Name: high-throughput optical controlling and recording calcium signal in ipsc-derived cardiomyocytes for toxicity testing and phenotypic drug screening
Uploaded: 2022-03-31T13:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening at JoVE.com

אנו מודים לפרופ' רוברט קמפבל מאוניברסיטת טוקיו על שיתוף החומר והדיון בעל הערך; ד"ר צ'יה-לין הו ב מכשיר מולקולרי לתמיכה טכנית.

קרדיומיופתיה שאינה קומפקטית בחדר שמאל (LVNC) חולה קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC (iPSC-CM) סופקו על ידי בית החולים האוניברסיטאי הלאומי של טייוואן. איסוף דגימות המטופלים לתכנות מחדש ל- iPSC ופרוטוקולי התחזוקה14 למטרות מחקר בוצעו בעקבות הצהרת הלסינקי של WMA (עקרונות אתיים למחקר רפואי המערבים נבדקים אנושיים) ואושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית: משרד ועדת האתיקה למחקר ב- NTUH (#201612099RINC). iPSC-CM אחרים התקבלו מספקים מסחריים. השימוש בנגזרות iPSC אינו דורש הרשאות ספציפיות במוסד שלנו.
1. הכנת קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC
<ol><li>הכינו את הצלחת מרובת הבארות לפני הסרת iPSC-CM מאחסון קר לצורך הפשרה. מצפים כל באר של צלחת 96 בארות עם 100 μL של 50 מיקרוגרם / מ"ל פיברונקטין / 0.2% תמיסת ג'לטין (ראה טבלת חומרים) כדי לכסות את כל המשטחים ביסודיות.</li>
	<li>לדגום את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה באינקובטור לחות.</li>
	<li>יש לחמם את המדיום (ראו טבלת חומרים) לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני הפשרת התא. הערה: הפרוטוקול הנוכחי מתאר את טמפרטורת החדר כ- 25 °C.</li>
	<li>העבירו את ה-iPSC-CM ממיכל אחסון החנקן הנוזלי לאמבט מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הערה: iPS-CMs נשלחים בדרך כלל על קרח יבש על ידי מקורות אקדמיים או מסחריים. הם מועברים לאחסון חנקן נוזלי עם קבלתם עד לשימוש.</li>
	<li>מוציאים את הבקבוקון לפני שהקרח נמס לחלוטין ומרססים את הבקבוקון ב-75% אתנול.</li>
	<li>קח את הבקבוקון לארון בטיחות ביולוגית מדרגה II והעבר בעדינות את התכולה לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של מדיום טמפרטורת החדר.</li>
	<li>צנטריפוגה של התאים ב 200 x גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש להשליך את הסופר-נאטנט על ידי פיפטה ולתלות בעדינות את התאים ב-1 מ"ל של מדיום עם 10 מיקרומטר של מעכב ROCK (Y27632) (ראו טבלת חומרים). הערה: הימנע מצינורות חוזרים ונשנים של תאים מופשרים כדי להבטיח התאוששות מרבית של התאים.</li>
	<li>הסר את תמיסת הציפוי מהבאר והוסף 50 μL של בינוני עם 10 μM של מעכב ROCK במהירות.</li>
	<li>אשר את מספר התאים בני קיימא באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של טריפאן עם המוציטומטר15.</li>
	<li>תאי צלחת בצלחת מצופה 96 באר בצפיפות של 100,000-150,000 תאים לס"מ2, לפי הוראות היצרן16.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, ודא שהתאים המחוברים לפני השטח של הצלחת נמצאים במגע עם תאים אחרים. הערה: תאים בודדים שורדים בצורה גרועה בתרבית ארוכת טווח ובדרך כלל מתנהגים בצורה שונה יותר.</li>
	<li>החלף אמצעי תחזוקה מחומם מראש כל יומיים. הערה: עבור טיפול תרופתי ארוך טווח, LVNC iPSC-CM הוחלפו עם חצי תחליפים בינוניים עם, או בלי, תרופות מולקולות קטנות כל יומיים.</li>
</ol>2. ביטוי של מחווני סידן מקודדים גנטית
<ol><li>לאחר ציפוי התאים במשך 72 שעות, הפשירו את ערכות הנגיפיות של GECIs (ראו טבלת חומרים) על קרח.</li>
	<li>הכינו פתרון מלאי של ערכה ויראלית פי 2 עם מדיום התחזוקה.</li>
	<li>הכן את התאים לזיהום על ידי התאמת הנפח הבינוני ל -100 μL לכל באר. הוסיפו 100 μL של התמיסה הנגיפית המעורבבת מראש ודגרו במשך 8-16 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>יש להחליף ב-200 μL מדיום שחומם מראש לאחר הדגירה.</li>
	<li>דמיינו את ביטוי ה-GECIs 24 שעות לאחר הטרנסדוקציה באמצעות מערכת הדמיה (ראו טבלת חומרים). הערה: רמת הביטוי מגיעה למקסימום של 48-72 שעות לאחר ההתמרות. ניתן לדמות תאים מנקודת הזמן של 24 שעות. עם זאת, האותות המתקבלים מ- GECIs נמשכים יותר מחודש.</li>
	<li>שמור על תאים באינקובטור הלח לפני ביצוע בדיקות פונקציונליות.</li>
	<li>הדביקו את ה-iPSC-CMs (iPSC-CMs שמקורם בחולה LVNC) בערכה נגיפית ChR2-K-GECO (ראו טבלת חומרים) ביום ה-25 לאחר ההתמיינות באמצעות פרוטוקול ההדבקה (שלב 2.1-2.6).</li>
</ol>3. הדמיית סידן על בסיס צבע באמצעות Fluo-4
<ol><li>יש להמיס אבקת Fluo-4 (ראו טבלת חומרים) ב-DMSO כתמיסת מלאי (5 mM).</li>
