuki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intraorganellar+Ca2++at+subcellular+resolution+using+CEPIA.">Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA.</a> Nature Communications. 5, 4153 (2014).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetically+encoded+near-infrared+fluorescent+calcium+ion+indicators+for+in+vivo+imaging.">Improved genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicators for in vivo imaging.</a> PLoS Biology. 18 (11), 3000965 (2020).</li><li>Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+single-channel+optical+recording+reveals+multiple+Orai1+gating+states+and+oscillations+in+calcium+influx.">Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 440-445 (2016).</li><li>Broyles, C. N., Robinson, P., Daniels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent,+bioluminescent,+and+optogenetic+approaches+to+study+excitable+physiology+in+the+single+cardiomyocyte.">Fluorescent, bioluminescent, and optogenetic approaches to study excitable physiology in the single cardiomyocyte.</a> Cells. 7 (6), 51 (2018).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Haery, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+technologies+and+methods+for+targeted+neuronal+manipulation.">Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).</li><li>Nieuwenhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+adeno-associated+viral+vector-mediated+transduction+of+the+corticospinal+tract:+Comparison+of+four+promoters.">Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: Comparison of four promoters.</a> Gene Therapy. 28 (1), 56-74 (2021).</li><li>Smith, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+promoter+function+and+cell-type-specific+expression+from+viral+vectors+in+the+nervous+system.">Characterization of promoter function and cell-type-specific expression from viral vectors in the nervous system.</a> Journal of Virology. 74 (23), 11254-11261 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+an+immune+cell-specific+chimeric+promoter+in+regulating+anti-PD-1+antibody+expression+in.">Safety and efficacy of an immune cell-specific chimeric promoter in regulating anti-PD-1 antibody expression in.</a> CAR T cells. Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 19, 14-23 (2020).</li></ol>

تقدمت LumiSTAR بطلب لحماية براءات الاختراع لاستخدام K-GECO ، NIR-GECO ، و LAR-GECO.

لإجراء فحص عالي الإنتاجية بنجاح، يجب توزيع الإشارات بالتساوي عبر وعاء الاستزراع، مما يضمن إمكانية تطبيق مناطق الاهتمام المختارة عشوائيا (ROIs) تلقائيا أثناء الحصول على التصوير. على الرغم من أن مؤشرات الكالسيوم الكيميائية تلبي هذا الشرط بسهولة ، إلا أن المجسات المشفرة وراثيا أنتجت تاريخيا بقع ، بدلا من صفائح ، من الإشارة التي تحد من استخدامها. يوفر استخدام نظام النقل الفيروسي مستويات تعبير عالية تبلغ27,28 ومستويات تعبير مكافئة لمؤشرات متعددة بين الخلايا المستهدفة مقارنة بطرق النقل التقليدية. قد تتطلب أنواع الخلايا المختلفة مروجين مختلفين ، وقد يحتاج اختيار نظام توصيل الجينات إلى التغيير وفقا لذلك29،30،31. في نماذج الخلايا غير المتجانسة، قد تختلف كفاءة النقل والتعبير في أنواع معينة من الخلايا. فمن ناحية، قد يحد هذا من التطبيق على خلايا معينة، ولكن يمكن استغلال هذه الظاهرة لتمييز خلايا معينة في نظام الزراعة المشتركة32.
التأثير الرئيسي لهذا النهج هو التحرر من العلاقة الفردية بين المجرب والعينة عن طريق الأتمتة. في تجربة قياسية متعددة الآبار ، لجمع البيانات في أربعة مواقع داخل بئر واحد ، نقدر أن الأمر يستغرق حوالي 15 ساعة في المجهر لجمع مقاطع فيديو 30 ثانية من لوحة بئر 96. في النظام الآلي ، يستغرق هذا ~ 4 ساعات. علاوة على ذلك ، يستغرق تحليل البيانات يدويا وقتا أطول بكثير من الحصول على البيانات. نظام التحليل المستخدم هنا أسرع بحوالي 200 مرة من المكافئ اليدوي. والنتيجة الصافية هي تحسين سير العمل وتوفير التكلفة والوقت بشكل كبير.
على النقيض من الخلايا العضلية القلبية الأولية المحملة بأصباغ الكالسيوم التي تبقى على قيد الحياة في حدود الساعات ، يمكن أن تسفر GECIs المعبر عنها في iPSC-CM عبر أنظمة التوصيل الفيروسي عن إشارة في نموذج تجريبي يعيش لبضعة أشهر. يمكن الحفاظ على هذه النماذج في شكل بئر متعددة وتتبعها في وقت واحد للتحليل التسلسلي في أنظمة التصوير عالية المحتوى التي تم تطويرها لفحص الجزيئات الصغيرة. ينتج عن ذلك منصة تجريبية بشرية بسيطة لاختبار تأثيرات الأدوية على مدى فترات أقرب إلى تلك التي يعاني منها المرضى (أسابيع أو أشهر) بدلا من الدقائق المستخدمة عادة في اختبارات السموم.
يمكن توسيع النظام لتقديم قياسات متعددة المعلمات من خلال تضمين GECIs ذات خصائص الانبعاثات المتميزة من الأخضر إلى الأشعة تحت الحمراء القريبة. تتطلب مثل هذه التجارب ضوء الإثارة المناسب ومجموعات المرشحات في التصميم التجريبي للحفاظ على الإشارات منفصلة. يتطلب التطبيق الواسع النطاق في سياق فحص الأدوية منصات تحليل قوية وفعالة بالإضافة إلى صرف الأدوية. على الرغم من أن النموذج الموصوف هنا يركز على استخدام مؤشرات الكالسيوم الديناميكية المتعددة ، إلا أنه يمكن تعديل ذلك إلى علامات هيكلية لشكل الخلية أو وظيفتها. عادة ما يكون من الأسهل تصورها لأنها تظهر القليل من التباين من نبض إلى فوز مقارنة بالتباين مائة ضعف في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا. قد يكون هذا النهج ذا قيمة خاصة للأمراض النادرة حيث قد يحتوي وسيط iPSC المشتق من المرضى على جميع الدوافع الجينية والمعدلات لحالة معينة والتي يمكن الحفاظ عليها في نموذج خلية قابل للتطوير ، مما يسهل اكتشاف الأدوية في مختلف الأمراض القائمة على الأنماط الظاهرية الخلوية التي يمكن تصورها بشكل مستقل عن الآلية البيولوجية الأساسية التي قد يكون من الصعب توضيحها.

