Name: high-throughput optical controlling and recording calcium signal in ipsc-derived cardiomyocytes for toxicity testing and phenotypic drug screening
Uploaded: 2022-03-31T13:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening at JoVE.com

Nous remercions le professeur Robert Campbell de l’Université de Tokyo d’avoir partagé le matériel et la discussion précieuse; Dr.-Lin Ho dans Molecular Device pour le support technique.

Les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC (iPSC-CM) des patients atteints de cardiomyopathie ventriculaire gauche sans compactage (LVNC) ont été fournis par l’hôpital universitaire national de Taïwan. La collecte d’échantillons de patients pour la reprogrammation vers iPSC et les protocoles de maintenance14 à des fins de recherche ont suivi la Déclaration d’Helsinki de l’AMM (principes éthiques pour la recherche médicale impliquant des sujets humains) et ont été approuvés par le Comité d’examen institutionnel: Bureau du Comité d’éthique de la recherche à la NTUH (#201612099RINC). D’autres iPSC-CM ont été obtenus auprès de fournisseurs commerciaux. L’utilisation de dérivés iPSC ne nécessite pas d’autorisations spécifiques dans notre institution.
1. Préparation de cardiomyocytes dérivés de l’iPSC
<ol><li>Préparez la plaque multipuits avant que l’iPSC-CM ne soit retiré de l’entrepôt frigorifique pour la décongélation. Enduisez chaque puits de la microplaque à 96 puits de 100 μL de solution de fibronectine à 50 μg/mL/gélatine à 0,2 % (voir le tableau des matières) pour bien couvrir toutes les surfaces.</li>
	<li>Incuber la plaque à 37 °C pendant 1 h dans un incubateur humidifié.</li>
	<li>Réchauffer le milieu (voir le tableau des matières) à température ambiante pendant 30 minutes avant la décongélation des cellules. NOTE: Le protocole actuel décrit la température ambiante comme étant de 25 ° C.</li>
	<li>Transférer l’iPSC-CM du réservoir de stockage d’azote liquide au bain-marie à 37 °C. REMARQUE : Les iPS-CM sont généralement expédiés sur glace sèche par des sources universitaires ou commerciales. Ils sont transférés dans un entrepôt d’azote liquide dès réception jusqu’à leur utilisation.</li>
	<li>Retirez le flacon avant que la glace ne fond complètement et vaporisez le flacon avec de l’éthanol à 75%.</li>
	<li>Apportez le flacon dans une enceinte de biosécurité de classe II et transférez délicatement le contenu dans un nouveau tube conique de 15 mL contenant 9 mL de milieu à température ambiante.</li>
	<li>Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 3 min à température ambiante.</li>
	<li>Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre doucement les cellules en suspension dans 1 mL de milieu contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK (Y27632) (voir le tableau des matières). REMARQUE: Évitez le pipetage répété des cellules décongelées pour assurer une récupération maximale des cellules.</li>
	<li>Retirer la solution de revêtement du puits et ajouter rapidement 50 μL de milieu avec 10 μM d’inhibiteur de ROCK.</li>
	<li>Confirmer le nombre de cellules viables en utilisant la méthode d’exclusion du bleu de trypan avec un hémocytomètre15.</li>
	<li>Cellules à plaques en plaque revêtue de 96 puits à une densité de 100 000 à 150 000 cellules/cm2, conformément aux instructions du fabricant16.</li>
	<li>Après 24 h, assurez-vous que les cellules fixées à la surface de la plaque sont en contact avec d’autres cellules. REMARQUE: Les cellules individuelles survivent mal en culture à long terme et se comportent généralement de manière plus variable.</li>
	<li>Remplacez le milieu d’entretien préchauffé tous les 2 jours. REMARQUE: Pour le traitement médicamenteux à long terme, les LVNC iPSC-CM ont été remplacés par des remplacements à moitié moyen avec ou sans médicaments à petites molécules tous les 2 jours.</li>
</ol>2. Expression d’indicateurs calciques génétiquement codés
<ol><li>Après avoir plaqué les cellules pendant 72 h, décongeler les trousses virales GECI (voir le tableau des matériaux) sur de la glace.</li>
	<li>Préparez une solution de stock de kit viral 2x avec le support d’entretien.</li>
	<li>Préparer les cellules à l’infection en ajustant le volume du milieu à 100 μL par puits. Ajouter 100 μL de la solution virale prémélangée et incuber pendant 8-16 h à 37 °C.</li>
	<li>Remplacer par 200 μL de milieu préchauffé après incubation.</li>
	<li>Visualiser l’expression des GECI 24 h après la transduction à l’aide d’un système d’imagerie (voir le tableau des matériaux). REMARQUE: Le niveau d’expression atteint le maximum 48-72 h après la transduction. Les cellules peuvent être imagées à partir du point de temps de 24 heures. Cependant, les signaux obtenus des GECI se maintiennent pendant plus d’un mois.</li>
	<li>Maintenir les cellules dans l’incubateur humidifié avant d’effectuer des tests fonctionnels.</li>
	<li>Infecter les CSPi-CM (CSPi-CM dérivées du patient LVNC) avec la trousse virale ChR2-K-GECO (voir le tableau des matières) au jour 25 après la différenciation à l’aide du protocole d’infection (étapes 2.1-2.6).</li>
</ol>3. Imagerie calcique à base de colorant à l’aide de Fluo-4
<ol><li>Dissoudre la poudre de Fluo-4 (voir le tableau des matériaux) dans du DMSO sous forme de solution mère (5 mM).</li>