	<li>דלל את תמיסת המלאי לריכוז של 10 μM Fluo-4 במאגר של Tyrode. הערה: המאגר של הטירודה מורכב מ-1.0 גרם/ליטר של סודיום ביקרבונט, 0.2 גרם/ליטר של סידן כלורי, 0.1 גרם/ליטר של מגנזיום כלוריד, 0.2 גרם/ליטר של אשלגן כלורי, 8.0 גרם/ליטר של נתרן כלורי, 0.05 גרם/ליטר של נתרן פוספט מונובאסיק ו-1.0 גרם/ליטר של D-גלוקוז.</li>
	<li>החלף חצי מדיום עם 10 μM של תמיסת Fluo-4 (נותן ריכוז סופי של 5 μM).</li>
	<li>לדגום את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.</li>
	<li>שטפו את התאים עם חיץ של טירודה שחומם מראש והחליפו אותם במדיום לפני רכישת התמונה.</li>
	<li>התחל להקליט עם פרוטוקול רכישת הזרם. הערה: רכישת זרם רוכשת תמונות ברציפות ללא זמן מרווח. תדירות הפעימה של iPSC-CM היא כ -1 הרץ, ופרוטוקול רכישת זרם זה משמש לאיסוף דפוסי פעימה.</li>
</ol>4. רכישת תמונה ומבחנים פונקציונליים לבדיקת רעילות וסינון פנוטיפי
<ol><li>הפעל את כל ההתקנים של מערכת ההדמיה בעלת התוכן הגבוה (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>ודא שטמפרטורת התא מגיעה ל-37 מעלות צלזיוס, עם תוספת של 5% CO2 . שמור על המערכת בשיווי משקל למשך שעתיים לפני רכישת התמונה. הערה: סחיפה תרמית היא בעיה משמעותית עבור תצפיות ארוכות טווח של תאים חיים, 1 °C יכול לשנות את מישור המוקד ב~1 מיקרומטר, ולכן מתן אפשרות לעדשה, ולשלב, להגיע לטמפרטורת היעד הוא חיוני לפני רכישת התמונה.</li>
	<li>פתח את תוכנת ההדמיה (ראה טבלת חומרים) ובחר את הגדרת הצלחת עבור צלחת של 96 בארות.</li>
	<li>הכניסו לתא צלחת לא מכוסה של 96 בארות וטענו אותה עם טבעת האיטום של התא החי מעליה. הערה: טבעת האיטום של תאים חיים היא מתאם להגעה לשיווי משקל סביבתי.</li>
	<li>בחרו את העדשה האובייקטיבית 20x (איור 1 ואיור 2), 60x (איור 3 ואיור 4) ו-20x (איור 5) לטבילת מים בהתאם לרזולוציה המרחבית הנדרשת.</li>
	<li>התאם את המיקוד כדי לצלם תמונות ברורות לפני הרכישה הניסיונית.</li>
	<li>בחר 3-5 אזורים באופן אקראי לכל באר לרישום פעילות סידן. הערה: כל אזור חייב לכלול לפחות 20 תאים (n ≥ 20).</li>
	<li>בחר מסננים מתאימים עבור מחוונים שונים. FITC 475/536 עבור mNG-GECO, mtGCEPIA3 ו-Oria1-G-GECO; Cy5 631/692 עבור NIR-GECO2; ER 530/593 עבור ER-LAR-GECO; טקסס רד 560/624 עבור K-GECO.</li>
	<li>הגדר את עוצמת הדיודה פולטת האור (LED) המתאימה לכל ערוץ הדמיה שנעשה בו שימוש. הערה: בעת מיטוב עוצמת ה-LED לקליטת הדמיה לפי אות (עוצמת האובייקט שזוהתה) ליחס רעש (עוצמת הרקע שזוהתה), יחס ה-S/N צריך להיות גבוה מ-2. בפרוטוקול זה, 10% הספק LED עבור TRITC ו- FITC; 20% עבור Cy5 היה אופייני.</li>
	<li>הגדר את זמן החשיפה של המצלמה למקסימום של 40 אלפיות השנייה (25 הרץ) ומשך הקלטה של 30 sfor stream כדי לצפות בטרנזיינטים של סידן שדווחו על-ידי בדיקות mNG-GECO ו-K-GECO המתבטאות בקרדיומיוציטים (איור 1-3 ואיור 5). הגדל את עוצמת ה-LED אם האות/הרעש <2 בקצבי פריימים גבוהים יותר.</li>
	<li>עבור גירוי אופטוגנטי (איור 2 ואיור 3C,D), מטב את ההספק (בדרך כלל 5%-10%) ואת התדירות של אור כחול ב-1 הרץ. הערה: באופן כללי, iPSC-CM אנושי פועם באופן ספונטני סביב ~ 1 הרץ, והמפעיל צריך לקצב מהר יותר מהקצב הספונטני.</li>
	<li>אם מתוכננות מדידות עוקבות (איור 3) או מורחבות (איור 4), הימנעו מפוטוטוקסיות בכל מחיר. משמעות הדבר עשויה להיות הפחתת עוצמת ההארה ופיצוי על כך על-ידי הגדלת זמן החשיפה של המצלמה, לדוגמה, ל-100 אלפיות השנייה באמצעות פרוטוקול קיטועי הזמן המשמש לתצפית בזמן אמת בשלושה ערוצים של אותות Ca2+ תת-תאיים (איור 4).</li>
	<li>השתמש בפרוטוקול החלוקה האסינכרוני לתוספת קפאין של 10 mM באמצעות מערכת המיקרופלואידיקה האוטומטית (ראו טבלת חומרים) (איור 4). הערה: פרוטוקול החלוקה האסינכרוני מאפשר רכישת תמונה בזמן הוספת תרופות כגון קפאין, ללא רווחים בין התמונות.</li>
	<li>התחל רכישה.</li>
</ol>5. הכנת מולקולות קטנות
<ol><li>החזירו את ה-E4031, הדופטיליד והוראפאמיל ב-DMSO ודללו אותם עם החיץ של טיירוד. הריכוז הסופי של DMSO בתווך היה 0.1% (v/v).</li>
	<li>הכינו את התמיסות המורכבות בריכוז העבודה הרצוי (כלומר, פי 2) ובשיווי משקל ב-37 מעלות צלזיוס לפני התוספת. הערה: מזעור תנודות הטמפרטורה לאחר תוספת בינונית הוא חיוני מכיוון שההתכווצות תלויה בטמפרטורה, וההשפעה של שינוי הטמפרטורה מהירה.</li>
	<li>סדרו תרכובות לבאר היעד המתאימה.</li>
	<li>הוסף 100 μL של תרכובות חוזק כפול (2x) באמצעות מערכת microfluidics אוטומטי (ראה טבלת חומרים) לתוך הבארות ולהתחיל לרכוש לאחר תקופת הדגירה הרצויה (בדרך כלל 15 דקות).</li>