تعتبر النماذج المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) القائمة على الإنسان حلا واعدا لأهداف 3Rs (الاستبدال والاختزال والصقل) المحددة للدراسات الحيوانية 1,2. تم استخدام الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC لنمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية لأنها تلخص الجوانب الأساسية لعلم الأحياء البشري3. تم استخدام تصوير الكالسيوم ، عادة مع الأصباغ الكيميائية ، لمراقبة النشاط الخلوي قبل وبعد العلاج بالعقاقير 4,5. ومع ذلك ، فإن مجسات استشعار الكالسيوم القائمة على الصبغة الكيميائية تمنع مباشرة Na و K-ATPase وتعطل الوظيفة الخلوية6. وبالتالي ، فإن تتبع نفس الخلايا على مدار ساعات أو أيام كان مشكلة عند استخدام الأصباغ الكيميائية. هنا ، يتم استخدام مجموعة من مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) 7،8،9،10 عبر طيف واسع من الإثارة / الانبعاثات وتقارب الكالسيوم لتشكيل منصة اختبار سمية القلب التي تقدم قياسات متعددة العضيات في الوقت الفعلي على مدى فترات طويلة من الزمن11.
لمواصلة تطوير مفهوم الفحص القائم على الكالسيوم عالي الإنتاجية في نموذج iPSC-CM خارج السياق الأكاديمي الموضح سابقا باستخدام أدوات مشفرة وراثيا للتحكم البصري وتصوير الكالسيوم عن طريق التعبير المشترك عن مؤشر الكالسيوم ذي الانزياح الأحمر ، R-GECO أو K-GECO مع أداة وراثية بصرية ،ChR2 12,13 ، تم إنشاء مجموعات فيروسية جاهزة. من خلال نقل التصوير إلى أداة عالية المحتوى مجهزة بنظام تلقائي للسوائل الدقيقة ، يتم وضع طبقات من السحب أحادي القناة للإضافة المركبة فوق تصوير الخلايا الحية. وأخيرا ، يتم تحسين وأتمتة كلا الجانبين الحاسمين للمسار التجريبي ، ومعالجة الصور ، والتحليل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>auto microfluidic system</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td>A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1096780100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dofetilide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PZ0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4031</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-LAR-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AA001a</td>
			<td>Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Chmical calcium sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-CMs Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CMS-002</td>
			<td>iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium)</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CMS-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AA005a</td>
			<td>Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LumiCAL software</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>LUCS01a</td>
			<td>Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL008a</td>
			<td>Brighter green GECI packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-GCEPIA3 viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL011a</td>
			<td>GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AV004a</td>
			<td>Near infrared GECI packed into viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orai1-GGECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL010a</td>
			<td>GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput optical controlling and recording calcium signal in ipsc-derived cardiomyocytes for toxicity testing and phenotypic drug screening

