Name: high-throughput optical controlling and recording calcium signal in ipsc-derived cardiomyocytes for toxicity testing and phenotypic drug screening
Uploaded: 2022-03-31T13:00:00
Duration: 10 min 1 s
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रॉबर्ट कैंपबेल को सामग्री और मूल्यवान चर्चा साझा करने के लिए टोक्यो विश्वविद्यालय में धन्यवाद देते हैं; तकनीकी सहायता के लिए आणविक उपकरण में डॉ चिया-लिन हो।

<ol>
	<li>O'Connor, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3R+principle:+Advancing+clinical+application+of+human+pluripotent+stem+cells.">The 3R principle: Advancing clinical application of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (2), 21 (2013).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. 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F., Arai, Y., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+activation+during+detector+&amp;#34;dead+time&amp;#34;+enables+compatible+real-time+fluorescence+imaging.">Optogenetic activation during detector &amp;#34;dead time&amp;#34; enables compatible real-time fluorescence imaging.</a> Neuroscience Research. 73 (4), 341-347 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiomyocyte+and+fibroblast+interaction+using+layer-by-layer+deposition+facilitates+synchronisation+of+cardiac+macro+tissues.">Modulating cardiomyocyte and fibroblast interaction using layer-by-layer deposition facilitates synchronisation of cardiac macro tissues.</a> Soft Matter. 16 (2), 428-434 (2020).</li><li>Leonard, R. G., Talbert, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-channel+blocking+agents.">Calcium-channel blocking agents.</a> Clinical Pharmacology. 1 (1), 17-33 (1982).</li><li>Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+components+of+cardiac+delayed+rectifier+K++current.+Differential+sensitivity+to+block+by+class+III+antiarrhythmic+agents.">Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents.</a> The Journal of General Physiology. 96 (1), 195-215 (1990).</li><li>Lees-Miller, J. P., Duan, Y., Teng, G. Q., Duff, H. 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L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+single-channel+optical+recording+reveals+multiple+Orai1+gating+states+and+oscillations+in+calcium+influx.">Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 440-445 (2016).</li><li>Broyles, C. N., Robinson, P., Daniels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent,+bioluminescent,+and+optogenetic+approaches+to+study+excitable+physiology+in+the+single+cardiomyocyte.">Fluorescent, bioluminescent, and optogenetic approaches to study excitable physiology in the single cardiomyocyte.</a> Cells. 7 (6), 51 (2018).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Haery, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+technologies+and+methods+for+targeted+neuronal+manipulation.">Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).</li><li>Nieuwenhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+adeno-associated+viral+vector-mediated+transduction+of+the+corticospinal+tract:+Comparison+of+four+promoters.">Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: Comparison of four promoters.</a> Gene Therapy. 28 (1), 56-74 (2021).</li><li>Smith, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+promoter+function+and+cell-type-specific+expression+from+viral+vectors+in+the+nervous+system.">Characterization of promoter function and cell-type-specific expression from viral vectors in the nervous system.</a> Journal of Virology. 74 (23), 11254-11261 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+an+immune+cell-specific+chimeric+promoter+in+regulating+anti-PD-1+antibody+expression+in.">Safety and efficacy of an immune cell-specific chimeric promoter in regulating anti-PD-1 antibody expression in.</a> CAR T cells. Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 19, 14-23 (2020).</li></ol>

लुमिस्टार ने के-जीईसीओ, एनआईआर-जीईसीओ और एलएआर-जीईसीओ के उपयोग के पेटेंट संरक्षण के लिए आवेदन किया है।

उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को सफलतापूर्वक करने के लिए, संकेतों को संस्कृति पोत में समान रूप से वितरित किया जाना चाहिए, यह गारंटी देते हुए कि इमेजिंग अधिग्रहण के दौरान यादृच्छिक रूप से चयनित क्षेत्रों (आरओआई) को स्वचालित रूप से लागू किया जा सकता है। यद्यपि रासायनिक कैल्शियम संकेतक आसानी से इस आवश्यकता को पूरा करते हैं, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड जांच ने ऐतिहासिक रूप से शीट के बजाय पैच का उत्पादन किया है, जो उनके उपयोग को सीमित करते हैं। एक वायरल ट्रांसडक्शन सिस्टम का उपयोग पारंपरिक अभिकर्मक विधियों की तुलना में लक्ष्य कोशिकाओं के बीच कई संकेतकों के उच्च 27,28 और समकक्ष अभिव्यक्ति स्तर प्रदान करता है। विभिन्न सेल प्रकारों को अलग-अलग प्रमोटरों की आवश्यकता हो सकती है, और जीन वितरण प्रणाली की पसंद कोतदनुसार 29,30,31 बदलने की आवश्यकता हो सकती है। विषम सेल मॉडल में, ट्रांसडक्शन और अभिव्यक्ति दक्षता विशिष्ट सेल प्रकारों में भिन्न हो सकती है। एक ओर, यह विशेष कोशिकाओं के आवेदन को सीमित कर सकता है, लेकिन सह-संस्कृति प्रणाली32 में विशेष कोशिकाओं को अलग करने के लिए घटना का शोषण किया जा सकता है।
इस दृष्टिकोण का मुख्य प्रभाव स्वचालन द्वारा प्रयोगकर्ता और नमूने के बीच एक-से-एक संबंध से मुक्ति है। एक मानक बहु-कुएं के प्रयोग में, एक ही कुएं के भीतर चार पदों पर डेटा एकत्र करने के लिए, हमारा अनुमान है कि 96 वेल प्लेट से 30 एस वीडियो इकट्ठा करने के लिए माइक्रोस्कोप में लगभग 15 घंटे लगते हैं। स्वचालित प्रणाली में, इसमें ~ 4 घंटे लगते हैं। इसके अलावा, मैन्युअल रूप से डेटा का विश्लेषण डेटा अधिग्रहण की तुलना में कहीं अधिक समय लेता है। यहां उपयोग की जाने वाली विश्लेषण प्रणाली मैनुअल समकक्ष की तुलना में लगभग 200 गुना तेज है। शुद्ध परिणाम एक बेहतर वर्कफ़्लो और उच्च लागत और समय की बचत है।
कैल्शियम रंगों से भरे प्राथमिक कार्डियोमायोसाइट्स के विपरीत जो घंटों के क्रम में जीवित रहते हैं, वायरल डिलीवरी सिस्टम के माध्यम से आईपीएससी-सीएम में व्यक्त जीईसीआई एक प्रयोगात्मक मॉडल में एक संकेत दे सकते हैं जो कुछ महीनों तक रहता है। इन मॉडलों को एक बहु-अच्छी तरह से प्रारूप में बनाए रखा जा सकता है और छोटे अणु स्क्रीनिंग के लिए विकसित उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम में सीरियल विश्लेषण के लिए एक साथ ट्रैक किया जा सकता है। यह आमतौर पर विष विज्ञान परख में उपयोग किए जाने वाले मिनटों के बजाय रोगियों (सप्ताह या महीनों) द्वारा अनुभव किए गए अवधि में दवा प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक सरल मानव प्रयोगात्मक मंच का उत्पादन करता है।
प्रणाली को हरे से लेकर इन्फ्रा-रेड तक अलग-अलग उत्सर्जन गुणों वाले जीईसीआई को शामिल करके बहु-पैरामीटर माप प्रदान करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है। इस तरह के प्रयोगों को संकेतों को अलग रखने के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन में उचित उत्तेजना प्रकाश और फिल्टर सेट की आवश्यकता होती है। दवा स्क्रीनिंग संदर्भ में व्यापक अनुप्रयोग के लिए दवा वितरण के अलावा मजबूत और कुशल विश्लेषण प्लेटफार्मों की आवश्यकता होती है। यद्यपि यहां वर्णित मॉडल कई गतिशील कैल्शियम संकेतकों के उपयोग पर केंद्रित है, इसे सेल फॉर्म या फ़ंक्शन के संरचनात्मक मार्करों में संशोधित किया जा सकता है। ये आम तौर पर कल्पना करना आसान होता है क्योंकि वे इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता में सौ गुना भिन्नता की तुलना में थोड़ा बीट-टू-बीट परिवर्तनशीलता दिखाते हैं। यह दृष्टिकोण दुर्लभ-बीमारी के लिए विशेष रूप से मूल्यवान हो सकता है जहां रोगियों से प्राप्त आईपीएससी मध्यवर्ती में एक विशेष स्थिति के सभी आनुवंशिक चालक और संशोधक शामिल हो सकते हैं जिन्हें एक स्केलेबल सेल मॉडल में संरक्षित किया जा सकता है, सेलुलर फेनोटाइप के आधार पर विभिन्न बीमारियों में दवा की खोज की सुविधा प्रदान की जा सकती है जिन्हें जैविक तंत्र के आधार पर स्वतंत्र रूप से देखा जा सकता है जिसे स्पष्ट करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है।