</ol>6. עיבוד וניתוח הדמיה
<ol><li>בודד את אזור האות מהרקע על ידי זיהוי התכונה של הדופק לאורך זמן-סיבוב באופן אוטומטי עם התוכנה.</li>
	<li>השתמשו בתוכנה לניתוח שיא סידן (ראו טבלת חומרים) כדי לנתח תדירות פעימה (BPM), אות שיא (משרעת), משך ארעי סידן 50% (CTD50), משך ארעי סידן 90% (CTD90), זמן עלייה וזמן דעיכה (איור 1C). הערה: בהגדרות אלה ניכרה הלבנת תמונות במהלך 10 השניות הראשונות, והאותות מתייצבים לאחר מכן. לפיכך, שיא הסידן נותח בין 11-30 שניות. בהקלטות תלת-ערוציות (איור 4), קווי המתאר של התאים מוגבלים באופן ידני למדידת שינויים בעוצמה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Connor, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3R+principle:+Advancing+clinical+application+of+human+pluripotent+stem+cells.">The 3R principle: Advancing clinical application of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (2), 21 (2013).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Ovics, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development+and+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+disease+modeling+and+drug+toxicity+screening.">Drug development and the use of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for disease modeling and drug toxicity screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7320 (2020).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).</li><li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Ca(2+)+indicators+directly+inhibit+the+Na,K-ATPase+and+disrupt+cellular+functions.">Fluorescent Ca(2+) indicators directly inhibit the Na,K-ATPase and disrupt cellular functions.</a> Science Signaling. 11 (515), (2018).</li><li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+Ca2++indicator+based+on+circularly+permutated+sea+anemone+red+fluorescent+protein+eqFP578.">A genetically encoded Ca2+ indicator based on circularly permutated sea anemone red fluorescent protein eqFP578.</a> BMC Biology. 16 (1), 9 (2018).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+near-infrared+fluorescent+calcium+ion+indicator.">A genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicator.</a> Nature Methods. 16 (2), 171-174 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+Ca2++indicators+for+use+in+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum.">Red fluorescent genetically encoded Ca2+ indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum.</a> Biochemical Journal. 464 (1), 13-22 (2014).</li><li>Zarowny, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+high-performance+genetically+encoded+Ca2++indicator+based+on+mneongreen+fluorescent+protein.">and high-performance genetically encoded Ca2+ indicator based on mneongreen fluorescent protein.</a> ACS Sensors. 5 (7), 1959-1968 (2020).</li><li>Potekhina, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+with+genetically+encoded+fluorescent+sensors:+today+and+tomorrow.">Drug screening with genetically encoded fluorescent sensors: today and tomorrow.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 148 (2021).</li><li>Chang, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+phenotyping+and+drug+testing+in+single+cardiomyocytes+or+beta-cells+by+calcium+imaging+and+optogenetics.">Non-invasive phenotyping and drug testing in single cardiomyocytes or beta-cells by calcium imaging and optogenetics.</a> PLoS One. 12 (4), 0174181 (2017).</li><li>Chang, Y. -. F., Arai, Y., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+activation+during+detector+&amp;#34;dead+time&amp;#34;+enables+compatible+real-time+fluorescence+imaging.">Optogenetic activation during detector &amp;#34;dead time&amp;#34; enables compatible real-time fluorescence imaging.</a> Neuroscience Research. 73 (4), 341-347 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiomyocyte+and+fibroblast+interaction+using+layer-by-layer+deposition+facilitates+synchronisation+of+cardiac+macro+tissues.">Modulating cardiomyocyte and fibroblast interaction using layer-by-layer deposition facilitates synchronisation of cardiac macro tissues.