	<li>Diluer la solution mère à une concentration de 10 μM de Fluo-4 dans le tampon de Tyrode. REMARQUE : Le tampon de Tyrode se compose de 1,0 g/L de bicarbonate de sodium, 0,2 g/L de chlorure de calcium, 0,1 g/L de chlorure de magnésium, 0,2 g/L de chlorure de potassium, 8,0 g/L de chlorure de sodium, 0,05 g/L de phosphate de sodium monobasique et 1,0 g/L de D-glucose.</li>
	<li>Remplacer la moitié du milieu par 10 μM de solution de Fluo-4 (ce qui donne une concentration finale de 5 μM).</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Lavez les cellules avec le tampon de Tyrode préchauffé et remplacez-les par le support avant l’acquisition de l’image.</li>
	<li>Commencez à enregistrer avec le protocole d’acquisition de flux. REMARQUE: L’acquisition de flux consiste à acquérir des images en continu sans intervalle de temps. La fréquence de battement de l’iPSC-CM est d’environ 1 Hz, et ce protocole d’acquisition de flux est utilisé pour collecter les modèles de battement.</li>
</ol>4. Acquisition d’images et essais fonctionnels pour les essais de toxicité et le criblage phénotypique
<ol><li>Allumez tous les appareils du système d’imagerie à haut contenu (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Vérifiez que la température de la chambre atteint 37 °C, avec une supplémentation en CO2 à 5%. Maintenez le système à l’équilibre pendant 2 heures avant l’acquisition de l’image. REMARQUE: La dérive thermique est un problème important pour les observations à long terme de cellules vivantes, 1 ° C peut modifier le plan focal de ~ 1 μm, donc permettre à la lentille, et à l’étage, d’atteindre la température cible est essentiel avant l’acquisition de l’image.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel d’imagerie (voir Tableau des matériaux) et choisissez le réglage de la plaque pour une plaque de 96 puits.</li>
	<li>Placez une plaque de 96 puits sans couvercle dans la chambre et chargez avec l’anneau d’étanchéité de la cellule sous tension sur le dessus. REMARQUE: La bague d’étanchéité de cellule vivante est un adaptateur pour atteindre l’équilibre environnemental.</li>
	<li>Choisissez l’objectif d’immersion dans l’eau 20x (Figure 1 et Figure 2), 60x (Figure 3 et Figure 4) et 20x (Figure 5) en fonction de la résolution spatiale requise.</li>
	<li>Ajustez la mise au point pour prendre des images claires avant l’acquisition expérimentale.</li>
	<li>Sélectionnez 3 à 5 régions au hasard par puits pour l’enregistrement de l’activité calcique. REMARQUE : Chaque région doit comprendre au moins 20 cellules (n ≥ 20).</li>
	<li>Choisissez des filtres appropriés pour différents indicateurs. FITC 475/536 pour mNG-GECO, mtGCEPIA3 et Oria1-G-GECO; Cy5 631/692 pour NIR-GECO2; ER 530/593 pour ER-LAR-GECO; Texas Red 560/624 pour K-GECO.</li>
	<li>Réglez la puissance de diode électroluminescente (DEL) appropriée pour chaque canal d’imagerie utilisé. REMARQUE: Lors de l’optimisation de la puissance LED pour l’acquisition d’images par le rapport signal (intensité détectée de l’objet) au bruit (intensité détectée du fond), le rapport S / N doit être supérieur à 2. Dans ce protocole, 10% de puissance LED pour TRITC et FITC; 20 % pour Cy5 était typique.</li>
	<li>Réglez le temps d’exposition de la caméra sur un maximum de 40 ms (25 Hz) et une durée d’enregistrement de 30 spour l’acquisition de flux afin d’observer les transitoires de calcium rapportés par les sondes mNG-GECO et K-GECO exprimés en cardiomyocytes (Figure 1-3 et Figure 5). Augmentez la puissance de la LED si le signal/bruit est <2 à des fréquences d’images plus élevées.</li>
	<li>Pour la stimulation optogénétique (Figure 2 et Figure 3C,D), optimiser la puissance (typiquement 5%-10%) et la fréquence de la lumière bleue à 1 Hz. REMARQUE: Généralement, l’iPSC-CM humain bat spontanément autour de ~ 1 Hz, et l’opérateur doit accélérer le rythme que le taux spontané.</li>
	<li>Si des mesures séquentielles (figure 3) ou étendues (figure 4) sont prévues, éviter à tout prix la phototoxicité. Cela peut signifier réduire l’intensité de la puissance d’éclairage et compenser cela en augmentant le temps d’exposition de la caméra, par exemple, à 100 ms avec le protocole time-lapse utilisé pour l’observation en temps réel à trois canaux des signaux Ca2+ subcellulaires (Figure 4).</li>
	<li>Utiliser le protocole de distribution asynchrone pour l’ajout de caféine de 10 mM via le système microfluidique automatique (voir le tableau des matériaux) (Figure 4). REMARQUE: Le protocole de distribution asynchrone permet l’acquisition d’images pendant que des médicaments tels que la caféine sont ajoutés, sans espace entre les images.</li>
	<li>Commencez l’acquisition.</li>
</ol>5. Préparation de petites molécules
<ol><li>Remettez en suspension le E4031, le dofétilide et le vérapamil dans du DMSO et diluez-les avec le tampon de Tyrode. La concentration finale de DMSO dans le milieu était de 0,1 % (v/v).</li>
	<li>Préparer les solutions composées à la concentration de travail double (c’est-à-dire 2x) souhaitée et équilibrer à 37 °C avant addition. REMARQUE: Il est essentiel de minimiser les fluctuations de température après l’ajout de fluide, car la contractilité dépend de la température et l’effet du changement de température est rapide.</li>
