Name: high-throughput optical controlling and recording calcium signal in ipsc-derived cardiomyocytes for toxicity testing and phenotypic drug screening
Uploaded: 2022-03-31T13:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening at JoVE.com

Vi takker professor Robert Campbell ved University of Tokyo for at dele materialet og værdifulde diskussion; Dr. Chia-Lin Ho i Molecular Device til teknisk support.

Venstre ventrikulær ikke-komprimeret kardiomyopati (LVNC) patient iPSC-afledte kardiomyocytter (iPSC-CM) blev leveret af National Taiwan University Hospital. Indsamlingen af patientprøver til omprogrammering til iPSC og vedligeholdelsesprotokollerne14 til forskningsformål fulgte WMA-erklæringen fra Helsinki (etiske principper for medicinsk forskning, der involverer mennesker) og blev godkendt af Institutional Review Board: Research Ethics Committee Office at NTUH (#201612099RINC). Andre iPSC-CM'er blev hentet fra kommercielle leverandører. Brugen af iPSC-derivater kræver ikke specifikke tilladelser i vores institution.
1. iPSC-afledt kardiomyocytforberedelse
<ol><li>Forbered multibrøndpladen, før iPSC-CM fjernes fra kølerummet til optøning. Overtræk hver brønd på mikropladen med 96 brønde med 100 μL 50 μg/ml fibronectin/0,2% gelatineopløsning (se Materialetabel) for at dække alle overflader grundigt.</li>
	<li>Pladen inkuberes ved 37 °C i 1 time i en befugtet inkubator.</li>
	<li>Varm mediet (se Materialetabel) op til stuetemperatur i 30 minutter før celleoptøning. BEMÆRK: Den nuværende protokol beskriver stuetemperatur som 25 °C.</li>
	<li>IPSC-CM overføres fra lagertanken til flydende nitrogen til et 37 °C vandbad. BEMÆRK: iPS-CM'er sendes typisk på tøris af akademiske eller kommercielle kilder. De overføres til opbevaring af flydende nitrogen ved modtagelse indtil brug.</li>
	<li>Fjern hætteglasset, før isen smelter helt, og sprøjt hætteglasset med 75% ethanol.</li>
	<li>Tag hætteglasset til et klasse II biosikkerhedsskab, og overfør forsigtigt indholdet til et nyt 15 ml konisk rør indeholdende 9 ml rumtemperaturmedium.</li>
	<li>Centrifuge cellerne ved 200 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.</li>
	<li>Supernatanten kasseres med pipette, og cellerne gensuspenderes forsigtigt i 1 ml medium med 10 μM ROCK-hæmmer (Y27632) (se Materialetabel). BEMÆRK: Undgå gentagen pipettering af optøede celler for at sikre maksimal cellegendannelse.</li>
	<li>Fjern belægningsopløsningen fra brønden, og tilsæt hurtigt 50 μL medium med 10 μM ROCK-hæmmer.</li>
	<li>Bekræft antallet af levedygtige celler ved hjælp af trypanblå udelukkelsesmetode med et hæmocytometer15.</li>
	<li>Pladeceller i belagt 96-brøndplade med en densitet på 100.000-150.000 celle / cm2, i henhold til producentens anvisninger16.</li>
	<li>Efter 24 timer skal du sikre dig, at cellerne, der er fastgjort til pladens overflade, er i kontakt med andre celler. BEMÆRK: Enkeltceller overlever dårligt i langvarig kultur og opfører sig typisk mere varierende.</li>
	<li>Udskift forvarmet vedligeholdelsesmedium hver 2. dag. BEMÆRK: Til langvarig lægemiddelbehandling blev LVNC iPSC-CM ændret med halve mellemstore udskiftninger med eller uden lægemidler med små molekyler hver 2. dag.</li>
</ol>2. Angivelse af genetisk kodede calciumindikatorer
<ol><li>Efter plettering af cellerne i 72 timer, optø GECIs virale sæt (se Materialetabel) på is.</li>
	<li>Forbered en 2x viral kit-lageropløsning med vedligeholdelsesmediet.</li>
	<li>Forbered cellerne til infektion ved at justere medievolumenet til 100 μL pr. Brønd. Der tilsættes 100 μL af den forblandede virale opløsning og inkuberes i 8-16 timer ved 37 °C.</li>
	<li>Erstat med 200 μL forvarmet medium efter inkubation.</li>
	<li>Visualiser GECIs-udtrykket 24 timer efter transduktion ved hjælp af et billeddannelsessystem (se Materialetabel). BEMÆRK: Udtryksniveauet når maksimum ved 48-72 timer efter transduktion. Celler kan afbildes fra 24 timers tidspunktet. Signalerne fra GECI'er opretholdes dog i mere end en måned.</li>
	<li>Vedligehold celler i den befugtede inkubator, før funktionelle assays udføres.</li>
	<li>Inficere iPSC-CM'erne (LVNC-patientafledte iPSC-CM'er) med ChR2-K-GECO-viralt kit (se materialetabel) på dag 25 efter differentiering ved hjælp af infektionsprotokollen (trin 2.1-2.6).</li>
</ol>3. Farvestofbaseret calciumbilleddannelse ved hjælp af Fluo-4
<ol><li>Opløs Fluo-4 pulver (se Materialetabel) i DMSO som stamopløsning (5 mM).</li>
	<li>Stamopløsningen fortyndes til en koncentration på 10 μM Fluo-4 i Tyrodes buffer. BEMÆRK: Tyrodes buffer består af 1,0 g / L natriumbicarbonat, 0,2 g / l calciumchlorid, 0,1 g / l magnesiumchlorid, 0,2 g / l kaliumchlorid, 8,0 g / l natriumchlorid, 0,05 g / l natriumphosphatmonobasisk og 1,0 g / l D-glucose.</li>
	<li>Halvmediet udskiftes med 10 μM Fluo-4-opløsning (hvilket giver en slutkoncentration på 5 μM).</li>
	<li>Inkuber cellerne ved 37 °C i 30 min.</li>
	<li>Vask cellerne med forvarmet Tyrodes buffer og erstat dem med mediet før billedoptagelse.</li>
	<li>Start optagelse med streamanskaffelsesprotokollen. BEMÆRK: Stream acquisition erhverver løbende billeder uden intervaltid. Slagfrekvensen for iPSC-CM er ca. 1 Hz, og denne strømoptagelsesprotokol bruges til at indsamle slagmønstre.</li>
</ol>4. Billedoptagelse og funktionelle assays til toksicitetstest og fænotypisk screening
<ol><li>Tænd for alle enheder i billedbehandlingssystemet med højt indhold (se Materialetabel).</li>
	<li>Kontroller, at kammertemperaturen når 37 °C, med 5% CO2 -tilskud. Hold systemet i ligevægt i 2 timer før billedoptagelse. BEMÆRK: Termisk drift er et væsentligt problem for langsigtede levende celleobservationer, 1 ° C kan ændre brændplanet med ~ 1 μm, så det er vigtigt at give linsen og trinnet mulighed for at nå måltemperaturen før billedoptagelse.</li>