मानव-आधारित प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) -व्युत्पन्न मॉडल को पशु अध्ययन 1,2 के लिए निर्धारित 3आर उद्देश्यों (प्रतिस्थापन, कमी और शोधन) के लिए एक आशाजनक समाधान माना जाता है। आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग रोग मॉडलिंग और दवा की खोज के लिए किया गया है क्योंकि वे मानव जीव विज्ञानके आवश्यक पहलुओं को पुन: परिभाषित करते हैं। कैल्शियम इमेजिंग, आमतौर पर रासायनिक रंगों के साथ, दवा उपचार से पहले और बाद में सेलुलर गतिविधि का निरीक्षण करनेके लिए उपयोग किया गया है। हालांकि, रासायनिक डाई-आधारित कैल्शियम-सेंसिंग जांच सीधे एनए, के-एटीपीस को रोकती है और सेलुलर फ़ंक्शन6 को बाधित करती है। इस प्रकार, घंटों या दिनों में एक ही कोशिकाओं को ट्रैक करना समस्याग्रस्त रहा है जब रासायनिक रंगों का उपयोग किया जाता है। यहां, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) 7,8,9,10 की एक श्रृंखला का उपयोग एक व्यापक उत्तेजना / उत्सर्जन और कैल्शियम आत्मीयता स्पेक्ट्रम में किया जाता है ताकि कार्डियक विषाक्तता परीक्षण मंच बनाया जा सके जो11 की विस्तारित अवधि में वास्तविक समय बहु-ऑर्गेनेल माप प्रदान करता है।
लाल-स्थानांतरित कैल्शियम संकेतक की सह-अभिव्यक्ति द्वारा ऑप्टिकल नियंत्रण और कैल्शियम इमेजिंग के लिए आनुवंशिक रूप से एन्कोड किए गए उपकरणों का उपयोग करके आईपीएससी-सीएम मॉडल में उच्च-थ्रूपुट कैल्शियम-आधारित स्क्रीनिंग अवधारणा को पहले से प्रदर्शित शैक्षणिक संदर्भ से परे विकसित करने के लिए, आर-जीईसीओ या के-जीईसीओ के साथ एक ऑप्टोजेनेटिक टूल, सीएचआर2 12,13, ऑफ-द-शेल्फ वायरल किट उत्पन्न किए गए हैं। इमेजिंग को ऑटो-माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम से लैस एक उच्च-सामग्री उपकरण में संक्रमण करके, यौगिक जोड़ के एकल-चैनल पिपेटिंग को लाइव-सेल इमेजिंग के शीर्ष पर स्तरित किया जाता है। अंत में, प्रयोगात्मक मार्ग, छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण के दोनों महत्वपूर्ण पहलुओं में सुधार और स्वचालित हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>auto microfluidic system</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td>A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1096780100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dofetilide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PZ0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4031</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-LAR-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AA001a</td>
			<td>Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Chmical calcium sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-CMs Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CMS-002</td>
			<td>iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium)</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CMS-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AA005a</td>
			<td>Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LumiCAL software</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>LUCS01a</td>
			<td>Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL008a</td>
			<td>Brighter green GECI packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-GCEPIA3 viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL011a</td>
			<td>GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AV004a</td>
			<td>Near infrared GECI packed into viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orai1-GGECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL010a</td>
			<td>GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput optical controlling and recording calcium signal in ipsc-derived cardiomyocytes for toxicity testing and phenotypic drug screening

