Name: high-throughput optical controlling and recording calcium signal in ipsc-derived cardiomyocytes for toxicity testing and phenotypic drug screening
Uploaded: 2022-03-31T13:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening at JoVE.com

Мы благодарим профессора Роберта Кэмпбелла из Токийского университета за обмен материалами и ценную дискуссию; Доктор Чиа-Лин Хо в Molecular Device для технической поддержки.

Кардиомиоциты левого желудочка без уплотнения (LVNC) пациенту с iPSC-производными кардиомиоцитами (iPSC-CM) были предоставлены Национальной университетской больницей Тайваня. Сбор образцов пациентов для перепрограммирования в iPSC и протоколы обслуживания14 для исследовательских целей последовали Хельсинкской декларации WMA (этические принципы для медицинских исследований с участием людей) и были одобрены Институциональным наблюдательным советом: Бюро Комитета по этике исследований в NTUH (#201612099RINC). Другие iPSC-CM были получены от коммерческих поставщиков. Использование производных iPSC не требует специальных разрешений в нашем учреждении.
1. Препарат кардиомиоцитов на основе iPSC
<ol><li>Подготовьте многолуночную пластину перед тем, как iPSC-CM будет извлечен из холодного хранилища для размораживания. Покройте каждую лунку 96-луночной микропластины 100 мкл 50 мкг/мл фибронектина/0,2% раствора желатина (см. Таблицу материалов) для тщательного покрытия всех поверхностей.</li>
	<li>Инкубируют пластину при 37 °C в течение 1 ч в увлажненном инкубаторе.</li>
	<li>Нагревайте среду (см. Таблицу материалов) до комнатной температуры в течение 30 мин перед размораживанием клеток. ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий протокол описывает комнатную температуру как 25°C.</li>
	<li>Перенесите iPSC-CM из резервуара для хранения жидкого азота на водяную баню с температурой 37 °C. ПРИМЕЧАНИЕ: iPS-CM обычно поставляются на сухом льду академическими или коммерческими источниками. Они переносятся в хранилище жидкого азота при получении до использования.</li>
	<li>Удалите флакон до того, как лед полностью растает, и опрыскайте флакон 75% этанолом.</li>
	<li>Отнесите флакон в шкаф биобезопасности класса II и аккуратно перенесите содержимое в новую коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 9 мл среды комнатной температуры.</li>
	<li>Центрифугировать ячейки при 200 х г в течение 3 мин при комнатной температуре.</li>
	<li>Выбросьте супернатант пипеткой и осторожно повторно суспендируйте клетки в 1 мл среды с 10 мкМ ингибитора ROCK (Y27632) (см. Таблицу материалов). ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повторного пипетирования размороженных клеток, чтобы обеспечить максимальное восстановление клеток.</li>
	<li>Извлеките раствор покрытия из скважины и быстро добавьте 50 мкл среды с 10 мкМ ингибитора ROCK.</li>
	<li>Подтвердить количество жизнеспособных клеток можно с помощью метода исключения трипан-синего с помощью гемоцитометра15.</li>
	<li>Пластинчатые ячейки в 96-луночной пластине с покрытием при плотности 100 000-150 000 ячеек/см2 в соответствии с инструкциями производителя16.</li>
	<li>Через 24 ч убедитесь, что ячейки, прикрепленные к поверхности пластины, находятся в контакте с другими клетками. ПРИМЕЧАНИЕ: Одиночные клетки плохо выживают в долгосрочной культуре и обычно ведут себя более изменчиво.</li>
	<li>Заменяйте предварительно нагретую поддерживающую среду каждые 2 дня. ПРИМЕЧАНИЕ: Для длительного медикаментозного лечения LVNC iPSC-CM меняли половинными средними заменителями с низкомолекулярными препаратами или без них каждые 2 дня.</li>
</ol>2. Экспрессия генетически закодированных показателей кальция
<ol><li>После покрытия клеток в течение 72 ч разморозьте вирусные наборы GECI (см. Таблицу материалов) на льду.</li>
	<li>Подготовьте 2-кратный вирусный набор для приготовления раствора со средой для обслуживания.</li>
	<li>Подготовьте клетки к инфекции, регулируя объем среды до 100 мкл на лунку. Добавляют 100 мкл предварительно смешанного вирусного раствора и инкубируют в течение 8-16 ч при 37 °С.</li>
	<li>Замените 200 мкл предварительно нагретой средой после инкубации.</li>
	<li>Визуализируйте выражение GECI через 24 ч после трансдукции с помощью системы визуализации (см. Таблицу материалов). ПРИМЕЧАНИЕ: Уровень экспрессии достигает максимума через 48-72 ч после трансдукции. Ячейки могут быть визуализированы с 24-часовой точки времени. Тем не менее, сигналы, полученные от GECI, сохраняются более одного месяца.</li>
	<li>Поддерживайте клетки в увлажненном инкубаторе перед проведением функциональных анализов.</li>