	<li>Disposer les composés sur le puits cible correspondant.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de composés à double concentration (2x) via le système microfluidique automatique (voir le tableau des matériaux) dans les puits et commencer l’acquisition après la période d’incubation souhaitée (généralement 15 minutes).</li>
</ol>6. Traitement et analyse de l’imagerie
<ol><li>Isolez la zone du signal de l’arrière-plan en détectant automatiquement la fonction de l’impulsion au fil du temps avec le logiciel.</li>
	<li>Utilisez le logiciel d’analyse des pics de calcium (voir le tableau des matériaux) pour analyser la fréquence de battement (BPM), le signal de crête (amplitude), la durée transitoire du calcium 50% (CTD50), la durée transitoire du calcium 90% (CTD90), le temps de montée et le temps de désintégration (Figure 1C). REMARQUE: Dans ces paramètres, le photoblanchiment était apparent au cours des 10 premières secondes et les signaux sont stabilisés par la suite. Ainsi, le pic de calcium a été analysé de 11 à 30 s. Dans les enregistrements à trois canaux (Figure 4), le contour de la cellule est bordé manuellement pour mesurer le changement d’intensité.</li>
</ol>

<ol>
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LumiSTAR a déposé une demande de protection par brevet pour l’utilisation de K-GECO, NIR-GECO et LAR-GECO.

Pour effectuer avec succès un criblage à haut débit, les signaux doivent être répartis uniformément dans le récipient de culture, garantissant que des régions d’intérêt (ROI) sélectionnées au hasard peuvent être appliquées automatiquement lors de l’acquisition de l’imagerie. Bien que les indicateurs chimiques de calcium répondent facilement à cette exigence, les sondes génétiquement codées ont historiquement produit des patchs, plutôt que des feuilles, de signal limitant leur utilisation. L’utilisation d’un système de transduction virale fournit des niveaux d’expression élevés de27,28 et équivalents de plusieurs indicateurs parmi les cellules cibles par rapport aux méthodes de transfection conventionnelles. Différents types de cellules peuvent nécessiter différents promoteurs, et le choix du système de livraison de gènes peut devoir changer en conséquence 29,30,31. Dans les modèles cellulaires hétérogènes, l’efficacité de la transduction et de l’expression peut être différente dans des types de cellules spécifiques. D’une part, cela peut limiter l’application à des cellules particulières, mais le phénomène peut être exploité pour distinguer des cellules particulières dans un système de co-culture32.
Le principal impact de cette approche est la libération de la relation un-à-un entre l’expérimentateur et l’échantillon par l’automatisation. Dans une expérience standard multi-puits, pour collecter des données à quatre positions dans un seul puits, nous estimons qu’il faut environ 15 heures au microscope pour recueillir des vidéos de 30 s à partir d’une plaque de 96 puits. Dans le système automatisé, cela prend ~4 h. De plus, l’analyse manuelle des données prend beaucoup plus de temps que l’acquisition des données. Le système d’analyse utilisé ici est environ 200 fois plus rapide que l’équivalent manuel. Le résultat net est un flux de travail amélioré et des économies de temps et d’argent élevées.
Contrairement aux cardiomyocytes primaires chargés de colorants calciques qui survivent de l’ordre de quelques heures, les GECI exprimés en iPSC-CM via des systèmes d’administration virale peuvent produire un signal dans un modèle expérimental qui vit quelques mois. Ces modèles peuvent être maintenus dans un format multipuits et suivis simultanément pour l’analyse en série dans des systèmes d’imagerie à haut contenu développés pour le criblage de petites molécules. Cela produit une plate-forme expérimentale humaine simple pour tester les effets des médicaments sur des durées plus proches de celles subies par les patients (semaines ou mois) plutôt que les minutes généralement utilisées dans les essais toxicologiques.
Le système peut être étendu pour fournir des mesures multi-paramètres en incluant des GECI avec des propriétés d’émission distinctes du vert au proche infrarouge. De telles expériences nécessitent une lumière d’excitation et des ensembles de filtres appropriés dans la conception expérimentale pour garder les signaux séparés. Une application à grande échelle dans un contexte de dépistage de médicaments nécessite des plateformes d’analyse robustes et efficaces en plus de la délivrance de médicaments. Bien que le modèle décrit ici se concentre sur l’utilisation de multiples indicateurs dynamiques du calcium, cela pourrait être modifié pour des marqueurs structurels de la forme ou de la fonction cellulaire. Ceux-ci sont généralement plus faciles à visualiser car ils montrent peu de variabilité battement à battement par rapport à la variation centuple de la concentration intracellulaire de calcium. Cette approche peut être particulièrement utile pour les maladies rares où l’intermédiaire iPSC dérivé des patients peut contenir tous les facteurs génétiques et les modificateurs d’une affection particulière qui peuvent être préservés dans un modèle cellulaire évolutif, facilitant la découverte de médicaments dans diverses maladies basées sur des phénotypes cellulaires qui peuvent être visualisés indépendamment du mécanisme biologique sous-jacent qui peut être difficile à élucider.