</a> Soft Matter. 16 (2), 428-434 (2020).</li><li>Leonard, R. G., Talbert, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-channel+blocking+agents.">Calcium-channel blocking agents.</a> Clinical Pharmacology. 1 (1), 17-33 (1982).</li><li>Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+components+of+cardiac+delayed+rectifier+K++current.+Differential+sensitivity+to+block+by+class+III+antiarrhythmic+agents.">Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents.</a> The Journal of General Physiology. 96 (1), 195-215 (1990).</li><li>Lees-Miller, J. P., Duan, Y., Teng, G. Q., Duff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinant+of+high-affinity+dofetilide+binding+to+HERG1+expressed+in+Xenopus+oocytes:+Involvement+of+S6+sites.">Molecular determinant of high-affinity dofetilide binding to HERG1 expressed in Xenopus oocytes: Involvement of S6 sites.</a> Molecular Pharmacology. 57 (2), 367-374 (2000).</li><li>Kamiya, K., Niwa, R., Mitcheson, J. S., Sanguinetti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+HERG+channel+block.">Molecular determinants of HERG channel block.</a> Molecular Pharmacology. 69 (5), 1709-1716 (2006).</li><li>Fukushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+induction+and+long-term+maintenance+of+high+purity+ventricular+cardiomyocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Specific induction and long-term maintenance of high purity ventricular cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 15 (11), 0241287 (2020).</li><li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging.">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophysical Journal. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li><li>Suzuki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intraorganellar+Ca2++at+subcellular+resolution+using+CEPIA.">Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA.</a> Nature Communications. 5, 4153 (2014).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetically+encoded+near-infrared+fluorescent+calcium+ion+indicators+for+in+vivo+imaging.">Improved genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicators for in vivo imaging.</a> PLoS Biology. 18 (11), 3000965 (2020).</li><li>Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+single-channel+optical+recording+reveals+multiple+Orai1+gating+states+and+oscillations+in+calcium+influx.">Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 440-445 (2016).</li><li>Broyles, C. N., Robinson, P., Daniels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent,+bioluminescent,+and+optogenetic+approaches+to+study+excitable+physiology+in+the+single+cardiomyocyte.">Fluorescent, bioluminescent, and optogenetic approaches to study excitable physiology in the single cardiomyocyte.</a> Cells. 7 (6), 51 (2018).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Haery, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+technologies+and+methods+for+targeted+neuronal+manipulation.">Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).</li><li>Nieuwenhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+adeno-associated+viral+vector-mediated+transduction+of+the+corticospinal+tract:+Comparison+of+four+promoters.">Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: Comparison of four promoters.</a> Gene Therapy. 28 (1), 56-74 (2021).</li><li>Smith, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+promoter+function+and+cell-type-specific+expression+from+viral+vectors+in+the+nervous+system.">Characterization of promoter function and cell-type-specific expression from viral vectors in the nervous system.</a> Journal of Virology. 74 (23), 11254-11261 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+an+immune+cell-specific+chimeric+promoter+in+regulating+anti-PD-1+antibody+expression+in.">Safety and efficacy of an immune cell-specific chimeric promoter in regulating anti-PD-1 antibody expression in.</a> CAR T cells. Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 19, 14-23 (2020).</li></ol>