यह समझना कि स्वास्थ्य और बीमारी में उत्तेजित कोशिकाएं कैसे काम करती हैं और छोटे अणुओं या आनुवंशिक हेरफेर द्वारा उस व्यवहार को कैसे बदला जा सकता है, महत्वपूर्ण है। कई उत्सर्जन खिड़कियों के साथ आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतक (जीईसीआई) को जोड़ा जा सकता है (उदाहरण के लिए, अलग-अलग उपकोशिकीय घटनाओं के एक साथ अवलोकन के लिए) या उत्तेजित कोशिकाओं में अन्य प्रकाश-निर्भर एक्ट्यूएटर के साथ विस्तारित अनुप्रयोगों में उपयोग किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, वर्णक्रमीय रूप से संगत कैल्शियम संकेतकों के साथ आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण का संयोजन)। इस तरह के दृष्टिकोण का उपयोग प्राथमिक या स्टेम सेल-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स, कार्डियोमायोसाइट्स और अग्नाशयी बीटा-कोशिकाओं में किया गया है। हालांकि, उपकरणों, विश्लेषण सॉफ्टवेयर, संकेतक प्रदर्शन और जीन वितरण दक्षता की सीमाओं के कारण ऐसे दृष्टिकोणों के थ्रूपुट, या अवलोकन की अवधि को बढ़ाना चुनौतीपूर्ण रहा है। यहां, एक उच्च प्रदर्शन वाले हरे रंग के जीईसीआई, एमएनियोनग्रीन-जीईसीओ (एमएनजी-जीईसीओ), और लाल-स्थानांतरित जीईसीआई, के-जीईसीओ, को ऑप्टोजेनेटिक नियंत्रण के साथ जोड़ा जाता है ताकि उच्च-सामग्री इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग प्रारूप में सेलुलर गतिविधि के ऑल-ऑप्टिकल नियंत्रण और विज़ुअलाइज़ेशन को प्राप्त किया जा सके। स्वस्थ और रोगी-व्युत्पन्न आईपीएससी-सीएम के साथ कार्डियोटॉक्सिसिटी परीक्षण और फेनोटाइपिक दवा स्क्रीनिंग का प्रदर्शन करने वाले अनुप्रयोग दिखाए गए हैं। इसके अलावा, वर्णक्रमीय और कैल्शियम आत्मीयता संकेतक वेरिएंट (एनआईआर-जीईसीओ, एलएआर-जीईसीओ, और एमटीजीसीईपीआईए या ओराई 1-जी-जीईसीओ) के संयोजन का उपयोग करके बहु-पैरामीट्रिक आकलन भी आईपीएससी-सीएम मॉडल में विभिन्न सेलुलर डिब्बों तक ही सीमित हैं।

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High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening

वर्तमान प्रोटोकॉल उच्च थ्रूपुट ड्रग स्क्रीनिंग और विषाक्तता परीक्षण के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) में ट्रिगर सेलुलर गतिविधि के ऑल-ऑप्टिकल नियंत्रण और अवलोकन का वर्णन करता है। समय और स्थान में फेनोटाइपिक पैटर्न का बहु-पैरामीट्रिक परिमाणीकरण दिखाया गया है। घंटों में दवाओं के दीर्घकालिक प्रभाव, या दिनों में अनुक्रमिक माप, प्रदर्शित किए जाते हैं।

विषाक्तता परीक्षण और फेनोटाइपिक ड्रग स्क्रीनिंग के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में कैल्शियम सिग्नल को उच्च-थ्रूपुट ऑप्टिकल कंट्रोलिंग और रिकॉर्डिंग करना

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. ...