Les modèles dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) sont considérés comme une solution prometteuse aux objectifs des 3R (remplacement, réduction et raffinement) fixés pour les études animales 1,2. Les cardiomyocytes dérivés des CSPi ont été utilisés pour la modélisation des maladies et la découverte de médicaments car ils récapitulent des aspects essentiels de la biologie humaine3. L’imagerie calcique, généralement avec des colorants chimiques, a été utilisée pour observer l’activité cellulaire avant et après le traitement médicamenteux 4,5. Cependant, les sondes de détection de calcium à base de colorant chimique inhibent directement la Na, la K-ATPase et perturbent la fonction cellulaire6. Ainsi, le suivi des mêmes cellules pendant des heures ou des jours a été problématique lorsque des colorants chimiques sont utilisés. Ici, une gamme d’indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI)7,8,9,10 sont utilisés sur un large spectre d’excitation/émission et d’affinité calcique pour former une plate-forme de test de toxicité cardiaque offrant des mesures multi-organites en temps réel sur de longues périodes de temps 11.
Pour développer davantage le concept de criblage à haut débit à base de calcium dans le modèle iPSC-CM au-delà du contexte académique précédemment démontré en utilisant des outils génétiquement codés pour le contrôle optique et l’imagerie du calcium par co-expression d’un indicateur de calcium décalé vers le rouge, R-GECO ou K-GECO avec un outil optogénétique, ChR212,13, kits viraux prêts à l’emploi ont été générés. En transférant l’imagerie vers un instrument à haut contenu équipé d’un système auto-microfluidique, le pipetage monocanal de l’addition de composés est superposé à l’imagerie de cellules vivantes. Enfin, les deux aspects cruciaux de la voie expérimentale, le traitement d’images et l’analyse, sont améliorés et automatisés.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>auto microfluidic system</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td>A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1096780100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dofetilide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PZ0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4031</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-LAR-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AA001a</td>
			<td>Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Chmical calcium sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-CMs Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CMS-002</td>
			<td>iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium)</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CMS-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AA005a</td>
			<td>Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LumiCAL software</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>LUCS01a</td>
			<td>Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL008a</td>
			<td>Brighter green GECI packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-GCEPIA3 viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL011a</td>
			<td>GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AV004a</td>
			<td>Near infrared GECI packed into viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orai1-GGECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL010a</td>
			<td>GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput optical controlling and recording calcium signal in ipsc-derived cardiomyocytes for toxicity testing and phenotypic drug screening

Comprendre comment les cellules excitables fonctionnent dans la santé et la maladie et comment ce comportement peut être modifié par de petites molécules ou une manipulation génétique est important. Les indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI) avec plusieurs fenêtres d’émission peuvent être combinés (par exemple, pour l’observation simultanée d’événements subcellulaires distincts) ou utilisés dans des applications étendues avec d’autres actionneurs dépendants de la lumière dans les cellules excitables (par exemple, combinant un contrôle optogénétique génétiquement codé avec des indicateurs de calcium compatibles spectralement). De telles approches ont été utilisées dans les neurones primaires ou dérivés de cellules souches, les cardiomyocytes et les cellules bêta pancréatiques. Cependant, il a été difficile d’augmenter le débit, ou la durée de l’observation, de ces approches en raison des limites des instruments, du logiciel d’analyse, de la performance des indicateurs et de l’efficacité de la livraison des gènes. Ici, un GECI vert haute performance, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO), et un GECI décalé vers le rouge, K-GECO, sont combinés avec un contrôle optogénétique pour obtenir un contrôle et une visualisation entièrement optiques de l’activité cellulaire dans un format d’imagerie à haut débit à l’aide d’un système d’imagerie à haut contenu. Les applications démontrant les tests de cardiotoxicité et le dépistage phénotypique de médicaments avec des CSPi-CM saines et dérivées du patient sont présentées. En outre, les évaluations multiparamétriques utilisant des combinaisons de variantes d’indicateurs d’affinité spectrale et calcique (NIR-GECO, LAR-GECO et mtGCEPIA ou Orai1-G-GECO) sont limitées à différents compartiments cellulaires sont également démontrées dans le modèle iPSC-CM.

L’observation de l’oscillation spontanée du calcium dans mNG-GECO10 exprimée par les cardiomyocytes dérivés des CSPi (CSPi-CM) avec ou sans traitements médicamenteux est démontrée dans la figure 1 et la vidéo animée 1. Les traces cinétiques obtenues à l’aide de mNG-GECO montrent que les petits inhibiteurs moléculaires des canaux ioniques, le vérapamil, le dofétilide et le E4031, ont affecté les transitoires calciques (Figure 1B) comme prévu. Le transitoire calcique typique illustré à la figure 1C peut être analysé par le logiciel d’analyse des pics de calcium pour dériver le signal de crête (amplitude), la durée transitoire du calcium 50% (CTD50), la durée transitoire du calcium 90% (CTD90), le temps de montée et le temps de désintégration. Le vérapamil, un bloqueur de calcium de type L17, inhibe complètement l’afflux de calcium dans les cellules comme prévu (Figure 1B). Le dofétilide et le E4031 sont des inhibiteurs du canal hERG18,19,20, répertoriés comme médicaments antiarythmiques expérimentaux de classe III. Le temps de désintégration est prolongé avec le traitement par dofétilide (p < 0,05) et E4031 (p < 0,001) par rapport au groupe de véhicules. Un allongement de CTD50 (p < 0,01) et CTD90 (p < 0,001) avec le traitement E4031 a été observé par rapport au véhicule seul (tableau 1), ces résultats sont cohérents avec les effets rapportés sur l’intervalle QT, une mesure cliniquement pertinente de la repolarisation déterminée à partir de l’électrocardiogramme de surface sur une longue période entre le début de l’onde Q et la fin de l’onde T, dans des études antérieures12,21.