LumiSTAR הגישה בקשה להגנת פטנט על השימוש ב-K-GECO, NIR-GECO ו-LAR-GECO.

כדי לבצע בהצלחה סינון בתפוקה גבוהה, האותות חייבים להיות מפוזרים באופן שווה על פני כלי התרבית, מה שמבטיח שניתן יהיה ליישם אזורי עניין (ROIs) שנבחרו באקראי באופן אוטומטי במהלך רכישת ההדמיה. למרות שמדדי סידן כימיים עומדים בקלות בדרישה זו, בדיקות מקודדות גנטית ייצרו באופן היסטורי טלאים, ולא יריעות, של אות המגבילים את השימוש בהם. השימוש במערכת התמרה נגיפית מספק רמות ביטויגבוהות של 27,28 ושווה ערך של אינדיקטורים מרובים בקרב תאי המטרה בהשוואה לשיטות טרנספקציה קונבנציונליות. סוגי תאים שונים עשויים לדרוש מקדמים שונים, וייתכן שבחירת מערכת העברת הגנים תצטרך להשתנות בהתאםל-29,30,31. במודלים של תאים הטרוגניים, יעילות ההתמרה וההבעה עשויה להיות שונה בסוגי תאים ספציפיים. מצד אחד, זה עשוי להגביל את היישום לתאים מסוימים, אבל התופעה יכולה להיות מנוצלת כדי להבחין בין תאים מסוימים במערכת תרבית משותפת32.
ההשפעה העיקרית של גישה זו היא השחרור ממערכת היחסים של אחד לאחד בין הנסיין לבין המדגם על ידי אוטומציה. בניסוי סטנדרטי מרובה בארות, לאיסוף נתונים בארבעה מיקומים בתוך באר אחת, אנו מעריכים שנדרשות כ-15 שעות במיקרוסקופ כדי לאסוף סרטונים של 30 שניות מצלחת של 96 בארות. במערכת האוטומטית, זה לוקח ~ 4 שעות. יתר על כן, ניתוח הנתונים באופן ידני לוקח הרבה יותר זמן מאשר רכישת נתונים. מערכת הניתוח המשמשת כאן מהירה בערך פי 200 מהמקבילה הידנית. התוצאה נטו היא זרימת עבודה משופרת וחיסכון גבוה בעלויות ובזמן.
בניגוד לקרדיומיוציטים ראשוניים עמוסים בצבעי סידן ששורדים בסדר שעות, GECIs המתבטאים ב-iPSC-CM באמצעות מערכות העברת נגיפים יכולים להניב אות במודל ניסיוני שחי כמה חודשים. מודלים אלה יכולים להישמר בפורמט רב-בארות ולעקוב אחריהם בו-זמנית לצורך ניתוח סדרתי במערכות הדמיה בעלות תוכן גבוה שפותחו לסינון מולקולות קטנות. זה מייצר פלטפורמה ניסויית אנושית פשוטה לבדיקת השפעות תרופות על פני משכי זמן קרובים יותר לאלה שחווים חולים (שבועות או חודשים) ולא את הדקות המשמשות בדרך כלל במבחני טוקסיקולוגיה.
ניתן להרחיב את המערכת כדי לספק מדידות מרובות פרמטרים על ידי הכללת GECIs עם תכונות פליטה ייחודיות מירוק ועד אינפרה-אדום קרוב. ניסויים כאלה דורשים אורות עירור נאותים וערכות סינון בתכנון הניסוי כדי לשמור על אותות נפרדים. יישום רחב בהקשר של סינון תרופות דורש פלטפורמות ניתוח חזקות ויעילות בנוסף לחלוקת תרופות. למרות שהמודל המתואר כאן מתמקד בשימוש במספר מדדי סידן דינמיים, ניתן לשנות זאת לסמנים מבניים של צורת התא או תפקודו. בדרך כלל קל יותר לדמיין אותם מכיוון שהם מראים שונות קטנה מפעימה לפעימה בהשוואה לשונות של פי מאה בריכוז הסידן התוך-תאי. גישה זו עשויה להיות בעלת ערך רב במיוחד עבור מחלות נדירות שבהן ה-iPSC הנגזר מחולים עשוי להכיל את כל המניעים הגנטיים והמשנים של מצב מסוים אשר ניתן לשמר במודל תא הניתן להרחבה, מה שמקל על גילוי תרופות במחלות שונות המבוססות על פנוטיפים תאיים שניתן לדמיין ללא תלות במנגנון הביולוגי הבסיסי אשר עשוי להיות מאתגר להבהיר.