	<li>Инфицировать iPSC-CMs (LVNC, полученные из пациента iPSC-CMs) вирусным набором ChR2-K-GECO (см. Таблицу материалов) на 25-й день после дифференциации с использованием протокола инфекции (этап 2.1-2.6).</li>
</ol>3. Визуализация кальция на основе красителей с использованием Fluo-4
<ol><li>Растворить порошок Флюо-4 (см. Таблицу материалов) в ДМСО в виде исходного раствора (5 мМ).</li>
	<li>Разбавить исходный раствор до концентрации 10 мкМ Fluo-4 в буфере Тирода. ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер Тирода состоит из 1,0 г/л бикарбоната натрия, 0,2 г/л хлорида кальция, 0,1 г/л хлорида магния, 0,2 г/л хлорида калия, 8,0 г/л хлорида натрия, 0,05 г/л моноосновного фосфата натрия и 1,0 г/л D-глюкозы.</li>
	<li>Заменить половину среды 10 мкМ раствора Fluo-4 (давая конечную концентрацию 5 мкМ).</li>
	<li>Инкубируют клетки при 37 °C в течение 30 мин.</li>
	<li>Промыть ячейки предварительно нагретым буфером Tyrode и заменить их средой перед получением изображения.</li>
	<li>Начните запись с помощью протокола сбора потока. ПРИМЕЧАНИЕ: Потоковое получение - это непрерывное получение изображений без интервального времени. Частота биения iPSC-CM составляет около 1 Гц, и этот протокол сбора потока используется для сбора паттернов биения.</li>
</ol>4. Получение изображений и функциональные анализы для испытания на токсичность и фенотипического скрининга
<ol><li>Включите все устройства системы визуализации с высоким содержанием (см. оглавление материалов).</li>
	<li>Убедитесь, что температура в камере достигает 37 °C, с добавлением 5% CO2 . Держите систему в равновесии в течение 2 ч до получения изображения. ПРИМЕЧАНИЕ: Тепловой дрейф является серьезной проблемой для долгосрочных наблюдений за живыми клетками, 1 ° C может изменить фокальную плоскость на ~ 1 мкм, поэтому необходимо позволить линзе и ступени достичь целевой температуры до получения изображения.</li>
	<li>Откройте программное обеспечение для визуализации (см. Таблица материалов) и выберите настройку пластины для пластины с 96 скважинами.</li>
	<li>Поместите нескользящую 96-луночную пластину в камеру и загрузите сверху уплотнительное кольцо с живыми ячейками. ПРИМЕЧАНИЕ: Уплотнительное кольцо с живыми ячейками является адаптером для достижения экологического равновесия.</li>
	<li>Выберите объектив 20x (рисунок 1 и рисунок 2), 60x (рисунок 3 и рисунок 4) и 20x (рисунок 5) с погружением в воду в соответствии с требуемым пространственным разрешением.</li>
	<li>Настройте фокус, чтобы сделать четкие изображения перед экспериментальным получением.</li>
	<li>Выберите 3-5 областей случайным образом на скважину для регистрации активности кальция. ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая область должна включать не менее 20 ячеек (n ≥ 20).</li>
	<li>Выберите подходящие фильтры для разных индикаторов. FITC 475/536 для mNG-GECO, mtGCEPIA3 и Oria1-G-GECO; Cy5 631/692 для NIR-GECO2; ER 530/593 для ER-LAR-GECO; Texas Red 560/624 для K-GECO.</li>
	<li>Установите соответствующую мощность светодиода (LED) для каждого используемого канала изображения. ПРИМЕЧАНИЕ: При оптимизации мощности светодиодов для получения изображения по соотношению сигнал (определяемая интенсивность объекта) к шуму (обнаруженная интенсивность фона) отношение сигнал/шум должно быть выше 2. В этом протоколе 10% мощности светодиодов для TRITC и FITC; 20% для Cy5 было типичным.</li>
	<li>Установите время экспозиции камеры максимум на 40 мс (25 Гц) и продолжительность записи 30 sfor stream для наблюдения переходных процессов кальция, сообщаемых зондами mNG-GECO и K-GECO, экспрессируемыми в кардиомиоцитах (рисунок 1-3 и рисунок 5). Увеличьте мощность светодиода, если сигнал/шум <2 при более высокой частоте кадров.</li>
	<li>Для оптогенетической стимуляции (рисунок 2 и рисунок 3C,D) оптимизируйте мощность (обычно 5%-10%) и частоту синего света при 1 Гц. ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, человеческий iPSC-CM бьет спонтанно около ~ 1 Гц, и оператор должен двигаться быстрее, чем спонтанная скорость.</li>
	<li>Если запланированы последовательные (рисунок 3) или расширенные (рисунок 4) измерения, избегайте фототоксичности любой ценой. Это может означать снижение интенсивности освещения и компенсацию этого за счет увеличения времени экспозиции камеры, например, до 100 мс с помощью протокола time-lapse, используемого для трехканального наблюдения в реальном времени субклеточных сигналов Ca2+ (рисунок 4).</li>
	<li>Используйте протокол асинхронного дозирования для добавления кофеина 10 мМ через систему автоматической микрофлюидики (см. Таблицу материалов) (рисунок 4). ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол асинхронного дозирования позволяет получать изображения при добавлении таких препаратов, как кофеин, без разрывов между изображениями.</li>