	<li>Åbn billedbehandlingssoftwaren (se Materialetabel), og vælg pladeindstillingen for en 96-brøndsplade.</li>
	<li>Anbring en ikke-låget 96-brøndplade i kammeret og læg med den levende celleforseglingsring ovenpå. BEMÆRK: Den levende celleforseglingsring er en adapter til at nå miljømæssig ligevægt.</li>
	<li>Vælg 20x (figur 1 og figur 2), 60x (figur 3 og figur 4) og 20x (figur 5) vandsænkningsobjektiv i henhold til den krævede rumlige opløsning.</li>
	<li>Juster fokus for at tage klare billeder før eksperimentel erhvervelse.</li>
	<li>Vælg 3-5 regioner tilfældigt pr. brønd til registrering af calciumaktivitet. BEMÆRK: Hver region skal indeholde mindst 20 celler (n ≥ 20).</li>
	<li>Vælg passende filtre til forskellige indikatorer. FITC 475/536 for mNG-GECO, mtGCEPIA3 og Oria1-G-GECO Cy5-631/692 for NIR-GECO2; ER 530/593 for ER-LAR-GECO; Texas Red 560/624 til K-GECO.</li>
	<li>Indstil den passende lysdiode (LED) for hver anvendt billedkanal. BEMÆRK: Når du optimerer LED-effekt til billedoptagelse efter signal (detekteret intensitet af objekt) til støj (detekteret intensitet af baggrund) forhold, skal S / N-forholdet være højere end 2. I denne protokol, 10% LED-strøm til TRITC og FITC; 20% for Cy5 var typisk.</li>
	<li>Kameraets eksponeringstid indstilles til maksimalt 40 ms (25 Hz) og en optagelsesvarighed på 30 sfor stream-anskaffelse for at observere calciumtransienter rapporteret af mNG-GECO- og K-GECO-sonder udtrykt i kardiomyocytter (figur 1-3 og figur 5). Forøg LED-effekten, hvis signalet/støjen er <2 ved højere billedhastigheder.</li>
	<li>Til optogenetisk stimulering (figur 2 og figur 3C, D) optimeres effekten (typisk 5% -10%) og frekvensen af blåt lys ved 1 Hz. BEMÆRK: Generelt slår menneskelig iPSC-CM spontant omkring ~ 1 Hz, og operatøren skal gå hurtigere end den spontane hastighed.</li>
	<li>Hvis der planlægges sekventielle (figur 3) eller udvidede (figur 4) målinger, skal du for enhver pris undgå fototoksicitet. Dette kan betyde at reducere belysningseffektintensiteten og kompensere for dette ved at øge kameraets eksponeringstid, for eksempel til 100 ms med time-lapse-protokollen, der bruges til trekanals realtidsobservation af subcellulære Ca2+ signaler (figur 4).</li>
	<li>Brug den asynkrone dispenseringsprotokol til 10 mM koffeintilsætning via det automatiske mikrofluidiksystem (se Materialetabel) (figur 4). BEMÆRK: Den asynkrone dispenseringsprotokol tillader billedoptagelse at forekomme, mens lægemidler som koffein tilsættes uden mellemrum mellem billeder.</li>
	<li>Start erhvervelse.</li>
</ol>5. Forberedelse af små molekyler
<ol><li>Resuspender E4031, dofetilid og verapamil i DMSO og fortynd dem med Tyrodes buffer. Den endelige koncentration af DMSO i mediet var 0,1 % (v/v).</li>
	<li>De sammensatte opløsninger fremstilles ved den dobbelte (dvs. 2x) ønskede arbejdskoncentration og ækvilibreres ved 37 °C før tilsætning. BEMÆRK: Minimering af temperaturudsving efter medium tilsætning er afgørende, da kontraktilitet er temperaturafhængig, og effekten af at ændre temperaturen er hurtig.</li>
	<li>Arranger forbindelser til det tilsvarende mål godt.</li>
	<li>Tilsæt 100 μL af dobbeltstyrkeforbindelserne (2x) via det automatiske mikrofluidiksystem (se Materialetabel) i brøndene og start anskaffelsen efter den ønskede (typisk 15 min) inkubationsperiode.</li>
</ol>6. Billedbehandling og analyse
<ol><li>Isoler signalområdet fra baggrunden ved automatisk at registrere pulsens funktion over tidsomdrejning med softwaren.</li>
	<li>Brug calciumtopanalysesoftwaren (se materialetabel) til at analysere slagfrekvens (BPM), topsignal (amplitude), calciumtransient varighed 50% (CTD50), calciumtransient varighed 90% (CTD90), stigningstid og henfaldstid (figur 1C). BEMÆRK: I disse indstillinger var fotoblegning tydelig i løbet af de første 10 sekunder, og signalerne stabiliseres derefter. Således blev calciumtoppen analyseret fra 11-30 s. I trekanalsoptagelser (figur 4) er cellekonturen omkranset manuelt til måling af intensitetsændring.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Connor, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3R+principle:+Advancing+clinical+application+of+human+pluripotent+stem+cells.">The 3R principle: Advancing clinical application of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (2), 21 (2013).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Ovics, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development+and+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+disease+modeling+and+drug+toxicity+screening.">Drug development and the use of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for disease modeling and drug toxicity screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7320 (2020).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).</li><li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Ca(2+)+indicators+directly+inhibit+the+Na,K-ATPase+and+disrupt+cellular+functions.">Fluorescent Ca(2+) indicators directly inhibit the Na,K-ATPase and disrupt cellular functions.</a> Science Signaling. 11 (515), (2018).</li><li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+Ca2++indicator+based+on+circularly+permutated+sea+anemone+red+fluorescent+protein+eqFP578.">A genetically encoded Ca2+ indicator based on circularly permutated sea anemone red fluorescent protein eqFP578.</a> BMC Biology. 16 (1), 9 (2018).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+near-infrared+fluorescent+calcium+ion+indicator.">A genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicator.</a> Nature Methods. 16 (2), 171-174 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+Ca2++indicators+for+use+in+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum.">Red fluorescent genetically encoded Ca2+ indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum.</a> Biochemical Journal. 464 (1), 13-22 (2014).</li><li>Zarowny, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+high-performance+genetically+encoded+Ca2++indicator+based+on+mneongreen+fluorescent+protein.">and high-performance genetically encoded Ca2+ indicator based on mneongreen fluorescent protein.</a> ACS Sensors. 5 (7), 1959-1968 (2020).</li><li>Potekhina, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+with+genetically+encoded+fluorescent+sensors:+today+and+tomorrow.">Drug screening with genetically encoded fluorescent sensors: today and tomorrow.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 148 (2021).</li><li>Chang, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+phenotyping+and+drug+testing+in+single+cardiomyocytes+or+beta-cells+by+calcium+imaging+and+optogenetics.">Non-invasive phenotyping and drug testing in single cardiomyocytes or beta-cells by calcium imaging and optogenetics.</a> PLoS One. 12 (4), 0174181 (2017).</li><li>Chang, Y. -. F., Arai, Y., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+activation+during+detector+&amp;#34;dead+time&amp;#34;+enables+compatible+real-time+fluorescence+imaging.">Optogenetic activation during detector &amp;#34;dead time&amp;#34; enables compatible real-time fluorescence imaging.</a> Neuroscience Research. 73 (4), 341-347 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiomyocyte+and+fibroblast+interaction+using+layer-by-layer+deposition+facilitates+synchronisation+of+cardiac+macro+tissues.">Modulating cardiomyocyte and fibroblast interaction using layer-by-layer deposition facilitates synchronisation of cardiac macro tissues.</a> Soft Matter. 16 (2), 428-434 (2020).</li><li>Leonard, R. G., Talbert, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-channel+blocking+agents.">Calcium-channel blocking agents.</a> Clinical Pharmacology. 1 (1), 17-33 (1982).</li><li>Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+components+of+cardiac+delayed+rectifier+K++current.+Differential+sensitivity+to+block+by+class+III+antiarrhythmic+agents.">Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents.</a> The Journal of General Physiology. 96 (1), 195-215 (1990).</li><li>Lees-Miller, J. P., Duan, Y., Teng, G. Q., Duff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinant+of+high-affinity+dofetilide+binding+to+HERG1+expressed+in+Xenopus+oocytes:+Involvement+of+S6+sites.">Molecular determinant of high-affinity dofetilide binding to HERG1 expressed in Xenopus oocytes: Involvement of S6 sites.</a> Molecular Pharmacology. 57 (2), 367-374 (2000).</li><li>Kamiya, K., Niwa, R., Mitcheson, J. S., Sanguinetti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+HERG+channel+block.">Molecular determinants of HERG channel block.</a> Molecular Pharmacology. 69 (5), 1709-1716 (2006).</li><li>Fukushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+induction+and+long-term+maintenance+of+high+purity+ventricular+cardiomyocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Specific induction and long-term maintenance of high purity ventricular cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 15 (11), 0241287 (2020).</li><li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging.">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophysical Journal. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li><li>Suzuki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intraorganellar+Ca2++at+subcellular+resolution+using+CEPIA.">Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA.</a> Nature Communications. 5, 4153 (2014).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetically+encoded+near-infrared+fluorescent+calcium+ion+indicators+for+in+vivo+imaging.">Improved genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicators for in vivo imaging.</a> PLoS Biology. 18 (11), 3000965 (2020).</li><li>Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+single-channel+optical+recording+reveals+multiple+Orai1+gating+states+and+oscillations+in+calcium+influx.">Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 440-445 (2016).</li><li>Broyles, C. N., Robinson, P., Daniels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent,+bioluminescent,+and+optogenetic+approaches+to+study+excitable+physiology+in+the+single+cardiomyocyte.">Fluorescent, bioluminescent, and optogenetic approaches to study excitable physiology in the single cardiomyocyte.</a> Cells. 7 (6), 51 (2018).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Haery, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+technologies+and+methods+for+targeted+neuronal+manipulation.">Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).</li><li>Nieuwenhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+adeno-associated+viral+vector-mediated+transduction+of+the+corticospinal+tract:+Comparison+of+four+promoters.">Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: Comparison of four promoters.</a> Gene Therapy. 28 (1), 56-74 (2021).</li><li>Smith, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+promoter+function+and+cell-type-specific+expression+from+viral+vectors+in+the+nervous+system.">Characterization of promoter function and cell-type-specific expression from viral vectors in the nervous system.</a> Journal of Virology. 74 (23), 11254-11261 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+an+immune+cell-specific+chimeric+promoter+in+regulating+anti-PD-1+antibody+expression+in.">Safety and efficacy of an immune cell-specific chimeric promoter in regulating anti-PD-1 antibody expression in.</a> CAR T cells. Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 19, 14-23 (2020).</li></ol>