Une difficulté de l’évaluation de la CTD dans les cellules battant spontanément est la variabilité que le taux de battement impose au CTD. C’est un problème particulier pour le modèle iPSC-CM, où chaque puits d’une plaque de 96 puits peut avoir son propre taux de battement même si toutes les cellules proviennent du même flacon parent. Il est possible d’imposer un rythme de battement par stimulation optique ou électrique. Pour évaluer la relation dose-réponse du E4031 dans des conditions de rythme normalisées, les iPSC-CM exprimant ChR2 et K-GECO7 ont été contrôlés optiquement à l’aide d’impulsions lumineuses de 1 Hz à 470 nm et observés à l’aide du signal rouge K-GECO (figure 2A et figure supplémentaire 1). Des réductions progressives de l’amplitude maximale (p < 0,01) et une augmentation du temps de désintégration (p < 0,05) des transitoires calciques se produisent avec l’augmentation des concentrations de E4031 (figure 2B1). Un effet dose-dépendant de E4031 était le plus apparent pour les réductions de l’amplitude maximale (Figure 2B1,B2).
Bien que des études à court terme de quelques minutes soient généralement utilisées pour les évaluations de la cardiotoxicité, il existe un angle mort pour les évaluations de la toxicité chronique qui correspondent à l’exposition des patients aux médicaments pendant des semaines, des mois ou des années. Il serait avantageux d’étudier les effets de la maladie, ou de la toxicité, sur les intervalles reflétant les durées de traitement pertinentes pour la pratique clinique. Nous avons utilisé notre système de contrôle et de détection entièrement optique pour étudier les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC d’un patient atteint de non-compactage ventriculaire gauche (LVNC). Les iPSC-CM ont été transduits avec un kit viral K-GECO (étape 2.2-2.6) après le 25e jour de différenciation. Le signal K-GECO a ensuite été suivi toutes les 1-2 semaines dans les mêmes puits, avec ou sans traitements médicamenteux supplémentaires. L’activité spontanée du calcium (Figure 3A, 3B) et la dynamique calcique sous stimulation optique (Figure 3C, D, étape 4.11) ont été obtenues à l’aide du système d’imagerie à haut contenu (étapes 4.1-4.12) et traitées par un logiciel d’analyse des pics calciques (étape 6). Comme le montre la figure 3A,C, les transitoires de calcium clair restent visibles un mois après la transduction virale, avec ou sans la lumière supplémentaire utilisée pour la stimulation optique. Ce travail a identifié un médicament qui semble augmenter le taux de battement, régulariser l’intervalle de contraction et augmenter l’amplitude transitoire du calcium dans le modèle LVNC iPSC-CM (Figure 3A,B). Il y a deux observations importantes à faire à partir de ces données. Tout d’abord, du point de vue thérapeutique, l’effet du médicament semble durable aux jours 63 et 70. Deuxièmement, et d’une pertinence pour un domaine qui, en général, analyse les effets composés pendant de brèves fenêtres (<1 min) à des points temporels antérieurs (généralement <50 jours); les effets modificateurs du phénotype de la maladie du composé ne sont apparents qu’après le jour 60, ce qui suggère qu’il peut être facile d’écarter les médicaments qui ont des mécanismes d’action lents dans les protocoles de dépistage standard.
La variabilité de la fréquence des battements et l’impact subséquent sur la durée transitoire du calcium ne sont pas seulement un problème de puits à puits à un moment donné. Il change également à mesure que les CSPi-CM sont maintenus en culture, ce qui varie au sein d’un puits au fil du temps (figure 3B). Pour imposer la cohérence au sein d’expériences séquentielles, une stimulation optique de 1 Hz peut être appliquée avec ou sans traitement médicamenteux (Figure 3C,D). Ici, bien que les résultats du jour 63 montrent les tendances encourageantes du transitoire calcique avec une amplitude significativement plus élevée, un CTD90 plus court et un temps de désintégration plus court; au bout de 70 jours - et ce qui indique la nécessité d’évaluations chroniques au cours du processus de dépistage des maladies rares - tôt après la détection des dépolarisations (EAD). L’intérêt d’ajouter un protocole de stimulation au phénotypage de la maladie, ou à l’évaluation des petites molécules, peut être évalué qualitativement en comparant les résultats présentés à la figure 3B, D pour le taux de battement, l’amplitude transitoire du calcium, CTD90 et le temps de désintégration.