	<li>Начните приобретение.</li>
</ol>5. Получение малых молекул
<ol><li>Повторно суспендируйте E4031, дофетилид и верапамил в DMSO и разбавьте их буфером Tyrode. Конечная концентрация ДМСО в среде составила 0,1% (v/v).</li>
	<li>Готовят растворы соединений при удвоенной (т.е. 2х) требуемой рабочей концентрации и уравновешивают при 37 °С перед добавлением. ПРИМЕЧАНИЕ: Минимизация колебаний температуры после добавления среды имеет жизненно важное значение, поскольку сократимость зависит от температуры, а эффект изменения температуры является быстрым.</li>
	<li>Хорошо расположите соединения к соответствующей мишени.</li>
	<li>Добавьте 100 мкл соединений двойной прочности (2x) через систему автомикрофлюидики (см. Таблицу материалов) в скважины и начните сбор после желаемого (обычно 15 мин) инкубационного периода.</li>
</ol>6. Обработка и анализ изображений
<ol><li>Изолируйте область сигнала от фона, автоматически обнаружив особенность импульса с течением времени с помощью программного обеспечения.</li>
	<li>Используйте программное обеспечение для анализа пиков кальция (см. Таблицу материалов) для анализа частоты биения (BPM), пикового сигнала (амплитуда), длительности переходного процесса кальция 50% (CTD50), длительности переходного процесса кальция 90% (CTD90), времени нарастания и времени распада (рисунок 1C). ПРИМЕЧАНИЕ: В этих настройках фотоотбеливание было очевидным в течение первых 10 с, и после этого сигналы стабилизируются. Таким образом, пик кальция анализировали с 11-30 с. В трехканальных записях (рисунок 4) контур ячейки окаймляется вручную для измерения изменения интенсивности.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Connor, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3R+principle:+Advancing+clinical+application+of+human+pluripotent+stem+cells.">The 3R principle: Advancing clinical application of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (2), 21 (2013).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Ovics, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development+and+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+disease+modeling+and+drug+toxicity+screening.">Drug development and the use of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for disease modeling and drug toxicity screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7320 (2020).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).</li><li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Ca(2+)+indicators+directly+inhibit+the+Na,K-ATPase+and+disrupt+cellular+functions.">Fluorescent Ca(2+) indicators directly inhibit the Na,K-ATPase and disrupt cellular functions.</a> Science Signaling. 11 (515), (2018).</li><li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+Ca2++indicator+based+on+circularly+permutated+sea+anemone+red+fluorescent+protein+eqFP578.">A genetically encoded Ca2+ indicator based on circularly permutated sea anemone red fluorescent protein eqFP578.</a> BMC Biology. 16 (1), 9 (2018).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+near-infrared+fluorescent+calcium+ion+indicator.">A genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicator.</a> Nature Methods. 16 (2), 171-174 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+Ca2++indicators+for+use+in+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum.">Red fluorescent genetically encoded Ca2+ indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum.</a> Biochemical Journal. 464 (1), 13-22 (2014).</li><li>Zarowny, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+high-performance+genetically+encoded+Ca2++indicator+based+on+mneongreen+fluorescent+protein.">and high-performance genetically encoded Ca2+ indicator based on mneongreen fluorescent protein.</a> ACS Sensors. 5 (7), 1959-1968 (2020).</li><li>Potekhina, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+with+genetically+encoded+fluorescent+sensors:+today+and+tomorrow.">Drug screening with genetically encoded fluorescent sensors: today and tomorrow.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 148 (2021).</li><li>Chang, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+phenotyping+and+drug+testing+in+single+cardiomyocytes+or+beta-cells+by+calcium+imaging+and+optogenetics.">Non-invasive phenotyping and drug testing in single cardiomyocytes or beta-cells by calcium imaging and optogenetics.</a> PLoS One. 12 (4), 0174181 (2017).