LumiSTAR har ansøgt om patentbeskyttelse af brugen af K-GECO, NIR-GECO og LAR-GECO.

For at kunne udføre screening med høj kapacitet skal signaler fordeles jævnt over kulturbeholderen, hvilket garanterer, at tilfældigt udvalgte interesseområder (ROI'er) kan anvendes automatisk under billeddannelse. Selvom kemiske calciumindikatorer let opfylder dette krav, har genetisk kodede sonder historisk produceret pletter snarere end ark af signal, der begrænser deres anvendelse. Brugen af et viralt transduktionssystem giver høje27,28 og ækvivalente ekspressionsniveauer af flere indikatorer blandt målcellerne sammenlignet med konventionelle transfektionsmetoder. Forskellige celletyper kan kræve forskellige promotorer, og valget af genleveringssystem skal muligvis ændres i overensstemmelse hermed 29,30,31. I heterogene cellemodeller kan transduktions- og ekspressionseffektivitet være forskellig i specifikke celletyper. På den ene side kan dette begrænse anvendelsen til bestemte celler, men fænomenet kan udnyttes til at skelne bestemte celler i et samkultursystem32.
Hovedvirkningen af denne tilgang er frigørelsen fra en-til-en-forholdet mellem eksperimentatoren og prøven ved automatisering. I et standard multi-well eksperiment, for at indsamle data på fire positioner inden for en enkelt brønd, anslår vi, at det tager cirka 15 timer ved mikroskopet at indsamle 30 s videoer fra en 96 brøndplade. I det automatiserede system tager dette ~ 4 timer. Desuden tager analyse af data manuelt langt længere tid end dataindsamling. Analysesystemet, der anvendes her, er ca. 200 gange hurtigere end den manuelle ækvivalent. Nettoresultatet er en forbedret arbejdsgang og høje omkostnings- og tidsbesparelser.
I modsætning til primære kardiomyocytter fyldt med calciumfarvestoffer, der overlever i rækkefølgen af timer, kan GECI'er udtrykt i iPSC-CM'er via virale leveringssystemer give et signal i en eksperimentel model, der lever i et par måneder. Disse modeller kan vedligeholdes i et multi-brøndformat og spores samtidigt til seriel analyse i billeddannelsessystemer med højt indhold udviklet til screening af små molekyler. Dette producerer en simpel human eksperimentel platform til at teste lægemiddeleffekter over varigheder tættere på dem, der opleves af patienter (uger eller måneder) snarere end de minutter, der typisk anvendes i toksikologiske assays.
Systemet kan udvides til at levere multiparametermålinger ved at inkludere GECI'er med forskellige emissionsegenskaber fra grøn til nær infrarød. Sådanne eksperimenter kræver korrekt excitationslys og filtersæt i det eksperimentelle design for at holde signaler adskilt. Bred anvendelse i en lægemiddelscreeningskontekst kræver robuste og effektive analyseplatforme ud over lægemiddeldispensering. Selvom den model, der er beskrevet her, fokuserer på brugen af flere dynamiske calciumindikatorer, kan dette ændres til strukturelle markører for celleform eller funktion. Disse er typisk lettere at visualisere, da de viser lidt beat-to-beat variabilitet sammenlignet med den hundrede gange variation i intracellulær calciumkoncentration. Denne tilgang kan være særlig værdifuld for sjældne sygdomme, hvor iPSC-mellemproduktet afledt af patienter kan indeholde alle de genetiske drivkræfter og modifikatorer af en bestemt tilstand, som kan bevares i en skalerbar cellemodel, hvilket letter lægemiddelopdagelse i forskellige sygdomme baseret på cellulære fænotyper, der kan visualiseres uafhængigt af den underliggende biologiske mekanisme, som kan være udfordrende at belyse.

Human-baserede inducerede pluripotente stamceller (iPSC)-afledte modeller betragtes som en lovende løsning på 3R-målene (Replacement, Reduction, and Refinement), der er fastsat for dyreforsøg 1,2. iPSC-afledte kardiomyocytter er blevet brugt til sygdomsmodellering og lægemiddelopdagelse, da de rekapitulerer væsentlige aspekter af menneskelig biologi3. Calciumbilleddannelse, typisk med kemiske farvestoffer, er blevet brugt til at observere cellulær aktivitet før og efter lægemiddelbehandling 4,5. Imidlertid hæmmer kemiske farvestofbaserede calciumfølende sonder direkte Na, K-ATPase og forstyrrer cellulær funktion6. Således har sporing af de samme celler over timer eller dage været problematisk, når kemiske farvestoffer anvendes. Her anvendes en række genetisk kodede calciumindikatorer (GECI'er) 7,8,9,10 på tværs af et bredt excitations-/emissions- og calciumaffinitetsspektrum til at danne en testplatform for hjertetoksicitet, der tilbyder multiorganellemålinger i realtid over længere perioder 11.
For at videreudvikle det calciumbaserede screeningskoncept med høj kapacitet i iPSC-CM-modellen ud over den tidligere demonstrerede akademiske kontekst ved hjælp af genetisk kodede værktøjer til optisk kontrol og calciumbilleddannelse ved co-ekspression af en rødforskudt calciumindikator, R-GECO eller K-GECO med et optogenetisk værktøj, ChR212,13, er der genereret virale sæt fra hylden. Ved at overføre billeddannelse til et instrument med højt indhold udstyret med et automikrofluidisk system lægges enkeltkanals pipettering af sammensat tilsætning oven på levende cellebilleddannelse. Endelig forbedres og automatiseres begge afgørende aspekter af den eksperimentelle vej, billedbehandling og analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>auto microfluidic system</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td>A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1096780100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dofetilide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PZ0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4031</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-LAR-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AA001a</td>
			<td>Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Chmical calcium sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-CMs Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CMS-002</td>
			<td>iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium)</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CMS-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AA005a</td>
			<td>Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LumiCAL software</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>LUCS01a</td>
			<td>Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL008a</td>
			<td>Brighter green GECI packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-GCEPIA3 viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL011a</td>
			<td>GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AV004a</td>
			<td>Near infrared GECI packed into viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orai1-GGECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL010a</td>
			<td>GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput optical controlling and recording calcium signal in ipsc-derived cardiomyocytes for toxicity testing and phenotypic drug screening