מודלים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) נחשבים לפתרון מבטיח ליעדי 3Rs (החלפה, הפחתה ועידון) שנקבעו למחקרים בבעלי חיים 1,2. קרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC שימשו למידול מחלות ולגילוי תרופות, שכן הם מסכמים היבטים חיוניים של הביולוגיה האנושית3. הדמיית סידן, בדרך כלל עם צבעים כימיים, שימשה לתצפית על פעילות התאים לפני ואחרי טיפול תרופתי 4,5. עם זאת, בדיקות חישת סידן המבוססות על צבע כימי מעכבות ישירות את Na, K-ATPase ומשבשות את תפקוד התאים6. לפיכך, מעקב אחר אותם תאים לאורך שעות או ימים היה בעייתי כאשר נעשה שימוש בצבעים כימיים. כאן, מגוון של מדדי סידן מקודדים גנטית (GECIs)7,8,9,10 מנוצלים על פני ספקטרום רחב של עירור/פליטה וזיקת סידן כדי ליצור פלטפורמה לבדיקת רעילות לב המציעה מדידות רב-אברונים בזמן אמת על פני פרקי זמן ממושכים 11.
כדי להמשיך ולפתח את רעיון הסינון מבוסס הסידן בתפוקה גבוהה במודל iPSC-CM מעבר להקשר האקדמי שהוכח בעבר באמצעות כלים מקודדים גנטית לבקרה אופטית והדמיית סידן על ידי ביטוי משותף של מחוון סידן בהסטה אדומה, R-GECO או K-GECO עם כלי אופטוגנטי, ChR212,13, ערכות ויראליות מהמדף נוצרו. על ידי העברת ההדמיה למכשיר בעל תוכן גבוה המצויד במערכת מיקרופלואידית אוטומטית, צנרת חד-ערוצית של תוספת תרכובת מונחת בשכבות על גבי הדמיה של תאים חיים. לבסוף, שני ההיבטים החיוניים של מסלול הניסוי, עיבוד התמונה והניתוח משופרים ואוטומטיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>auto microfluidic system</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td>A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1096780100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dofetilide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PZ0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4031</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-LAR-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AA001a</td>
			<td>Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Chmical calcium sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-CMs Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CMS-002</td>
			<td>iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium)</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CMS-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AA005a</td>
			<td>Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LumiCAL software</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>LUCS01a</td>
			<td>Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL008a</td>
			<td>Brighter green GECI packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-GCEPIA3 viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL011a</td>
			<td>GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AV004a</td>
			<td>Near infrared GECI packed into viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orai1-GGECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL010a</td>
			<td>GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput optical controlling and recording calcium signal in ipsc-derived cardiomyocytes for toxicity testing and phenotypic drug screening