</li><li>Chang, Y. -. F., Arai, Y., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+activation+during+detector+&amp;#34;dead+time&amp;#34;+enables+compatible+real-time+fluorescence+imaging.">Optogenetic activation during detector &amp;#34;dead time&amp;#34; enables compatible real-time fluorescence imaging.</a> Neuroscience Research. 73 (4), 341-347 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiomyocyte+and+fibroblast+interaction+using+layer-by-layer+deposition+facilitates+synchronisation+of+cardiac+macro+tissues.">Modulating cardiomyocyte and fibroblast interaction using layer-by-layer deposition facilitates synchronisation of cardiac macro tissues.</a> Soft Matter. 16 (2), 428-434 (2020).</li><li>Leonard, R. G., Talbert, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-channel+blocking+agents.">Calcium-channel blocking agents.</a> Clinical Pharmacology. 1 (1), 17-33 (1982).</li><li>Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+components+of+cardiac+delayed+rectifier+K++current.+Differential+sensitivity+to+block+by+class+III+antiarrhythmic+agents.">Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents.</a> The Journal of General Physiology. 96 (1), 195-215 (1990).</li><li>Lees-Miller, J. P., Duan, Y., Teng, G. Q., Duff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinant+of+high-affinity+dofetilide+binding+to+HERG1+expressed+in+Xenopus+oocytes:+Involvement+of+S6+sites.">Molecular determinant of high-affinity dofetilide binding to HERG1 expressed in Xenopus oocytes: Involvement of S6 sites.</a> Molecular Pharmacology. 57 (2), 367-374 (2000).</li><li>Kamiya, K., Niwa, R., Mitcheson, J. S., Sanguinetti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+HERG+channel+block.">Molecular determinants of HERG channel block.</a> Molecular Pharmacology. 69 (5), 1709-1716 (2006).</li><li>Fukushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+induction+and+long-term+maintenance+of+high+purity+ventricular+cardiomyocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Specific induction and long-term maintenance of high purity ventricular cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 15 (11), 0241287 (2020).</li><li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging.">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophysical Journal. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li><li>Suzuki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intraorganellar+Ca2++at+subcellular+resolution+using+CEPIA.">Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA.</a> Nature Communications. 5, 4153 (2014).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetically+encoded+near-infrared+fluorescent+calcium+ion+indicators+for+in+vivo+imaging.">Improved genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicators for in vivo imaging.</a> PLoS Biology. 18 (11), 3000965 (2020).</li><li>Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+single-channel+optical+recording+reveals+multiple+Orai1+gating+states+and+oscillations+in+calcium+influx.">Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 440-445 (2016).</li><li>Broyles, C. N., Robinson, P., Daniels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent,+bioluminescent,+and+optogenetic+approaches+to+study+excitable+physiology+in+the+single+cardiomyocyte.">Fluorescent, bioluminescent, and optogenetic approaches to study excitable physiology in the single cardiomyocyte.</a> Cells. 7 (6), 51 (2018).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Haery, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+technologies+and+methods+for+targeted+neuronal+manipulation.">Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).</li><li>Nieuwenhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+adeno-associated+viral+vector-mediated+transduction+of+the+corticospinal+tract:+Comparison+of+four+promoters.">Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: Comparison of four promoters.</a> Gene Therapy. 28 (1), 56-74 (2021).</li><li>Smith, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+promoter+function+and+cell-type-specific+expression+from+viral+vectors+in+the+nervous+system.">Characterization of promoter function and cell-type-specific expression from viral vectors in the nervous system.</a> Journal of Virology. 74 (23), 11254-11261 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+an+immune+cell-specific+chimeric+promoter+in+regulating+anti-PD-1+antibody+expression+in.">Safety and efficacy of an immune cell-specific chimeric promoter in regulating anti-PD-1 antibody expression in.</a> CAR T cells. Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 19, 14-23 (2020).</li></ol>