हम उच्च-थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग और विषाक्तता परीक्षण के लिए आईपीएससी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में ट्रिगर सेलुलर गतिविधि के सभी ऑप्टिकल नियंत्रण और अवलोकन के लिए अनगिनत विधि प्रदर्शित करते हैं। समय और स्थान में फेनोटाइपिक पैटर्न के बहु पैरामीट्रिक परिमाणीकरण को सक्षम करें, घंटों या दिनों में दवाओं के प्रभाव को देखने की अनुमति दें। इस विधि को कार्यात्मक स्क्रीनिंग और विषाक्तता परीक्षण के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, जैसे न्यूरोस, या बीटा कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है।प्रक्रिया का प्रदर्शन वान-ची सू होगा, जो मेरी प्रयोगशाला से एक बायो-इमेजिंग इंजीनियर है। पिघलने के लिए कोल्ड स्टोरेज से आईपीएससी कार्डियोमायोसाइट्स को हटाने से पहले मल्टी-वेल प्लेट तैयार करें। सभी सतहों को अच्छी तरह से कवर करने के लिए फाइब्रोनेक्टिन के 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ 0.02% जिलेटिन समाधान के 100 माइक्रोलीटर के साथ 96 अच्छी तरह से माइक्रो प्लेट के प्रत्येक कुएं को कोट करें।आईपीएससी कार्डियोमायोसाइट्स को तरल नाइट्रोजन भंडारण टैंक से 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में स्थानांतरित करें। शीशी को एक वर्ग दो जैव-सुरक्षा कैबिनेट में ले जाएं, और धीरे से सामग्री को एक नए 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें नौ मिलीलीटर कमरे का तापमान माध्यम हो। कमरे के तापमान पर तीन मिनट के लिए 200 गुना जी पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।पिपेट द्वारा सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, और धीरे से 10 माइक्रोमोलर रॉक अवरोधक वाई 27632 के साथ एक मिलीलीटर माध्यम में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। प्लेट कोशिकाओं ने निर्माता के निर्देशों के अनुसार, प्रति वर्ग सेंटीमीटर 100, 000 से 150, 000 कोशिकाओं के घनत्व पर 96 अच्छी प्लेटों को संलग्न किया। 24 घंटे के बाद, सुनिश्चित करें कि प्लेट की सतह से जुड़ी कोशिकाएं अन्य कोशिकाओं के संपर्क में हैं।72 घंटे तक कोशिकाओं को चढ़ाने के बाद जीईसीआई वायरल किट को बर्फ पर पिघलाएं। रखरखाव माध्यम के साथ एक डबल स्ट्रेंथ वायरल किट स्टॉक समाधान तैयार करें। मध्यम मात्रा को प्रति कुएं 100 माइक्रोलीटर तक समायोजित करके संक्रमण के लिए कोशिकाओं को तैयार करें।कुओं में प्रीमिक्स्ड वायरल घोल के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर आठ से 16 घंटे तक इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, 200 माइक्रोलीटर प्री-वार्मेड माध्यम से बदलें। इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके पारगमन के 24 घंटे बाद जीईसीआई अभिव्यक्ति की कल्पना करें।कार्यात्मक परख करने से पहले ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बनाए रखें। उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम के सभी उपकरणों पर स्विच करें। सत्यापित करें कि कक्ष का तापमान 5% कार्बन डाइऑक्साइड पूरकता के साथ 37 डिग्री सेल्सियस तक पहुंच जाता है।इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें, और 96 वेल प्लेट के लिए प्लेट सेटिंग चुनें। कक्ष में एक अन-ढक्कन वाली 96 वेल प्लेट रखें, और शीर्ष पर लाइव सेल सीलिंग रिंग लोड करें। आवश्यक स्थानिक रिज़ॉल्यूशन के अनुसार, 20X, 60X और 20X जल विसर्जन उद्देश्य लेंस चुनें।प्रयोगात्मक अधिग्रहण से पहले स्पष्ट छवियां लेने के लिए फ़ोकस समायोजित करें। कैल्शियम गतिविधि रिकॉर्डिंग के लिए यादृच्छिक रूप से प्रति कुएं तीन से पांच क्षेत्रों का चयन करें। विभिन्न संकेतकों के लिए उपयुक्त फ़िल्टर चुनें.