Det er vigtigt at forstå, hvordan spændende celler fungerer i sundhed og sygdom, og hvordan denne adfærd kan ændres af små molekyler eller genetisk manipulation. Genetisk kodede calciumindikatorer (GECI'er) med flere emissionsvinduer kan kombineres (f.eks. til samtidig observation af forskellige subcellulære hændelser) eller anvendes i udvidede applikationer med andre lysafhængige aktuatorer i excitable celler (f.eks. ved at kombinere genetisk kodet optogenetisk kontrol med spektralt kompatible calciumindikatorer). Sådanne tilgange er blevet anvendt i primære eller stamcelleafledte neuroner, kardiomyocytter og betaceller i bugspytkirtlen. Det har imidlertid været udfordrende at øge gennemstrømningen eller varigheden af observationen af sådanne tilgange på grund af begrænsninger i instrumenterne, analysesoftwaren, indikatorydelsen og genleveringseffektiviteten. Her kombineres en højtydende grøn GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) og rødforskudt GECI, K-GECO, med optogenetisk kontrol for at opnå optisk kontrol og visualisering af cellulær aktivitet i et billeddannelsesformat med høj kapacitet ved hjælp af et billeddannelsessystem med højt indhold. Applikationer, der demonstrerer kardiotoksicitetstest og fænotypisk lægemiddelscreening med sunde og patientafledte iPSC-CM'er, vises. Derudover er multiparametriske vurderinger ved hjælp af kombinationer af spektral- og calciumaffinitetsindikatorvarianter (NIR-GECO, LAR-GECO og mtGCEPIA eller Orai1-G-GECO) også begrænset til forskellige cellulære rum demonstreret i iPSC-CM-modellen.