הבנת האופן שבו תאים מעוררים פועלים בבריאות ובמחלות וכיצד התנהגות זו יכולה להשתנות על-ידי מולקולות קטנות או מניפולציה גנטית היא חשובה. ניתן לשלב מחווני סידן מקודדים גנטית (GECIs) עם חלונות פליטה מרובים (למשל, לתצפית בו-זמנית על אירועים תת-תאיים מובהקים) או להשתמש בהם ביישומים מורחבים עם מפעילים תלויי אור אחרים בתאים מעוררים (למשל, שילוב של בקרה אופטוגנטית מקודדת גנטית עם מחווני סידן תואמים ספקטרלית). גישות כאלה שימשו בנוירונים ראשוניים או בתאי גזע, קרדיומיוציטים ותאי בטא בלבלב. עם זאת, זה היה מאתגר להגדיל את התפוקה, או משך התצפית, של גישות כאלה בשל מגבלות של המכשירים, תוכנת הניתוח, ביצועי האינדיקטורים ויעילות העברת הגנים. כאן, GECI ירוק בעל ביצועים גבוהים, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO), ו- GECI עם הסטה אדומה, K-GECO, משולבים עם בקרה אופטוגנטית כדי להשיג בקרה אופטית מלאה והדמיה של פעילות התאים בפורמט הדמיה בעל תפוקה גבוהה באמצעות מערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה. מוצגים יישומים המדגימים בדיקת קרדיוטוקסיות ובדיקת תרופות פנוטיפית עם iPSC-CMs בריאים שמקורם בחולה. בנוסף, הערכות רב-פרמטריות המשתמשות בשילובים של וריאנטים ספקטרליים ומדדי זיקה לסידן (NIR-GECO, LAR-GECO ו-mtGCEPIA או Orai1-G-GECO) מוגבלות לתאים תאיים שונים מודגמות גם במודל iPSC-CM.