उपयोग किए गए प्रत्येक इमेजिंग चैनल के लिए उपयुक्त प्रकाश उत्सर्जक डायोड शक्ति सेट करें। कार्डियोमायोसाइट्स में व्यक्त एमएनजी-जीईसीओ और के-जीईसीओ जांच द्वारा रिपोर्ट किए गए कैल्शियम ट्रांसिएंट्स का निरीक्षण करने के लिए स्ट्रीम अधिग्रहण के लिए कैमरा एक्सपोज़र समय को अधिकतम 40 मिलीसेकंड या 25 हर्ट्ज पर सेट करें, और स्ट्रीम अधिग्रहण के लिए 30 सेकंड की रिकॉर्डिंग अवधि निर्धारित करें। यदि सिग्नल टू शोर अनुपात उच्च फ्रेम दरों पर दो से कम है तो एलईडी पावर बढ़ाएं।ऑप्टोजेनेटिक उत्तेजना के लिए, एक हर्ट्ज पर नीली रोशनी की शक्ति और आवृत्ति का अनुकूलन करें, और अधिग्रहण शुरू करें। डीएमएसओ में ई 4031 डोफेटिलाइड और वेरापामिल को फिर से निलंबित करें, और उन्हें टायरोड के बफर के साथ पतला करें। यौगिकों को संबंधित लक्ष्य पर अच्छी तरह से व्यवस्थित करें।कुओं में ऑटो माइक्रो-फ्लूडिक सिस्टम के माध्यम से डबल स्ट्रेंथ यौगिक के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और वांछित इनक्यूबेशन अवधि के बाद अधिग्रहण शुरू करें। सॉफ्टवेयर के साथ समय के साथ पल्स फीचर का स्वचालित रूप से पता लगाकर पृष्ठभूमि से सिग्नल क्षेत्र को अलग करें। बीटिंग आवृत्ति, पीक सिग्नल, कैल्शियम क्षणिक अवधि 50% कैल्शियम क्षणिक अवधि 90% वृद्धि समय और क्षय समय का विश्लेषण करने के लिए कैल्शियम पीक विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।दवा उपचार के साथ या बिना आईपीएससी व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स द्वारा व्यक्त एनएमजी-जीईसीओ में सहज कैल्शियम दोलन का अवलोकन वीडियो में प्रदर्शित किया गया है। एमएनजी-जीईसीओ का उपयोग करके प्राप्त काइनेटिक निशान से पता चला है कि छोटे आणविक आयन चैनल इनहिबिटर वेरापामिल, डोफेटिलाइड और ई 4031 ने कैल्शियम क्षणिकों को अपेक्षित रूप से प्रभावित किया। मानकीकृत, विकसित परिस्थितियों के तहत ई 4031 की खुराक प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए चैनलरोडेप्सिन -2, और के-जीईसीओ ने आईपीएससी सीएम को व्यक्त किया, उन्हें प्रकाश के एक हर्ट्ज और 470 नैनोमीटर दालों का उपयोग करके ऑप्टिकल रूप से नियंत्रित किया गया, और लाल के-जीईसीओ सिग्नल का उपयोग करके देखा गया।पीक आयाम की प्रगतिशील कमी, और कैल्शियम ट्रांसिएंट्स के क्षय समय में वृद्धि, ई 4031 की बढ़ती सांद्रता के साथ होती है। पीक आयाम में कटौती के लिए ई 4031 का एक खुराक निर्भर प्रभाव सबसे स्पष्ट था। वायरल ट्रांसडक्शन के एक महीने बाद, या ऑप्टिकल पेसिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले अतिरिक्त प्रकाश के बिना स्पष्ट कैल्शियम क्षणिक दिखाई देते हैं।ग्राफ एक दवा को दर्शाता है जो एलवीएनसी आईपीएससी सीएम मोड में बीट दर को बढ़ाता है, संकुचन अंतराल को नियमित करता है, और क्षणिक कैल्शियम आयाम को बढ़ाता है। बीट आवृत्ति की परिवर्तनशीलता, और कैल्शियम क्षणिक अवधि पर बाद का प्रभाव, संस्कृति में आईपीएससी सीएम बनाए रखने के रूप में भी बदलता है। ईआर एलएआर-जीईसीओ, एमटीजी-सेपिया और एनआईआर-जीईसीओ सहित कई जीईसीआई को क्रमशः एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम, सारकोप्लाज्मिक रेटिकुलम, माइटोकॉन्ड्रिया और साइटोसोल में उत्पन्न होने वाले वास्तविक समय कैल्शियम गतिविधि माप के लिए सेल मॉडल में एकल रूप से अभिव्यक्ति के लिए विकसित किया गया है।विभिन्न इंट्रासेल्युलर कैल्शियम स्टोर का अध्ययन करने के लिए जीईसीआई को आईपीएससी सीएम मॉडल में जोड़ा जा सकता है। कार्डियोमायोसाइट्स व्यक्त करने वाले के-जीईसीओ ने समय के साथ लगातार धड़कन व्यवहार दिखाया। हालांकि, फ्लूओ -4 लोडिंग ने इस मॉडल में बीट आवृत्ति और सीटीडी दोनों को प्रभावित किया, यह सुझाव देते हुए कि फ्लूओ -4, स्वयं, ऐसे प्रयोगों के परिणामों को प्रभावित कर सकता है।हम नियंत्रण और रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं से फेनोटाइपिक प्रोफाइल का अध्ययन करने का एक सरल तरीका प्रदान करते हैं, जबकि आईपीएससी मध्यवर्ती विभिन्न बीमारियों में दवा की खोज पर प्रकाश डाल सकता है।