Un avantage d’une méthodologie basée sur le GECI, par rapport à un colorant chimique, pour visualiser le transitoire calcique est la possibilité de restreindre la sonde à un compartiment spécifique au sein d’une cellule. Cela peut être encore étendu en multiplexant plusieurs variantes de couleur et / ou d’affinité dans des cellules uniques. Par conséquent, plusieurs GECI, dont ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA 22,23 (ou Oria1-G-GECO) et NIR-GECO2 8,24, ont été développés pour être exprimés seuls ou en combinaison dans des modèles cellulaires pour la mesure en temps réel de l’activité calcique dans le réticulum endoplasmique / réticulum sarcoplasmique (ER/SR), les mitochondries (ou canal CRAC) et le cytosol, respectivement. Ils peuvent être combinés dans le modèle iPSC-CM (Figure 4A,C) pour étudier l’interaction entre différentes réserves intracellulaires de calcium. Par exemple, un traitement à la caféine de 10 mM peut être utilisé pour vider la réserve de calcium SR. Ici, une diminution du signal ER-LAR-GECO (indiquant une perte de calcium due au SR) a été parallèle à une baisse du signal NIR-GECO (indiquant une augmentation de la concentration de calcium cytosolique) comme prévu. La façon dont les autres compartiments intracellulaires sont affectés par ces fluctuations n’est pas bien étudiée. Néanmoins, l’inclusion d’un mtGCEPIA3 vert ciblant les mitochondries montre que l’absorption du calcium se produit dans les mitochondries dans ces conditions (Figure 4A, B).
De même, la visualisation de l’interaction entre différents courants de calcium peut être vue en incluant une sonde, Orai1-G-GECO25, pour révéler le courant Ca2+ du canal activé par libération de calcium (CRAC) (Figure 4C,D). Dans le modèle iPSC-CM, ce signal augmente avec le transitoire cytosolique cytosolique spontané (Figure 4D1,D2). Dans cette optique, le traitement à la caféine évoque un important transitoire calcique à la fois dans le cytosol et dans le canal Orai1.
Il est reconnu que la plupart des images transitoires de calcium dans les modèles de cardiomyocytes ont été déterminées à l’aide de colorants calciques26. Un indicateur de calcium génétiquement codé a été comparé à un colorant chimique dans le modèle de cardiomyocytes dérivé de l’iPSC pour permettre une comparaison côte à côte de différentes approches d’imagerie calcique. Les iPSC-CM exprimant K-GECO ont été imagés à côté de cellules chargées de Fluo-4. Les cardiomyocytes exprimant K-GECO ont montré un comportement de battement constant au fil du temps (Figure 5A,C). Cependant, la charge de Fluo-4 a eu un impact à la fois sur la fréquence des battements et sur le CTD dans ce modèle (Figure 5B, C), ce qui suggère que Fluo-4 lui-même pourrait influencer les résultats de telles expériences. Cela sera particulièrement vrai après une exposition à long terme à la sonde d’imagerie, ce qui peut se produire dans le format d’imagerie multiparoi si l’imagerie puits par puits se produit avec un temps de séjour infime par puits.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig01.jpg"> Figure 1 : Inhibiteurs des canaux ioniques à petites molécules appliqués aux cardiomyocytes dérivés de l’iPSC. (A-B) Images accélérées de l’iPSC-CM exprimant mNG-GECO prises à 25 Hz. Barre d’échelle = 50 μm. (B) Oscillations représentatives de Ca2+ après addition de composés. Les signaux fluorescents obtenus à partir de cellules exprimant mNG-GECO sont présentés sous la forme d’un rapport de fluorescence F/F0, où F0 est défini comme intensité basale et F comme intensité détectée à chaque point temporel. (C) Le logiciel d’analyse des pics calciques peut extraire des paramètres, notamment la demi-largeur maximale (CTD50), la durée transitoire de 90% (CTD 90), le temps de montée et le temps de désintégration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig02.jpg"> Figure 2 : Exemple dose-réponse utilisant l’inhibiteur de l’hERG E4031 dans un système de stimulation optique. (A) Traces de stimulation optique avec 10% de lumière bleue à différentes concentrations de E4031. Images accélérées de cardiomyocytes dérivés de l’iPSC exprimant K-GECO prises à 25 Hz. (B1) Traces représentatives de transitoires calciques obtenues avec différentes doses de composés. Analyse des pics et dose-réponse de E4031 en amplitude (B2) et temps de désintégration (B3). Les barres bleues indiquent une stimulation lumineuse pulsée de 1 Hz à 470 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig03.jpg"> Figure 3 : Plateforme entièrement optique appliquée au criblage phénotypique à long terme des médicaments dans les cardiomyocytes LVNC dérivés de patients. (A) Trace représentative de l’activité de battement spontané dans les cardiomyocytes dérivés du patient (post-différenciation Jour 70) avec (rouge) ou sans traitement médicamenteux (bleu) 5 μM. (B) Analyse maximale de l’activité de battement spontané avec ou sans traitement médicamenteux de 5 μM. (C) Traces d’intensité de réponse médicamenteuse dans l’iPSC-CM d’origine patiente sous stimulation optique de 1 Hz. (D) Analyse de pointe des cardiomyocytes dérivés du patient avec stimulation optique 1 Hz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig04.jpg"> Figure 4 : Imagerie subcellulaire Ca 2+ à trois canaux dans le modèle iPSC-CM. (A-B) Les iPSC-CM ont été transduits avec des sondes calciques subcellulaires pour le cytoplasme, NIR-GECO2 (rouge), le réticulum endoplasmique ER-LAR-GECO (jaune) et mtGCEPIA3 (cyan), un indicateur mitochondrial Ca2+. (B) Imagerie calcique accélérée à trois canaux