من المهم فهم كيفية عمل الخلايا القابلة للإثارة في الصحة والمرض وكيف يمكن تغيير هذا السلوك بواسطة جزيئات صغيرة أو التلاعب الجيني. يمكن الجمع بين مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) مع نوافذ انبعاث متعددة (على سبيل المثال ، للمراقبة المتزامنة للأحداث دون الخلوية المتميزة) أو استخدامها في التطبيقات الموسعة مع المحركات الأخرى المعتمدة على الضوء في الخلايا القابلة للاستثارة (على سبيل المثال ، الجمع بين التحكم البصري الوراثي المشفر وراثيا مع مؤشرات الكالسيوم المتوافقة مع الطيف). وقد استخدمت هذه الأساليب في الخلايا العصبية الأولية أو المشتقة من الخلايا الجذعية، والخلايا العضلية القلبية، وخلايا بيتا البنكرياسية. ومع ذلك، كان من الصعب زيادة إنتاجية، أو مدة الملاحظة، لهذه النهج بسبب القيود المفروضة على الأدوات، وبرامج التحليل، وأداء المؤشرات، وكفاءة توصيل الجينات. هنا ، يتم الجمع بين GECI الأخضر عالي الأداء ، mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) ، و GECI ، K-GECO ، ذو الانزياح الأحمر ، مع التحكم البصري الجيني لتحقيق التحكم البصري الكامل وتصور النشاط الخلوي بتنسيق تصوير عالي الإنتاجية باستخدام نظام تصوير عالي المحتوى. يتم عرض التطبيقات التي توضح اختبار السمية القلبية وفحص الأدوية المظهرية باستخدام iPSC-CMs الصحية والمشتقة من المريض. بالإضافة إلى ذلك ، تقتصر التقييمات متعددة المعلمات باستخدام مجموعات من متغيرات مؤشر التقارب الطيفي والكالسيوم (NIR-GECO ، LAR-GECO ، و MTGCEPIA أو Orai1-G-GECO) على مقصورات خلوية مختلفة كما يتم عرضها في نموذج iPSC-CM.

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening at JoVE.com

High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening

يصف هذا البروتوكول التحكم البصري الكامل ومراقبة النشاط الخلوي المثار في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC (iPSC-CMs) لفحص الأدوية عالية الإنتاجية واختبار السمية. يتم عرض القياس الكمي متعدد المعلمات لأنماط النمط الظاهري في الزمان والمكان. يتم إثبات الآثار طويلة الأجل للعقاقير على مدى ساعات ، أو القياسات المتسلسلة على مدى أيام.

التحكم البصري عالي الإنتاجية وتسجيل إشارة الكالسيوم في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC لاختبار السمية وفحص الأدوية المظهرية

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. ...