LumiSTAR подала заявку на патентную защиту использования K-GECO, NIR-GECO и LAR-GECO.

Для успешного выполнения высокопроизводительного скрининга сигналы должны быть равномерно распределены по сосуду культуры, гарантируя, что случайно выбранные области интереса (ROI) могут быть применены автоматически во время получения изображений. Хотя химические показатели кальция легко удовлетворяют этому требованию, генетически закодированные зонды исторически производили пятна, а не листы сигнала, ограничивающие их использование. Использование системы вирусной трансдукции обеспечивает высокие27,28 и эквивалентные уровни экспрессии множественных индикаторов среди клеток-мишеней по сравнению с обычными методами трансфекции. Различные типы клеток могут требовать разных промоторов, и выбор системы доставки генов может потребоваться соответственноизменить 29,30,31. В гетерогенных клеточных моделях эффективность трансдукции и экспрессии могут быть различными в определенных типах клеток. С одной стороны, это может ограничить применение к конкретным клеткам, но это явление может быть использовано для различения конкретных клеток в системе32 совместной культивирования.
Основное влияние этого подхода заключается в освобождении от отношений один к одному между экспериментатором и образцом с помощью автоматизации. В стандартном эксперименте с несколькими скважинами для сбора данных в четырех позициях в пределах одной скважины мы оцениваем, что для сбора видео 30 с из 96 лунок требуется около 15 часов под микроскопом. В автоматизированной системе это занимает ~4 ч. Кроме того, анализ данных вручную занимает гораздо больше времени, чем сбор данных. Используемая здесь система анализа примерно в 200 раз быстрее ручного эквивалента. Конечным результатом является улучшенный рабочий процесс и высокая экономия средств и времени.
В отличие от первичных кардиомиоцитов, загруженных красителями кальция, которые выживают в порядке часов, GECI, выраженные в iPSC-CM через вирусные системы доставки, могут давать сигнал в экспериментальной модели, которая живет в течение нескольких месяцев. Эти модели могут поддерживаться в формате с несколькими скважинами и отслеживаться одновременно для последовательного анализа в системах визуализации с высоким содержанием, разработанных для скрининга малых молекул. Это создает простую экспериментальную платформу для человека для проверки эффектов лекарств в течение длительностей, близких к тем, которые испытывают пациенты (недели или месяцы), а не минуты, обычно используемые в токсикологических анализах.
Система может быть расширена для обеспечения многопараметрических измерений путем включения GECI с различными свойствами выбросов от зеленого до почти инфракрасного. Такие эксперименты требуют надлежащего света возбуждения и наборов фильтров в экспериментальной конструкции для разделения сигналов. Широкое применение в контексте скрининга лекарств требует надежных и эффективных аналитических платформ в дополнение к дозированию лекарств. Хотя модель, описанная здесь, фокусируется на использовании нескольких динамических показателей кальция, она может быть изменена на структурные маркеры клеточной формы или функции. Их, как правило, легче визуализировать, поскольку они показывают небольшую изменчивость по сравнению со стократным изменением внутриклеточной концентрации кальция. Этот подход может быть особенно ценным для редких заболеваний, когда промежуточный iPSC, полученный от пациентов, может содержать все генетические драйверы и модификаторы конкретного состояния, которые могут быть сохранены в масштабируемой клеточной модели, способствуя открытию лекарств при различных заболеваниях на основе клеточных фенотипов, которые могут быть визуализированы независимо от лежащего в основе биологического механизма, который может быть трудно выяснить.