avant et après un traitement à la caféine de 10 mM. (C-D) Les iPSC-CM transduits avec des indicateurs cytoplasmiques, NIR-GECO2 (rouge), réticulum endoplasmique ER-LAR-GECO (jaune) et CRAC Orai1-G-GECO (cyan) ont été visualisés. (D) L’imagerie calcique à trois canaux a été capturée. (D1) Une activité spontanée de battement à battement a été observée avec NIR-GECO2 et Orai1-G-GECO. (D2) L’efflux de calcium du RE (diminution du signal ER-LAR-GECO) a accompagné une augmentation du signal de calcium cytosolique lors du traitement à la caféine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig05.jpg"> Figure 5 : Comparaison de l’indicateur de calcium génétiquement codé (K-GECO) au colorant chimique sensible au calcium (Fluo-4) dans les CSPi-CM. (A-B) Des traces de calcium représentatives de K-GECO (A) et de Fluo-4 (B) sont présentées au fil du temps. (C) Analyse transitoire du calcium de K-GECO transduit, ou Fluo-4 chargé iPSC-CM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Le</td>
			<td>CTD50 (s)</td>
			<td>CTD90 (s)</td>
			<td>Amplitude (F/F0)</td>
			<td>Temps de montée</td>
			<td>Temps (s) de désintégration</td>
		</tr><tr><td>Véhicule (0,1 % DMSO)</td>
			<td>112.3657+/-10.95</td>
			<td>0.25+/-0.04</td>
			<td>0.41+/-0.01</td>
			<td>1.99+/-0.02</td>
			<td>0.07+/-0.01</td>
			<td>0.28+/-0.01</td>
		</tr><tr><td>Vérapamil (1 uM)</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Dofétilide (5 nM)</td>
			<td>103.42+/-9.87**</td>
			<td>0.23+/-0.03</td>
			<td>0.46+/-0.03</td>
			<td>1.91+/-0.03</td>
			<td>0.07+/-0.01</td>
			<td>0.35+/-0.02*</td>
		</tr><tr><td>E4031 (30 nM)</td>
			<td>75.73+/-12.08***</td>
			<td>0.37+/-0.04**</td>
			<td>0.58+/-0.08***</td>
			<td>1.55+/-0.02**</td>
			<td>0.11+/-0.04***</td>
			<td>0.35+/-0.07**</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Effets de l’addition de composés aux paramètres transitoires de calcium dans le modèle iPSC-CM. Les valeurs de signification sont indiquées par *(p ≤ 0,05), **(p < 0,01) et ***(p < 0,001). 
Vidéo animée 1 : Une activité calcique spontanée a été observée par mNG-GECO dans des cardiomyocytes dérivés de l’iPSC avec véhicule seulement. Un film pseudo-coloré d’une image en niveaux de gris est fourni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/fig1-video.avi" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Figure supplémentaire 1 : Représentation schématique du vecteur adénoviral. Cela inclut la rhodopsine ChR2 en tant qu’actionneur, avec un indicateur de calcium fluorescent rouge K-GECO comme rapporteur de calcium pour un test entièrement optique. Le canal ionique sensible à la lumière permet aux cellules excitables d’être dépolarisées par la lumière dans la gamme bleu-vert du spectre visible. Une lumière de 470 nm a été utilisée dans ces expériences. Les transitoires de calcium dans les cellules excitables peuvent être imagés simultanément par K-GECO, qui nécessite une lumière d’excitation verte, produisant des émissions rouges. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/Sup%20r1.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening

Le présent protocole décrit le contrôle et l’observation entièrement optiques de l’activité cellulaire déclenchée dans les cardiomyocytes dérivés des CSPi (CM-iPSC) pour le dépistage de médicaments à haut débit et les tests de toxicité. La quantification multi-paramétrique des modèles phénotypiques dans le temps et l’espace est montrée. Les effets à long terme des médicaments sur plusieurs heures, ou des mesures séquentielles sur plusieurs jours, sont démontrés.

Contrôle optique à haut débit et enregistrement du signal calcique dans les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC pour les tests de toxicité et le criblage de médicaments phénotypiques

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. ...

Nous démontrons d’innombrables méthodes pour tout le contrôle optique et l’observation de l’activité cellulaire déclenchée dans les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC pour le dépistage de médicaments à haut débit et les tests de toxicité. Permet une quantification multiparamétrique des modèles phénotypiques dans le temps et l’espace, permet d’observer l’effet des médicaments sur des heures ou des jours. Cette méthode peut être appliquée à différents types de cellules, telles que les neurones ou les cellules bêta, pour le dépistage fonctionnel et les tests de toxicité.La démonstration de la procédure sera assurée par Wan-Chi Su, un ingénieur en bio-imagerie de mon laboratoire. Préparez la plaque multipuits avant que les cardiomyocytes iPSC ne soient retirés de l’entreposage frigorifique pour la décongélation. Enduisez chaque puits de la microplaque de 96 puits avec 100 microlitres de solution de gélatine à 0,02% avec 50 microgrammes par millilitre de fibronectine pour couvrir toutes les surfaces en profondeur.Transférer les cardiomyocytes iPSC du réservoir de stockage d’azote liquide au bain-marie de 37 degrés Celsius. Apportez le flacon dans une enceinte de biosécurité de classe deux et transférez délicatement le contenu dans un nouveau tube conique de 15 millilitres contenant neuf millilitres de milieu à température ambiante. Centrifuger les cellules à 200 fois G pendant trois minutes à température ambiante.Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre doucement les cellules en suspension dans un millilitre de milieu avec 10 micromolaires inhibiteurs de ROCK Y27632. Les cellules à plaques ont encodé 96 plaques de puits à la densité de 100 000 à 150 000 cellules par centimètre carré, conformément aux instructions du fabricant. Après 24 heures, assurez-vous que les cellules fixées à la surface de la plaque sont en contact avec d’autres cellules.Après avoir plaqué les cellules pendant 72 heures, décongelez les kits viraux GECI sur de la glace. Préparez une solution de souche de kit viral à double concentration avec le milieu d’entretien. Préparez les cellules à l’infection en ajustant le volume moyen à 100 microlitres par puits.Ajouter 100 microlitres de la solution virale prémélangée dans les puits et incuber pendant huit à 16 heures à 37 degrés Celsius. Après incubation, remplacer par 200 microlitres de milieu préchauffé. Visualisez l’expression des GECI 24 heures après la transduction à l’aide d’un système d’imagerie.Maintenir les cellules dans l’incubateur humidifié avant d’effectuer des tests fonctionnels. Allumez tous les appareils du système d’imagerie à contenu élevé. Vérifiez que la température de la chambre atteint 37 degrés Celsius avec une supplémentation en dioxyde de carbone de 5%.Ouvrez le logiciel d’imagerie et choisissez le réglage de la plaque pour une plaque de 96 puits. Placez une plaque de 96 puits sans couvercle dans la chambre et chargez l’anneau d’étanchéité de la cellule sous tension sur le dessus. Choisissez l’objectif d’immersion dans l’eau 20X, 60X et 20X, en fonction de la résolution spatiale requise.Ajustez la mise au point pour prendre des images claires avant l’acquisition expérimentale. Sélectionnez trois à cinq régions au hasard par puits pour l’enregistrement de l’activité calcique. Choisissez des filtres appropriés pour différents indicateurs.Réglez la puissance de la diode électroluminescente appropriée pour chaque canal d’imagerie utilisé. Réglez le temps d’exposition de la caméra sur un maximum de 40 millisecondes ou 25 hertz, et une durée d’enregistrement de 30 secondes pour l’acquisition du flux afin d’observer les transitoires calciques, rapportés par les sondes MNG-GECO et K-GECO exprimés en cardiomyocytes. Augmentez la puissance de la LED si le rapport signal sur bruit est inférieur à deux à des fréquences d’images plus élevées.Pour la stimulation optogénétique, optimisez la puissance et la fréquence de la lumière bleue à un hertz et commencez l’acquisition. Suspendez à nouveau le dofestilide E4031 et le vérapamil dans du DMSO et diluez-les avec le tampon de Tyrode. Disposer les composés sur le puits cible correspondant.Ajoutez 100 microlitres du composé à double résistance via le système micro-fluidique automatique dans les puits et commencez l’acquisition après la période d’incubation souhaitée. Isolez la zone du signal de l’arrière-plan en détectant automatiquement la fonction d’impulsions, au fil du temps, avec le logiciel. Utilisez le logiciel d’analyse des pics de calcium pour analyser la fréquence de battement, le signal de pointe, la durée transitoire du calcium 50% de la durée transitoire du calcium 90% du temps de montée et le temps de désintégration.L’observation de l’oscillation spontanée du calcium dans NMG-GECO exprimée par des cardiomyocytes dérivés de l’iPSC avec ou sans traitements médicamenteux est démontrée dans la vidéo. Les traces cinétiques obtenues à l’aide de MNG-GECO ont montré que les petits inhibiteurs moléculaires des canaux ioniques vérapamil, dofétilide et E4031 affectaient les transitoires calciques comme prévu. Pour évaluer la relation dose-réponse de E4031 dans des conditions normalisées et rythmées, les CM de la cPSC exprimant la rhodepsine-2 et K-GECO ont été contrôlées optiquement à l’aide d’impulsions lumineuses d’un hertz et de 470 nanomètres, et observées à l’aide du signal rouge K-GECO.Des réductions progressives de l’amplitude maximale et une augmentation du temps de désintégration des transitoires calciques se produisent avec l’augmentation des concentrations de E4031. Un effet dose-dépendant de E4031 était le plus apparent pour les réductions de l’amplitude de crête. Les transitoires de calcium clair restent visibles un mois après la transduction virale, ou sans la lumière supplémentaire utilisée pour la stimulation optique.Le graphique représente un médicament qui semble augmenter le taux de battement, régulariser l’intervalle de contraction et augmenter l’amplitude transitoire du calcium, en mode LVNC iPSC CM. La variabilité de la fréquence des battements et l’impact subséquent sur la durée transitoire du calcium changent également à mesure que les CM des CSPi sont maintenues en culture. Plusieurs GECI, y compris ER LAR-GECO, MTG-SÉPIA et NIR-GECO, ont été développés pour l’expression seule ou en combinaison dans des modèles cellulaires pour la mesure en temps réel de l’activité calcique dans le réticulum endoplasmique, le réticulum sarcoplasmique, les mitochondries et le cytosol, respectivement.Les GECI peuvent être combinés dans le modèle CM iPSC pour étudier différentes réserves intracellulaires de calcium. Les cardiomyocytes exprimant K-GECO ont montré un comportement de battement constant au fil du temps. Cependant, la charge de Fluo-4 a eu un impact à la fois sur la fréquence des battements et sur le CTD dans ce modèle, ce qui suggère que Fluo-4 lui-même pourrait influencer les résultats de telles expériences.Nous offrons un moyen simple d’étudier les profils phénotypiques des cellules témoins et des cellules dérivées des patients, tandis que l’intermédiaire iPSC peut faire la lumière sur la découverte de médicaments dans diverses maladies.

Research

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