Observationen af spontan calciumoscillation i mNG-GECO10 udtrykt ved iPSC-afledte kardiomyocytter (iPSC-CM'er) med eller uden lægemiddelbehandlinger er vist i figur 1 og animeret video 1. Kinetiske spor opnået ved anvendelse af mNG-GECO viser, at små molekylære ionkanalhæmmere, verapamil, dofetilid og E4031 påvirkede calciumtransienter (figur 1B) som forventet. Den typiske calciumtransient vist i figur 1C kan analyseres af Calcium peak analyse software til at udlede Peak signal (Amplitude), Calcium forbigående varighed 50% (CTD50), Calcium forbigående varighed 90% (CTD90), stigning tid, og henfald tid. Verapamil, en L-type calciumblokker17, hæmmer fuldstændigt calciumtilstrømningen i cellerne som forventet (figur 1B). Dofetilid og E4031 er hERG-kanalhæmmere18,19,20, opført som eksperimentelle klasse III antiarytmiske lægemidler. Henfaldstiden forlænges med både Dofetilid (p < 0,05) og E4031-behandling (p < 0,001) sammenlignet med køretøjsgruppen. Forlængelse af CTD50 (p < 0,01) og CTD90 (p < 0,001) med E4031-behandling blev observeret sammenlignet med kun køretøj (tabel 1), disse resultater er i overensstemmelse med rapporterede virkninger på QT-intervallet, en klinisk relevant måling af repolarisering bestemt ud fra overfladeelektrokardiogrammet fra lang tid mellem starten af Q-bølgen og slutningen af T-bølgen, i tidligere undersøgelser 12,21.
En vanskelighed ved CTD-vurdering i spontant slående celler er den variabilitetsslaghastighed, der pålægges CTD. Dette er et særligt problem for iPSC-CM-modellen, hvor hver brønd i en 96 brøndplade kan have sin egen slaghastighed, selvom alle celler kommer fra det samme forældrehætteglas. Det er muligt at pålægge en slaghastighed ved optisk eller elektrisk tempo. For at evaluere dosis-responsen af E4031 under standardiserede tempobetingelser blev ChR2 og K-GECO7, der udtrykte iPSC-CM'er, optisk styret ved hjælp af 1 Hz 470 nm lysimpulser og observeret ved hjælp af det røde K-GECO-signal (figur 2A og supplerende figur 1). Progressive reduktioner af topamplitude (p < 0,01) og stigning i henfaldstid (p < 0,05) af calciumtransienterne forekommer med stigende koncentrationer af E4031 (figur 2B1). En dosisafhængig effekt af E4031 var tydeligst for reduktionerne i spidsamplitude (figur 2B1,B2).
Selvom korttidsundersøgelser, der varer minutter, typisk bruges til kardiotoksicitetsvurderinger, er der en blind plet for kroniske toksicitetsvurderinger, som paralleller patienteksponeringer for lægemidler over uger, måneder eller år. Det vil være en fordel at undersøge sygdoms- eller toksicitetseffekter over de intervaller, der afspejler de behandlingsvarigheder, der er relevante for klinisk praksis. Vi brugte vores helt optiske kontrol- og detektionssystem til at studere de iPSC-afledte kardiomyocytter fra en patient med venstre ventrikulær ikke-komprimering (LVNC). iPSC-CM'er blev transduceret med et K-GECO-viralt kit (trin 2.2-2.6) efter differentiering dag 25. K-GECO-signalet blev derefter sporet hver 1-2 uge i de samme brønde, med eller uden yderligere lægemiddelbehandlinger. Både spontan calciumaktivitet (figur 3A, 3B) og calciumdynamik under optisk tempo (figur 3C, D, trin 4.11) blev opnået ved hjælp af high-Content Imaging System (trin 4.1-4.12) og behandlet af calciumspidsanalysesoftware (trin 6). Som vist i figur 3A,C forbliver klare calciumtransienter synlige en måned efter viral transduktion, med eller uden det ekstra lys, der anvendes til optisk pacing. Dette arbejde identificerede et lægemiddel, der ser ud til at øge slaghastigheden, regulere sammentrækningsintervallet og øge den forbigående calciumamplitude i LVNC iPSC-CM-modellen (figur 3A, B). Der er to vigtige observationer at gøre ud fra disse data. For det første ser lægemiddeleffekten ud fra et terapeutisk perspektiv ud til at være holdbar på dag 63 og dag 70-tidspunkter. For det andet og af relevans for et felt, der generelt analyserer sammensatte effekter i korte vinduer (<1 min) på tidligere tidspunkter (typisk <50 dage); sygdommens fænotypemodificerende virkninger af forbindelsen er først tydelige efter dag 60, hvilket tyder på, at det kan være let at diskontere lægemidler, der har langsomme virkningsmekanismer i standard screeningsprotokoller.
Variabiliteten af beatfrekvens og den efterfølgende indvirkning på calciumtransient varighed er ikke kun et well-to-well problem på et givet tidspunkt. Det ændrer sig også, da iPSC-CM opretholdes i kultur, som varierer inden for en brønd over tid (figur 3B). For at indføre konsistens inden for sekventielle eksperimenter kan 1 Hz optisk tempo anvendes med eller uden lægemiddelbehandling (figur 3C, D). Her viser dag 63-resultaterne de opmuntrende tendenser i calciumtransienten med en signifikant højere amplitude, kortere CTD90 og kortere henfaldstid; ved 70-dages tidspunkt - og vejledende for behovet for kroniske vurderinger under lægemiddelscreeningsprocessen for sjældne sygdomme - tidligt efter depolariseringer (EAD) er opdaget. Værdien af at tilføje en tempoprotokol til sygdomsfænotypning eller evaluering af små molekyler kan vurderes kvalitativt ved sammenligning af resultaterne præsenteret i figur 3B, D for slaghastighed, calciumtransient amplitude, CTD90 og henfaldstid.
En fordel ved en GECI, sammenlignet med kemisk farvestof, baseret metode til at visualisere calciumtransienten er evnen til at begrænse sonden til et bestemt rum i en celle. Dette kan udvides yderligere ved at multiplexere flere farve- og / eller affinitetsvarianter i enkeltceller. Derfor er flere GECI'er, herunder ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA 22,23 (eller Oria1-G-GECO) og NIR-GECO2 8,24, blevet udviklet til ekspression enkeltvis eller i kombination i cellemodeller til måling af calciumaktivitet i realtid, der opstår i henholdsvis endoplasmatisk retikulum / sarkoplasmatisk retikulum (ER / SR), mitokondrier (eller CRAC-kanal) og cytosol. De kan kombineres i iPSC-CM-modellen (figur 4A, C) for at studere interaktionen mellem forskellige intracellulære calciumlagre. For eksempel kan 10 mM koffeinbehandling bruges til at tømme SR-calciumbutikken. Her svarede et fald i ER-LAR-GECO-signalet (tegn på tab af calcium fra SR) til et fald i NIR-GECO-signalet (tegn på en stigning i cytosolisk calciumkoncentration) som forventet. Hvordan andre intracellulære rum påvirkes af disse udsving er ikke godt undersøgt. Alligevel viser inkluderingen af en grøn mitokondrie-målrettet mtGCEPIA3, at calciumoptagelse forekommer i mitokondrier under disse forhold (figur 4A, B).