Модели, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), на основе человека, считаются многообещающим решением целей 3R (замена, сокращение и уточнение), изложенных для исследований на животных 1,2. Кардиомиоциты, полученные из iPSC, использовались для моделирования заболеваний и открытия лекарств, поскольку они резюмируют основные аспекты биологии человека3. Кальциевая визуализация, как правило, с химическими красителями, использовалась для наблюдения клеточной активности до и послемедикаментозного лечения 4,5. Однако химические датчики кальция на основе красителей непосредственно ингибируют Na, K-АТФазу и нарушают клеточную функцию6. Таким образом, отслеживание одних и тех же клеток в течение нескольких часов или дней было проблематичным при использовании химических красителей. Здесь ряд генетически закодированных показателей кальция (GECI)7,8,9,10 используется в широком спектре возбуждения/излучения и сродства кальция для формирования платформы для тестирования сердечной токсичности, предлагающей измерения мультиорганелл в режиме реального времени в течение длительных периодов времени11.
Для дальнейшего развития концепции высокопроизводительного скрининга на основе кальция в модели iPSC-CM за пределами ранее продемонстрированного академического контекста с использованием генетически закодированных инструментов для оптического контроля и визуализации кальция путем совместной экспрессии индикатора кальция с красным смещением, R-GECO или K-GECO с оптогенетическим инструментом, ChR2 12,13, были созданы готовые вирусные наборы. При преобразовании визуализации в инструмент с высоким содержанием, оснащенный автомикрофлюидной системой, одноканальное пипетирование добавления соединений наслаивается поверх визуализации живых клеток. Наконец, оба важнейших аспекта экспериментального пути, обработка изображений и анализ улучшаются и автоматизируются.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>auto microfluidic system</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td>A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1096780100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dofetilide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PZ0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4031</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-LAR-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AA001a</td>
			<td>Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Chmical calcium sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-CMs Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CMS-002</td>
			<td>iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium)</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CMS-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AA005a</td>
			<td>Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LumiCAL software</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>LUCS01a</td>
			<td>Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL008a</td>
			<td>Brighter green GECI packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-GCEPIA3 viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL011a</td>
			<td>GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AV004a</td>
			<td>Near infrared GECI packed into viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orai1-GGECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL010a</td>
			<td>GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput optical controlling and recording calcium signal in ipsc-derived cardiomyocytes for toxicity testing and phenotypic drug screening

