Name: high-throughput optical controlling and recording calcium signal in ipsc-derived cardiomyocytes for toxicity testing and phenotypic drug screening
Uploaded: 2022-03-31T13:00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening at JoVE.com

Vi tackar professor Robert Campbell vid University of Tokyo för att ha delat materialet och den värdefulla diskussionen; Dr. Chia-Lin Ho i Molecular Device för teknisk support.

Vänster ventrikulär icke-kompakteringskardiomyopati (LVNC) patient iPSC-härledda kardiomyocyter (iPSC-CM) tillhandahölls av National Taiwan University Hospital. Insamlingen av patientprover för omprogrammering till iPSC och underhållsprotokollen14 för forskningsändamål följde WMA:s Helsingforsdeklaration (etiska principer för medicinsk forskning på människor) och godkändes av Institutional Review Board: Research Ethics Committee Office vid NTUH (#201612099RINC). Andra iPSC-CM erhölls från kommersiella leverantörer. Användningen av iPSC-derivat kräver inga specifika behörigheter i vår institution.
1. iPSC-härledd kardiomyocytberedning
<ol><li>Förbered flerbrunnsplattan innan iPSC-CM tas bort från kylförvaring för upptining. Täck varje brunn på mikroplattan med 96 brunnar med 100 μl 50 μg/ml fibronektin/0,2 % gelatinlösning (se materialtabell) för att täcka alla ytor noggrant.</li>
	<li>Inkubera plattan vid 37 °C i 1 timme i en fuktad inkubator.</li>
	<li>Värm mediet (se Materialförteckning) till rumstemperatur i 30 minuter före cellupptining. OBS: Detta protokoll beskriver rumstemperatur som 25 °C.</li>
	<li>Överför iPSC-CM från lagringstanken för flytande kväve till ett 37 °C vattenbad. OBS: iPS-CM levereras vanligtvis på torris av akademiska eller kommersiella källor. De överförs till flytande kvävelagring vid mottagandet tills de används.</li>
	<li>Ta bort injektionsflaskan innan isen smälter helt och spraya injektionsflaskan med 75% etanol.</li>
	<li>Ta injektionsflaskan till ett klass II-biosäkerhetsskåp och överför försiktigt innehållet till ett nytt 15 ml koniskt rör som innehåller 9 ml rumstemperaturmedium.</li>
	<li>Centrifugera cellerna vid 200 x g i 3 minuter vid rumstemperatur.</li>
	<li>Kassera supernatanten med pipett och återsuspendera försiktigt cellerna i 1 ml medium med 10 μM ROCK-hämmare (Y27632) (se materialförteckning). OBS: Undvik upprepad pipettering av tinade celler för att säkerställa maximal cellåtervinning.</li>
	<li>Ta bort beläggningslösningen från brunnen och tillsätt snabbt 50 μL medium med 10 μM ROCK-hämmare.</li>
	<li>Bekräfta antalet livskraftiga celler med trypanblå uteslutningsmetod med en hemocytometer15.</li>
	<li>Plåtceller i belagd 96-brunnsplatta med en densitet av 100 000-150 000 cell / cm2, enligt tillverkarens instruktioner16.</li>
	<li>Efter 24 timmar, se till att cellerna som är fästa vid plattans yta är i kontakt med andra celler. OBS: Enstaka celler överlever dåligt i långsiktig odling och beter sig vanligtvis mer varierande.</li>
	<li>Byt ut förvärmt underhållsmedium var 2: e dag. OBS: För långvarig läkemedelsbehandling ändrades LVNC iPSC-CM med halva medelstora ersättningar med eller utan småmolekylära läkemedel var 2: e dag.</li>
</ol>2. Uttryck för genetiskt kodade kalciumindikatorer
<ol><li>Efter plätering av cellerna i 72 timmar, tina GECIs virala kit (se materialtabell) på is.</li>