På samme måde kan visualisering af samspillet mellem forskellige calciumstrømme ses ved at inkludere en sonde, Orai1-G-GECO25, for at afsløre den calciumfrigivelsesaktiverede kanal (CRAC) Ca2+ strøm (figur 4C, D). I iPSC-CM-modellen øges dette signal med den spontane cytosoliske calciumtransient (figur 4D1,D2). I overensstemmelse med dette fremkalder behandling med koffein en stor calciumtransient i både cytosolen og fra Orai1-kanalen.
Det erkendes, at de fleste calciumtransiente billeddannelser i kardiomyocytmodeller er blevet bestemt ved hjælp af calciumfarvestoffer26. En genetisk kodet calciumindikator blev sammenlignet med et kemisk farvestof i den iPSC-afledte kardiomyocytmodel for at muliggøre en sammenligning side om side af forskellige calciumbilleddannelsesmetoder. K-GECO, der udtrykker iPSC-CM'er, blev afbildet sammen med Fluo-4-indlæste celler. K-GECO, der udtrykte kardiomyocytter, viste konsekvent slagadfærd over tid (figur 5A, C). Imidlertid påvirkede Fluo-4-belastning både beatfrekvensen og CTD i denne model (figur 5B, C), hvilket tyder på, at Fluo-4 selv kan påvirke resultaterne af sådanne eksperimenter. Dette vil især være tilfældet efter langvarig eksponering for billeddannelsessonden, som kan forekomme i multiwall-billedformatet, hvis der forekommer godt for godt billeddannelse med et minuts opholdstid pr. Brønd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig01.jpg"> Figur 1: Små molekyle ionkanalhæmmere påført iPSC-afledte kardiomyocytter . (A-B) Timelapse-billeder af iPSC-CM, der udtrykker mNG-GECO taget ved 25 Hz. Skalabar = 50 μm. (B) Repræsentative Ca2+ svingninger efter tilsætning af forbindelser. Fluorescerende signaler opnået fra mNG-GECO-ekspressive celler præsenteres som et fluorescensforhold F / F0, hvor F0 defineres som basal intensitet og F intensiteten detekteret på hvert tidspunkt. (C) Calciumspidsanalysesoftware kan udtrække parametre, herunder halv maksimal bredde (CTD50), 90% forbigående varighed (CTD 90), stigningstid og henfaldstid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig02.jpg"> Figur 2: Dosis-respons-eksempel ved anvendelse af hERG-hæmmeren E4031 i et optisk temposystem. (A) Spor af optisk stimulering med 10% blåt lys i forskellige koncentrationer af E4031. Time-lapse-billeder af iPSC-afledte kardiomyocytter, der udtrykker K-GECO taget ved 25 Hz. (B1) Repræsentative spor af calciumtransienter opnået med forskellige sammensatte doser. Peak analyse og dosis-respons af E4031 i amplitude (B2) og henfaldstid (B3). Blå bjælker angiver 1 Hz 470 nm impulslysstimulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig03.jpg"> Figur 3: All-optisk platform anvendt til langvarig lægemiddelfænotypisk screening i LVNC-patientafledte kardiomyocytter. (A) Repræsentativt spor af spontan slagaktivitet i patientafledte kardiomyocytter (efter differentiering dag 70) med (rød) eller uden (blå) 5 μM lægemiddelbehandling. (B) Peak analyse af spontan slagaktivitet med eller uden 5 μM lægemiddelbehandling. (C) Intensitetsspor af lægemiddelrespons i patientafledt iPSC-CM under 1 Hz optisk stimulering. (D) Peak analyse af patientafledte kardiomyocytter med 1 Hz optisk stimulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig04.jpg"> Figur 4: Tre kanaler subcellulær Ca 2+ billeddannelse i iPSC-CM-modellen. (A-B) iPSC-CM'er blev transduceret med subcellulære calciumsonder til cytoplasmaet, NIR-GECO2 (rød), det endoplasmatiske retikulum ER-LAR-GECO (gul) og mtGCEPIA3 (cyan), en mitokondrie Ca2+ indikator. (B) Tre-kanals time-lapse calciumbilleddannelse før og efter 10 mM koffeinbehandling. (C-D) iPSC-CM'er transduceret med cytoplasmatisk, NIR-GECO2 (rød), endoplasmatisk retikulum ER-LAR-GECO (gul) og CRAC-kanalindikatorer Orai1-G-GECO (cyan) blev visualiseret. (D) Tre-kanals time-lapse calciumbilleddannelse blev fanget. (D1) Spontan beat-to-beat aktivitet blev observeret med NIR-GECO2 og Orai1-G-GECO. (D2) Calciumudstrømning fra ER (fald i ER-LAR-GECO-signal) ledsagede en stigning i det cytosoliske calciumsignal ved koffeinbehandling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig05.jpg"> Figur 5: Sammenligning af den genetisk kodede calciumindikator (K-GECO) med det kemiske calciumfølsomme farvestof (Fluo-4) i iPSC-CM'er. (A-B) Repræsentative calciumspor af K-GECO (A) og Fluo-4 (B) præsenteres over tid. (C) Calciumtransient analyse af K-GECO transduceret eller Fluo-4 indlæst iPSC-CM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>BPM</td>
			<td>CTD50 (s)</td>
			<td>CTD90 (s)</td>
			<td>Amplitude (F/F0)</td>
			<td>Stige tid</td>
			<td>Henfaldstid(er)</td>
		</tr><tr><td>Køretøj (0,1% DMSO)</td>
			<td>112.3657+/-10.95</td>
			<td>0.25+/-0.04</td>
			<td>0.41+/-0.01</td>
			<td>1.99+/-0.02</td>
			<td>0.07+/-0.01</td>
			<td>0.28+/-0.01</td>
		</tr><tr><td>Verapamil (1 uM)</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Dofetilid (5 nM)</td>
			<td>103.42+/-9.87**</td>
			<td>0.23+/-0.03</td>
			<td>0.46+/-0.03</td>
			<td>1.91+/-0.03</td>
			<td>0.07+/-0.01</td>
			<td>0.35+/-0.02*</td>
		</tr><tr><td>E4031 (30 nM)</td>
			<td>75.73+/-12.08***</td>
			<td>0.37+/-0.04**</td>
			<td>0.58+/-0.08***</td>
			<td>1.55+/-0.02**</td>
			<td>0.11+/-0.04***</td>
			<td>0.35+/-0.07**</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Virkninger af tilsætning af forbindelser til forbigående calciumparametre i iPSC-CM-modellen. Signifikansværdier er angivet med *(p ≤ 0,05), **(p < 0,01) og ***(p < 0,001). 
Animeret video 1: Spontan calciumaktivitet blev observeret af mNG-GECO i iPSC-afledte kardiomyocytter kun med køretøj. Der leveres en pseudofarvet film med et gråskalabillede. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/fig1-video.avi" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>
Supplerende figur 1: Skematisk repræsentation af adenoviralvektoren. Dette inkluderer kanal rhodopsin ChR2 som aktuator med en rød fluorescerende calciumindikator K-GECO som calciumreporter til et helt optisk assay. Den lysfølsomme ionkanal gør det muligt at depolarisere excitable celler af lys i det blågrønne område af det synlige spektrum. 470 nm lys blev brugt i disse eksperimenter. Calciumtransienter i excitable celler kan samtidig afbildes af K-GECO, som kræver grønt excitationslys, der producerer røde emissioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/Sup%20r1.pdf" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening at JoVE.com