Важно понять, как возбудимые клетки работают в здоровье и болезни и как это поведение может быть изменено небольшими молекулами или генетическими манипуляциями. Генетически закодированные индикаторы кальция (GECI) с несколькими эмиссионными окнами могут быть объединены (например, для одновременного наблюдения различных субклеточных событий) или использованы в расширенных приложениях с другими светозависимыми исполнительными механизмами в возбудимых клетках (например, комбинируя генетически закодированный оптогенетический контроль со спектрально совместимыми показателями кальция). Такие подходы были использованы в первичных или стволовых нейронах, кардиомиоцитах и бета-клетках поджелудочной железы. Тем не менее, было сложно увеличить пропускную способность или продолжительность наблюдения таких подходов из-за ограничений инструментов, аналитического программного обеспечения, производительности индикаторов и эффективности доставки генов. Здесь высокопроизводительный зеленый GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) и GECI с красным смещением, K-GECO, сочетаются с оптогенетическим контролем для достижения полностью оптического контроля и визуализации клеточной активности в высокопроизводительном формате визуализации с использованием системы визуализации с высоким содержанием. Показаны приложения, демонстрирующие тестирование кардиотоксичности и фенотипический скрининг лекарств со здоровыми и полученными от пациента iPSC-CMs. Кроме того, в модели iPSC-CM также демонстрируются многопараметрические оценки с использованием комбинаций спектральных и кальциевых вариантов показателей сродства к кальцию (NIR-GECO, LAR-GECO и mtGCEPIA или Orai1-G-GECO), ограниченные различными клеточными компартментами.