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

रिमोट phenotyping उच्च throughput के लिए माउस आँख का स्पष्टीकरण

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

मेलेनोमा संशोधक एक Zebrafish autochthonous ट्यूमर मॉडल का उपयोग करने के लिए स्क्रीनिंग

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

संवर्धित कोशिकाओं में कैंसर से जुड़े सिग्नल transduction पूछताछ के लिए एक multiplexed luciferase आधारित स्क्रीनिंग प्लेटफार्म

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

प्राथमिक मल्टीपल मायलोमा प्रकोष्ठों की दवा संवेदनशीलता की विशेषता के लिए एक Organotypic उच्च Throughput सिस्टम

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

एक नवजात माउस रीढ़ की हड्डी संपीड़न चोट मॉडल

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Echocardiographic Approaches and Protocols for Comprehensive Phenotypic Characterization of Valvular Heart Disease in Mice

एचोकर्दिओग्रफिक के प्रयास और चूहे में वाल्वुलर हृदय रोग की व्यापक प्ररूपी विशेषता के लिए प्रोटोकॉल

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Sarcoplasmic जालिका कैल्शियम रिजर्व और Intracellular डायस्टोलिक कैल्शियम हटाने में अलग वेंट्रिकुलर Cardiomyocytes का आकलन

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Ivacaftor, इसके प्रमुख चयापचयों, और सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों के जैविक तरल पदार्थ में Lumacaftor के नैदानिक नमूनों के उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए अनुकूलित LC-ms/

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

माउस मस्तिष्क में एक सतत दवा आधान प्रणाली के साथ परिधीय ग्लूकोज असहिष्णुता के लिए हाइपोथैलेमस इंसुलिन संकेत का अध्ययन

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...