نحن نعرض طريقة لا حصر لها لجميع التحكم البصري ومراقبة النشاط الخلوي المثير في الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC لفحص الأدوية عالية الإنتاجية واختبار السمية. تمكين القياس الكمي متعدد المعلمات لأنماط النمط الظاهري في الزمان والمكان ، والسماح بمراقبة تأثير الأدوية على مدار ساعات أو أيام. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أنواع مختلفة من الخلايا ، مثل الخلايا العصبية أو خلايا بيتا ، للفحص الوظيفي واختبار السمية.سيوضح الإجراء وان تشي سو ، مهندس التصوير الحيوي من مختبري. قم بإعداد اللوحة متعددة الآبار قبل إزالة الخلايا العضلية القلبية iPSC من التخزين البارد للذوبان. قم بتغطية كل بئر من صفيحة البئر الدقيقة 96 ب 100 ميكرولتر من محلول الجيلاتين بنسبة 0.02٪ مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الفيبرونيكتين لتغطية جميع الأسطح جيدا.انقل الخلايا العضلية القلبية iPSC من خزان تخزين النيتروجين السائل إلى حمام مائي 37 درجة مئوية. خذ القارورة إلى خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية ، وانقل المحتويات برفق إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 ملليلتر يحتوي على تسعة ملليلترات من وسط درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي للخلايا في 200 مرة G لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة.تخلص من المادة الفائقة بواسطة الماصة ، وأعد تعليق الخلايا بلطف في ملليلتر واحد من الوسط باستخدام 10 مثبطات ميكرومولار ROCK Y27632. قامت خلايا الصفائح بطلاء 96 لوحة بئر بكثافة 100،000 إلى 150،000 خلية لكل سنتيمتر مربع ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد 24 ساعة ، تأكد من أن الخلايا المتصلة بسطح اللوحة على اتصال بالخلايا الأخرى.بعد طلاء الخلايا لمدة 72 ساعة تذوب مجموعات GECIs الفيروسية على الجليد. قم بإعداد حل مخزون مجموعة فيروسية مزدوجة القوة باستخدام وسيط الصيانة. قم بإعداد الخلايا للعدوى عن طريق ضبط الحجم المتوسط إلى 100 ميكرولتر لكل بئر.أضف 100 ميكرولتر من المحلول الفيروسي المخلوط مسبقا إلى الآبار ، واحتضنها لمدة ثماني إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، استبدل ب 200 ميكرولتر من الوسط المسخن مسبقا. تصور تعبير GECIs بعد 24 ساعة من النقل باستخدام نظام تصوير.الحفاظ على الخلايا في الحاضنة المرطبة قبل إجراء الفحوصات الوظيفية. قم بتشغيل جميع أجهزة نظام التصوير عالي المحتوى. تحقق من أن درجة حرارة الغرفة تصل إلى 37 درجة مئوية مع مكملات ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.افتح برنامج التصوير ، واختر إعداد اللوحة للوحة 96 بئرا. ضع صفيحة بئر 96 غير مغطاة في الغرفة ، وقم بتحميل حلقة ختم الخلايا الحية في الأعلى. اختر العدسة الموضوعية للغمر بالماء 20X و 60X و 20X ، وفقا للدقة المكانية المطلوبة.اضبط التركيز البؤري لالتقاط صور واضحة قبل الاكتساب التجريبي. حدد ثلاث إلى خمس مناطق عشوائيا لكل بئر لتسجيل نشاط الكالسيوم. اختر الفلاتر المناسبة للمؤشرات المختلفة.اضبط طاقة الصمام الثنائي الباعث للضوء المناسبة لكل قناة تصوير مستخدمة. اضبط وقت التعرض للكاميرا على 40 مللي ثانية أو 25 هرتز كحد أقصى، ومدة تسجيل تبلغ 30 ثانية للحصول على التيار لمراقبة انتقالات الكالسيوم، التي أبلغت عنها مجسات MNG-GECO وK-GECO المعبر عنها في الخلايا العضلية القلبية. قم بزيادة طاقة LED إذا كانت نسبة الإشارة إلى الضوضاء أقل من اثنين بمعدلات إطارات أعلى.للتحفيز البصري الوراثي ، قم بتحسين قوة وتردد الضوء الأزرق عند هرتز واحد ، وابدأ في الاكتساب. أعد تعليق E4031 Dofetilide و Verapamil في DMSO ، وقم بتخفيفهما باستخدام المخزن المؤقت ل Tyrode. ترتيب المركبات إلى الهدف المقابل جيدا.أضف 100 ميكرولتر من مركب القوة المزدوجة عبر نظام الموائع الدقيقة التلقائي إلى الآبار ، وابدأ في الاستحواذ بعد فترة الحضانة المطلوبة. اعزل منطقة الإشارة عن الخلفية عن طريق الكشف تلقائيا عن ميزة النبضات ، مع مرور الوقت ، باستخدام البرنامج. استخدم برنامج تحليل ذروة الكالسيوم لتحليل تردد الضرب ، وإشارة الذروة ، ومدة عبور الكالسيوم 50٪ مدة الكالسيوم العابرة 90٪ وقت الارتفاع ، ووقت الاضمحلال.يتم عرض ملاحظة تذبذب الكالسيوم التلقائي في NMG-GECO المعبر عنه بواسطة الخلايا العضلية القلبية المشتقة من iPSC مع أو بدون علاجات دوائية في الفيديو. أظهرت الآثار الحركية التي تم الحصول عليها باستخدام MNG-GECO أن مثبطات قناة الأيونات الجزيئية الصغيرة Verapamil و Dofetilide و E4031 أثرت على انتقالات الكالسيوم كما هو متوقع. لتقييم استجابة جرعة E4031 في ظل ظروف موحدة وسريعة ، تم التحكم في قناة روديبسين-2 ، و K-GECO التي تعبر عن iPSC CMs بصريا باستخدام هرتز واحد ونبضات ضوء 470 نانومتر ، وتمت ملاحظتها باستخدام إشارة K-GECO الحمراء.تحدث التخفيضات التدريجية في سعة الذروة ، والزيادة في وقت اضمحلال عابرات الكالسيوم ، مع زيادة تركيزات E4031. كان التأثير المعتمد على الجرعة من E4031 أكثر وضوحا للتخفيضات في سعة الذروة. تظل عابرات الكالسيوم الواضحة مرئية بعد شهر من النقل الفيروسي ، أو بدون الضوء الإضافي المستخدم في الوتيرة البصرية.يصور الرسم البياني دواء يبدو أنه يزيد من معدل الضربات ، ويحدد فترة الانكماش ، ويزيد من سعة الكالسيوم العابرة ، في وضع LVNC iPSC CM. يتغير أيضا تباين تردد النبض ، والتأثير اللاحق على مدة الكالسيوم العابرة ، حيث يتم الحفاظ على iPSC CM في الثقافة. تم تطوير العديد من GECIs ، بما في ذلك ، ER LAR-GECO ، MTG-SEPIA ، و NIR-GECO ، للتعبير بشكل فردي ، أو في تركيبة في نماذج الخلايا لقياس نشاط الكالسيوم في الوقت الفعلي الناشئ في الشبكة الإندوبلازمية ، والشبكة الساركوبلازمية ، والميتوكوندريا ، والسيتوسول ، على التوالي.يمكن دمج GECIs في نموذج iPSC CM لدراسة مخازن الكالسيوم المختلفة داخل الخلايا. أظهر K-GECO الذي يعبر عن الخلايا العضلية القلبية سلوكا ثابتا للضرب بمرور الوقت. ومع ذلك ، أثر تحميل Fluo-4 على كل من تردد الإيقاع و CTD في هذا النموذج ، مما يشير إلى أن Fluo-4 ، نفسه ، قد يؤثر على نتائج مثل هذه التجارب.نحن نقدم طريقة بسيطة لدراسة ملامح النمط الظاهري من الخلايا الضابطة والمشتقة من المريض ، في حين أن iPSC الوسيط قد يلقي الضوء على اكتشاف الأدوية في أمراض مختلفة.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