High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening

Den nuværende protokol beskriver optisk kontrol og observation af udløst cellulær aktivitet i iPSC-afledte kardiomyocytter (iPSC-CM'er) til screening af lægemidler med høj kapacitet og toksicitetstest. Multi-parametrisk kvantificering af fænotypiske mønstre i tid og rum vises. Langtidsvirkninger af lægemidler over timer eller sekventielle målinger over dage demonstreres.

Optisk styring og registrering af calciumsignal med høj kapacitet i iPSC-afledte kardiomyocytter til toksicitetstest og fænotypisk lægemiddelscreening

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. ...

Vi demonstrerer utallige metoder til al optisk kontrol og observation af udløst cellulær aktivitet i iPSC-afledte kardiomyocytter til high-throughput lægemiddelscreening og toksicitetstest. Muliggør multiparametrisk kvantificering af de fænotypiske mønstre i tid og rum, tillad observation af virkningen af lægemidler over timer eller dage. Denne metode kan anvendes på forskellige typer celler, såsom neuroer eller betaceller, til funktionel screening og toksicitetstest.Wan-Chi Su, en bio-imaging ingeniør fra mit laboratorium, demonstrerer proceduren. Forbered multibrøndpladen, før iPSC-kardiomyocytter fjernes fra køleopbevaring til optøning. Overtræk hver brønd af 96-brøndens mikroplade med 100 mikroliter 0,02% gelatineopløsning med 50 mikrogram pr. milliliter fibronectin for at dække alle overflader grundigt.Overfør iPSC-kardiomyocytterne fra beholderen til opbevaring af flydende nitrogen til et vandbad på 37 grader Celsius. Tag hætteglasset til et klasse to biosikkerhedsskab, og overfør forsigtigt indholdet til et nyt 15 ml konisk rør indeholdende ni milliliter rumtemperaturmedium. Centrifuger cellerne ved 200 gange G i tre minutter ved stuetemperatur.Supernatanten kasseres med pipette, og forsigtigt genophæng cellerne i en milliliter medium med 10 mikromolære ROCK-hæmmere Y27632. Pladeceller belagte 96 brøndplader med en tæthed på 100.000 til 150.000 celler pr. Kvadratcentimeter i henhold til producentens anvisninger. Efter 24 timer skal du sikre dig, at cellerne, der er fastgjort til pladens overflade, er i kontakt med andre celler.Efter plettering af cellerne i 72 timer optøning af GECIs virale sæt på is. Forbered en dobbeltstyrke viral kit-lageropløsning med vedligeholdelsesmediet. Forbered cellerne til infektion ved at justere medievolumenet til 100 mikroliter pr. Brønd.Tilsæt 100 mikroliter af den forblandede virale opløsning til brønde, og inkuber i otte til 16 timer ved 37 grader Celsius. Efter inkubation udskiftes med 200 mikroliter forvarmet medium. Visualiser GECIs-udtrykket 24 timer efter transduktion ved hjælp af et billedbehandlingssystem.Vedligehold celler i den befugtede inkubator, før funktionelle assays udføres. Tænd for alle enheder i billedbehandlingssystemet med højt indhold. Kontroller, at kammertemperaturen når 37 grader Celsius med 5% kuldioxidtilskud.Åbn billedbehandlingssoftwaren, og vælg pladeindstillingen for en 96-brøndplade. Anbring en 96 brøndplade uden låg i kammeret, og læg den levende celleforseglingsring ovenpå. Vælg objektivlinsen 20X, 60X og 20X vandfordybelse i henhold til den krævede rumlige opløsning.Juster fokus for at tage klare billeder før eksperimentel erhvervelse. Vælg tre til fem regioner tilfældigt pr. Brønd til registrering af calciumaktivitet. Vælg passende filtre til forskellige indikatorer.Indstil den passende lysdiodeeffekt for hver anvendt billedkanal. Indstil kameraets eksponeringstid til maksimalt 40 millisekunder eller 25 hertz og en optagelsesvarighed på 30 sekunder for streamoptagelse for at observere calciumtransienter, rapporteret af MNG-GECO- og K-GECO-sonder udtrykt i kardiomyocytter. Forøg LED-effekten, hvis signal/støjforholdet er mindre end to ved højere billedhastigheder.For optogenetisk stimulering skal du optimere kraften og frekvensen af blåt lys ved en hertz og starte erhvervelsen. Suspender E4031 Dofetilid og Verapamil i DMSO igen, og fortynd dem med Tyrodes buffer. Arranger forbindelser til det tilsvarende mål godt.Tilsæt 100 mikroliter af dobbeltstyrkeforbindelsen via det automatiske mikrofluidiske system i brøndene, og start erhvervelsen efter den ønskede inkubationsperiode. Isoler signalområdet fra baggrunden ved automatisk at registrere pulsfunktionen over tidsopløsning med softwaren. Brug calciumtopanalysesoftwaren til at analysere slagfrekvensen, topsignalet, calciumforbigående varighed 50% calciumforbigående varighed 90% stigningstid og henfaldstid.Observationen af spontan calciumoscillation i NMG-GECO udtrykt ved iPSC-afledte kardiomyocytter med eller uden lægemiddelbehandlinger er demonstreret i videoen. Kinetiske spor opnået ved hjælp af MNG-GECO viste, at små molekylære ionkanalhæmmere Verapamil, Dofetilid og E4031 påvirkede calciumtransienter som forventet. For at evaluere dosisresponset af E4031 under standardiserede, tempobetingelser blev channelrhodepsin-2 og K-GECO, der udtrykker iPSC CM'er, optisk kontrolleret ved hjælp af en hertz og 470 nanometer lysimpulser og observeret ved hjælp af det røde K-GECO-signal.Progressive reduktioner af topamplitude og stigning i calciumtransienternes henfaldstid forekommer med stigende koncentrationer af E4031. En dosisafhængig effekt af E4031 var tydeligst for reduktionerne i spidsamplitude. Klare calciumtransienter forbliver synlige en måned efter viral transduktion eller uden det ekstra lys, der bruges til optisk pacing.Grafen viser et lægemiddel, der ser ud til at øge slaghastigheden, regulere sammentrækningsintervallet og øge den forbigående calciumamplitude i LVNC iPSC CM-tilstand. Variabiliteten af beatfrekvens og den efterfølgende indvirkning på calciumtransient varighed ændres også, da iPSC CM opretholdes i kultur. Flere GECI'er, herunder ER LAR-GECO, MTG-Sepia og NIR-GECO, er blevet udviklet til ekspression enkeltvis eller i kombination i cellemodeller til måling af calciumaktivitet i realtid, der opstår i henholdsvis det endoplasmatiske retikulum, sarkoplasmatiske retikulum, mitokondrier og cytosol.GECI'erne kan kombineres i iPSC CM-modellen for at studere forskellige intracellulære calciumlagre. K-GECO, der udtrykte kardiomyocytter, viste konsekvent slagadfærd over tid. Imidlertid påvirkede Fluo-4-indlæsning både beatfrekvensen og CTD i denne model, hvilket tyder på, at Fluo-4 i sig selv kan påvirke resultaterne af sådanne eksperimenter.Vi leverer en enkel måde at studere fænotypiske profiler fra kontrol- og patientafledte celler, mens iPSC-mellemprodukt kan kaste lys over lægemiddelopdagelse i forskellige sygdomme.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Screening for Melanoma Modifiers anvendelse af et zebrafisk Autokton tumormodel

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

En Multiplexed Luciferase-baseret Screening Platform for forhører Kræft-associeret signaltransduktion i dyrkede celler

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En Organotypiske High Throughput System til karakterisering af Drug følsomhed Primære myelomatoseceller

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En Neonatal Mouse rygmarvskompression Skade Model

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Echocardiographic Approaches and Protocols for Comprehensive Phenotypic Characterization of Valvular Heart Disease in Mice

Ekkokardiografiske Strategier og Protokoller for omfattende fænotypisk karakterisering af Valvular hjertesygdom i mus

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Vurdering af Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve og intracellulære diastolisk Calcium fjernelse i isolerede ventrikulær Cardiomyocytes

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimeret LC-MS/MS metoden til høj overførselshastighed analyse af kliniske prøver af Ivacaftor, dets vigtigste metabolitter, og Lumacaftor i biologiske væsker af cystisk fibrose patienter

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

At studere hypothalamus Insulin Signal til perifere glukose Intolerance med en løbende Drug Infusion System ind i musen hjernen

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...