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening at JoVE.com

High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בקרה ותצפית כל-אופטית של פעילות תאית מופעלת בקרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC (iPSC-CMs) לצורך בדיקת תרופות בתפוקה גבוהה ובדיקות רעילות. מוצג כימות רב-פרמטרי של תבניות פנוטיפיות בזמן ובמרחב. ההשפעות ארוכות הטווח של סמים לאורך שעות, או מדידות עוקבות לאורך ימים, מודגמות.

בקרה אופטית בתפוקה גבוהה ורישום אות סידן בקרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC לבדיקת רעילות ובדיקת תרופות פנוטיפית

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. ...

אנו מדגימים אינספור שיטות לכל בקרה אופטית ותצפית על פעילות תאית מופעלת בקרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה ובדיקת רעילות. לאפשר כימות רב-פרמטרי של הדפוסים הפנוטיפיים בזמן ובמרחב, לאפשר התבוננות בהשפעת התרופות לאורך שעות או ימים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על סוגים שונים של תאים, כגון, נוירונים, או תאי בטא, עבור סינון פונקציונלי ובדיקת רעילות.מי שידגים את ההליך יהיה וואן-צ'י סו, מהנדס ביו-הדמיה מהמעבדה שלי. הכינו את הצלחת מרובת הבארות לפני הסרת קרדיומיוציטים iPSC מאחסון קר להפשרה. מצפים כל באר של צלחת מיקרו 96 באר עם 100 מיקרוליטר של 0.02% תמיסת ג'לטין עם 50 מיקרוגרם למיליליטר של פיברונקטין כדי לכסות את כל המשטחים ביסודיות.העבר את הקרדיומיוציטים של iPSC ממיכל אחסון החנקן הנוזלי לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. קח את הבקבוקון לארון בטיחות ביולוגי מדרגה שתיים, והעבר בעדינות את התכולה לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר המכיל תשעה מיליליטר של מדיום טמפרטורת החדר. צנטריפוגה של התאים ב-200 פעמים G למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.יש להשליך את הסופר-נאטנט על ידי פיפטה, ולהשעות בעדינות את התאים במיליליטר אחד של מדיום עם מעכב 10 מיקרומולר ROCK Y27632. תאי צלחת ציפו 96 לוחות באר בצפיפות של 100, 000 עד 150, 000 תאים לסנטימטר מרובע, לפי הוראות היצרן. לאחר 24 שעות, ודא כי התאים המחוברים לפני השטח של הצלחת נמצאים במגע עם תאים אחרים.לאחר ציפוי התאים במשך 72 שעות להפשיר את ערכות הנגיף GECIs על קרח. הכינו פתרון מלאי של ערכה ויראלית בעוצמה כפולה עם מדיום התחזוקה. הכן את התאים לזיהום על ידי התאמת הנפח הבינוני ל -100 מיקרוליטר לבאר.הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסה נגיפית מעורבבת מראש לבארות, ודגרו במשך שמונה עד 16 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, להחליף עם 200 microliters מראש מחומם בינוני. דמיינו את ביטוי ה-GECIs 24 שעות לאחר ההתמרה באמצעות מערכת הדמיה.שמור על תאים באינקובטור הלח לפני ביצוע בדיקות פונקציונליות. הפעל את כל המכשירים של מערכת ההדמיה בעלת התוכן הגבוה. ודא שטמפרטורת התא מגיעה ל-37 מעלות צלזיוס עם תוספת של 5% פחמן דו-חמצני.פתח את תוכנת ההדמיה ובחר את הגדרת הצלחת עבור צלחת 96 באר. הכניסו לתא צלחת באר 96 ללא מכסה, וטענו את טבעת איטום התאים החיים מעליה. בחר את העדשה האובייקטיבית לטבילה במים של 20X, 60X ו- 20X, בהתאם לרזולוציה המרחבית הנדרשת.התאם את המיקוד כדי לצלם תמונות ברורות לפני הרכישה הניסיונית. בחר שלושה עד חמישה אזורים באופן אקראי לכל באר לרישום פעילות סידן. בחר מסננים מתאימים עבור מחוונים שונים.הגדר את עוצמת הדיודה פולטת האור המתאימה לכל ערוץ הדמיה שנעשה בו שימוש. הגדר את זמן החשיפה של המצלמה למקסימום של 40 אלפיות השנייה או 25 הרץ, ומשך הקלטה של 30 שניות לרכישת זרם כדי לצפות בטרנזיינטים של סידן, שדווחו על ידי בדיקות MNG-GECO ו- K-GECO המתבטאות בקרדיומיוציטים. הגדל את עוצמת ה-LED אם יחס האות לרעש הוא פחות משניים בקצבי פריימים גבוהים יותר.עבור גירוי אופטוגנטי, מטב את העוצמה והתדירות של אור כחול בהרץ אחד, והתחל ברכישה. להשעות מחדש את ה-E4031 Dofetilide, ואת ה-Verapamil ב-DMSO, ולדלל אותם עם החיץ של Tyrode. סדרו תרכובות לבאר היעד המתאימה.הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תרכובת הכוח הכפול באמצעות מערכת המיקרו-נוזלים האוטומטית לתוך הבארות, והתחילו ברכישה לאחר תקופת הדגירה הרצויה. בודד את אזור האות מהרקע על ידי זיהוי אוטומטי של תכונת הפולסים, ברזולוציית זמן, באמצעות התוכנה. השתמש בתוכנת ניתוח שיא הסידן כדי לנתח את תדירות הפעימה, אות השיא, משך ארעי הסידן 50% משך ארעי הסידן 90% זמן עלייה וזמן דעיכה.התצפית של תנודות סידן ספונטניות ב- NMG-GECO המתבטאת על ידי קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC עם או בלי טיפולים תרופתיים מודגמת בסרטון. עקבות קינטיים שהושגו באמצעות MNG-GECO הראו כי מעכבי תעלות יונים מולקולריות קטנות Verapamil, Dofetilide ו- E4031 השפיעו על טרנזיינטים של סידן כצפוי. כדי להעריך את תגובת המינון של E4031 בתנאים מתוקננים וקצביים channelrhodepsin-2, ו- K-GECO המבטאים CMs iPSC נשלטו אופטית באמצעות פולסים של הרץ אחד ו-470 ננומטר של אור, ונצפו באמצעות האות K-GECO האדום.הפחתה הדרגתית של משרעת שיא, ועלייה בזמן הדעיכה של ארעי הסידן, מתרחשות עם ריכוזים הולכים וגדלים של E4031. השפעה תלוית מינון של E4031 הייתה בולטת ביותר עבור הירידה באמפליטודת השיא. ארעי סידן צלולים נשארים גלויים לעין חודש לאחר ההתמרה הנגיפית, או ללא האור הנוסף המשמש לקצב אופטי.הגרף מתאר תרופה שנראית כמגבירה את קצב הפעימה, מסדירה את מרווח ההתכווצות ומגדילה את משרעת הסידן החולפת, במצב LVNC iPSC CM. השונות של תדירות הפעימה, וההשפעה שלאחר מכן על משך הזמן החולף של הסידן, משתנות גם הן כאשר iPSC CM נשמרים בתרבית. מספר GECIs, כולל, ER LAR-GECO, MTG-Sepia ו- NIR-GECO, פותחו לביטוי בנפרד, או בשילוב במודלים תאיים למדידת פעילות סידן בזמן אמת הנובעת ברשתית האנדופלסמית, הרשתית הסרקופלסמית, המיטוכונדריה וציטוסול, בהתאמה.ניתן לשלב את ה-GECIs במודל iPSC CM כדי לחקור מאגרי סידן תוך-תאיים שונים. K-GECO המבטא קרדיומיוציטים הראה התנהגות מכות עקבית לאורך זמן. עם זאת, העמסת Fluo-4 השפיעה על שניהם, על תדירות הפעימה, ועל CTD במודל זה, מה שמרמז על כך ש-Fluo-4, כשלעצמו, עשוי להשפיע על התוצאות של ניסויים כאלה.אנו מספקים דרך פשוטה לחקור פרופילים פנוטיפיים מתאי בקרה ותאים שמקורם בחולה, בעוד ש-iPSC ביניים עשוי לשפוך אור על גילוי תרופות במחלות שונות.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

Enucleation עיני העכבר לphenotyping מרחוק תפוקה גבוהה

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

הקרנה למכפילים מלנומה תוך שימוש במודל גידול כבני מקום דג זברה

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

מערכת תפוקה Organotypic גבוהה לאפיון של תרופות רגישות של תאי מיאלומה נפוצה ראשיים

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

חוט השדרה עכבר בילוד דגם פגיעה דחיסה

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Echocardiographic Approaches and Protocols for Comprehensive Phenotypic Characterization of Valvular Heart Disease in Mice

גישות פרוטוקולים אקו לאפיון פנוטיפי מקיף של מסתמית מחלות לב בעכברים

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

הערכה של רשת Sarcoplasmic סידן סידן הדיאסטולי שימור, תאיים הסרת Cardiomyocytes חדרית מבודד

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

שיטת אופטימיזציה LC-MS/MS לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות קליניות של Ivacaftor, שלה מטבוליטים העיקריים Lumacaftor של נוזלים ביולוגיים של חולי סיסטיק פיברוזיס

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

לומדים את האות ההיפותלמוס אינסולין סובלנות גלוקוז היקפי עם מערכת עירוי רציף סמים לתוך המוח העכבר

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...