سمل العيون الماوس لPhenotyping عالي الإنتاجية عن بعد

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

الكشف عن سرطان الجلد باستخدام المعدلات اسماك الزرد الموديل ورم الأصليين

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

A تعدد في منصة الفرز القائم على luciferase المراسل لاستجواب المرتبطة بالسرطان نقل الإشارة في الخلايا المستزرعة

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

نظام عضوي إنتاجية عالية لتوصيف الدواء حساسية خلايا المايلوما المتعددة الابتدائية

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

وحديثي الولادة ماوس الحبل الشوكي ضغط إصابة نموذج

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Echocardiographic Approaches and Protocols for Comprehensive Phenotypic Characterization of Valvular Heart Disease in Mice

النهج والبروتوكولات تخطيط صدى القلب لالشامل التوصيف المظهري لأمراض القلب الصمامية في الفئران

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

تقييم الشبكة شبكية الكالسيوم إزالة الكالسيوم االنبساطي الاحتياطي وداخل الخلايا في Cardiomyocytes البطين المعزولة

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

أسلوب LC-MS/MS الأمثل لتحليل العينات السريرية إيفاكافتور، والايضات الرئيسية، ولوماكافتور في السوائل البيولوجية لمرضى التليف الكيسي الفائق

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

دراسة إشارة الأنسولين طائي لتعصب الجلوكوز الطرفية مع نظام حقن المخدرات مستمرة في الدماغ الماوس

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...