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening at JoVE.com

High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening

Настоящий протокол описывает полностью оптический контроль и наблюдение за триггерной клеточной активностью в кардиомиоцитах, полученных из iPSC (iPSC-CM), для высокопроизводительного скрининга лекарств и тестирования токсичности. Показана многопараметрическая количественная оценка фенотипических закономерностей во времени и пространстве. Демонстрируются долгосрочные эффекты лекарств в течение нескольких часов или последовательные измерения в течение нескольких дней.

Высокопроизводительный оптический контроль и запись сигнала кальция в кардиомиоцитах, полученных из iPSC, для тестирования токсичности и фенотипического скрининга лекарств

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. ...

Мы демонстрируем бесчисленные методы для оптического контроля и наблюдения за вызванной клеточной активностью в кардиомиоцитах, полученных из iPSC, для высокопроизводительного скрининга лекарств и теста на токсичность. Обеспечивают многопараметрическую количественную оценку фенотипических паттернов во времени и пространстве, позволяют наблюдать за действием лекарств в течение нескольких часов или дней. Этот метод может быть применен к различным типам клеток, таким как неврозы или бета-клетки, для функционального скрининга и теста на токсичность.Продемонстрировать процедуру будет Ван-Чи Су, инженер по биовизуализации из моей лаборатории. Подготовьте многолуночную пластину перед тем, как кардиомиоциты iPSC будут удалены из холодного хранилища для размораживания. Покройте каждую лунку 96-луночной микроплиты 100 микролитрами 0,02% раствора желатина с 50 микрограммами на миллилитр фибронектина, чтобы тщательно покрыть все поверхности.Перенесите кардиомиоциты iPSC из резервуара для хранения жидкого азота на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия. Отнесите флакон в шкаф биобезопасности второго класса и аккуратно перенесите содержимое в новую коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую девять миллилитров среды комнатной температуры. Центрифугируйте ячейки в 200 раз G в течение трех минут при комнатной температуре.Отбросьте супернатант пипеткой и осторожно повторно приостановите клетки в одном миллилитре среды с 10 микромолярным ингибитором ROCK Y27632. Пластинчатые ячейки покрывали 96 пластин скважин плотностью от 100 000 до 150 000 ячеек на квадратный сантиметр в соответствии с инструкциями производителя. Через 24 часа убедитесь, что клетки, прикрепленные к поверхности пластины, находятся в контакте с другими клетками.После покрытия клеток в течение 72 часов разморозьте вирусные наборы GECI на льду. Приготовьте вирусный набор двойной силы с помощью поддерживающей среды. Подготовьте клетки к инфекции, регулируя объем среды до 100 микролитров на лунку.Добавьте 100 микролитров предварительно смешанного вирусного раствора в лунки и инкубируйте в течение восьми-16 часов при 37 градусах Цельсия. После инкубации замените 200 микролитрами предварительно нагретую среду. Визуализируйте выражение GECI через 24 часа после трансдукции с помощью системы визуализации.Поддерживайте клетки в увлажненном инкубаторе перед проведением функциональных анализов. Включите все устройства системы обработки изображений с высоким содержанием. Убедитесь, что температура камеры достигает 37 градусов по Цельсию с добавлением углекислого газа 5%.Откройте программное обеспечение для визуализации и выберите настройку пластины для пластины на 96 скважин. Поместите в камеру пластину 96 скважин без крышки и загрузите сверху уплотнительное кольцо живой ячейки. Выберите объектив с погружением в воду 20X, 60X и 20X в соответствии с требуемым пространственным разрешением.Настройте фокус, чтобы сделать четкие изображения перед экспериментальным получением. Выберите от трех до пяти областей случайным образом на скважину для регистрации активности кальция. Выберите подходящие фильтры для разных индикаторов.Установите соответствующую мощность светодиода для каждого используемого канала изображения. Установите время экспозиции камеры максимум на 40 миллисекунд или 25 герц, а продолжительность записи 30 секунд для захвата потока для наблюдения переходных процессов кальция, о которых сообщают зонды MNG-GECO и K-GECO, экспрессируемые в кардиомиоцитах. Увеличьте мощность светодиода, если отношение сигнал/шум меньше двух при более высокой частоте кадров.Для оптогенетической стимуляции оптимизируйте мощность и частоту синего света на уровне одного герца и начните сбор. Повторно суспендировать дофетилид E4031 и верапамил в ДМСО и разбавить их буфером Тирода. Хорошо расположите соединения к соответствующей мишени.Добавьте 100 микролитров соединения двойной прочности через автоматическую микрожидкую систему в скважины и начните сбор после желаемого инкубационного периода. Изолируйте область сигнала от фона, автоматически обнаруживая функцию импульсов с временным разрешением с помощью программного обеспечения. Используйте программное обеспечение для анализа пиков кальция для анализа частоты биения, пикового сигнала, длительности переходных процессов кальция 50% переходной продолжительности кальция 90% времени нарастания и времени распада.На видео демонстрируется наблюдение спонтанного колебания кальция в NMG-GECO, экспрессируемого кардиомиоцитами, полученными из iPSC, с медикаментозным лечением или без него. Кинетические следы, полученные с помощью MNG-GECO, показали, что ингибиторы малых молекулярных ионных каналов Верапамил, Дофетилид и Е4031 влияли на переходные процессы кальция, как и ожидалось. Для оценки дозовой реакции E4031 в стандартизированных, темповых условиях каналодерходепсин-2 и K-GECO экспрессирующие iPSC CM оптически контролировали с использованием одного герца и 470 нанометровых импульсов света и наблюдали с использованием красного сигнала K-GECO.Прогрессирующее уменьшение пиковой амплитуды и увеличение времени распада переходных процессов кальция происходят при увеличении концентрации Е4031. Дозозависимый эффект Е4031 был наиболее очевиден для снижения пиковой амплитуды. Прозрачные переходные процессы кальция остаются видимыми через месяц после вирусной трансдукции или без дополнительного света, используемого для оптического кардиостимуляции.На графике изображен препарат, который, по-видимому, увеличивает скорость биения, упорядочивает интервал сокращения и увеличивает переходную амплитуду кальция в режиме LVNC iPSC CM. Изменчивость частоты биения и последующее влияние на временную продолжительность кальция также изменяются по мере поддержания iPSC CM в культуре. Несколько GECI, в том числе ER LAR-GECO, MTG-Sepia и NIR-GECO, были разработаны для экспрессии по отдельности или в комбинации в клеточных моделях для измерения активности кальция в реальном времени, возникающей в эндоплазматическом ретикулуме, саркоплазматическом ретикулуме, митохондриях и цитозоле, соответственно.GECI могут быть объединены в модель iPSC CM для изучения различных внутриклеточных запасов кальция. K-GECO, экспрессирующие кардиомиоциты, показали последовательное поведение биения с течением времени. Однако нагрузка Fluo-4 повлияла как на частоту ударов, так и на CTD в этой модели, предполагая, что Fluo-4 сам по себе может влиять на результаты таких экспериментов.Мы предоставляем простой способ изучения фенотипических профилей из контрольных и производных от пациента клеток, в то время как промежуточный iPSC может пролить свет на открытие лекарств при различных заболеваниях.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

Мышь глаз Энуклеация для удаленного высокой пропускной Фенотипирование

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Скрининг на Меланома Модификаторы помощью рыбок данио автохтонные модели опухоли

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

Мультиплексированную Люциферазы скрининга на основе Платформы Допрос связанных с раком передачи сигнала в культуре клеток

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

Органотипической Высокая пропускная система для характеризации наркотиками чувствительности первичных клетки множественной миеломы

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

Неонатальной спинного мозга мыши Сжатие Травма Модель

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Echocardiographic Approaches and Protocols for Comprehensive Phenotypic Characterization of Valvular Heart Disease in Mice

Эхокардиографические подходы и протоколы для Всеобъемлющего Фенотипическая характеристика клапанной болезни сердца у мышей

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Оценка саркоплазматический ретикулум кальция резерва и внутриклеточного кальция диастолического удаления в изолированных кардиомиоцитов желудочков

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Оптимизированный метод LC-MS/MS для высокой пропускной способности анализа клинических образцов Ivacaftor, его основных метаболитов и Lumacaftor в биологических жидкостях больных муковисцидозом

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Изучая гипоталамуса инсулин сигнал периферийных глюкозе с системой непрерывной наркотиками вливания в мозг мыши

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...