	<li>Förbered en 2x viral kit-lagerlösning med underhållsmediet.</li>
	<li>Förbered cellerna för infektion genom att justera medelvolymen till 100 μL per brunn. Tillsätt 100 μl av den förblandade viruslösningen och inkubera i 8–16 timmar vid 37 °C.</li>
	<li>Byt ut med 200 μL förvärmt medium efter inkubation.</li>
	<li>Visualisera GECIs-uttrycket 24 timmar efter transduktion med hjälp av ett bildsystem (se Materialförteckning). OBS: Uttrycksnivån når maximalt vid 48-72 h efter transduktion. Celler kan avbildas från 24-timmarspunkten. Signalerna som erhålls från GECIs upprätthåller dock i mer än en månad.</li>
	<li>Behåll celler i den fuktade inkubatorn innan funktionella analyser utförs.</li>
	<li>Infektera iPSC-CMs (LVNC patient-derived iPSC-CMs) med ChR2-K-GECO viral kit (se materialförteckning) vid dag 25 efter differentiering med hjälp av infektionsprotokollet (steg 2.1-2.6).</li>
</ol>3. Färgämnesbaserad kalciumavbildning med Fluo-4
<ol><li>Lös upp Fluo-4 pulver (se materialtabell) i DMSO som stamlösning (5 mM).</li>
	<li>Späd stamlösningen till en koncentration av 10 μM Fluo-4 i Tyrodes buffert. OBS: Tyrods buffert består av 1,0 g/L natriumbikarbonat, 0,2 g/L kalciumklorid, 0,1 g/L magnesiumklorid, 0,2 g/L kaliumklorid, 8,0 g/L natriumklorid, 0,05 g/L natriumfosfat monobasiskt och 1,0 g/L D-glukos.</li>
	<li>Byt ut halvmediet med 10 μM Fluo-4-lösning (vilket ger en slutlig koncentration på 5 μM).</li>
	<li>Inkubera cellerna vid 37 °C i 30 minuter.</li>
	<li>Tvätta cellerna med förvärmd Tyrodes buffert och ersätt dem med mediet innan bildinsamling.</li>
	<li>Börja spela in med strömförvärvsprotokollet. Strömförvärv är att kontinuerligt hämta bilder utan intervalltid. Slagfrekvensen för iPSC-CM är cirka 1 Hz, och detta strömförvärvsprotokoll används för att samla in slagmönster.</li>
</ol>4. Bildförvärv och funktionella analyser för toxicitetstest och fenotypisk screening
<ol><li>Slå på alla enheter i High-Content Imaging System (se Materialförteckning).</li>
	<li>Kontrollera att kammartemperaturen når 37 °C, med 5% CO2-tillskott . Håll systemet i jämvikt i 2 timmar före bildförvärv. OBS: Termisk drift är ett betydande problem för långsiktiga observationer av levande celler, 1 ° C kan ändra fokalplanet med ~ 1 μm, så att låta linsen och scenen nå måltemperaturen är viktigt före bildförvärv.</li>
	<li>Öppna bildbehandlingsprogrammet (se Materialförteckning) och välj plattinställningen för en 96-brunnsplatta.</li>
	<li>Placera en olidd 96-brunnsplatta i kammaren och ladda med tätningsringen i levande celler ovanpå. OBS: Tätningsringen för levande celler är en adapter för att nå miljöjämvikt.</li>
	<li>Välj objektivlinsen 20x (bild 1 och bild 2), 60x (bild 3 och bild 4) och 20x (figur 5) för nedsänkning i vatten enligt den rumsliga upplösning som krävs.</li>
	<li>Justera fokus för att ta tydliga bilder innan experimentellt förvärv.</li>
	<li>Välj 3-5 regioner slumpmässigt per brunn för inspelning av kalciumaktivitet. OBS: Varje region måste innehålla minst 20 celler (n ≥ 20).</li>
	<li>Välj lämpliga filter för olika indikatorer. FITC 475/536 för mNG-GECO, mtGCEPIA3 och Oria1-G-GECO; Cy5 631/692 för NIR-GECO2; ER 530/593 för ER-LAR-GECO; Texas Red 560/624 för K-GECO.</li>
	<li>Ställ in lämplig lysdiodeffekt (LED) för varje bildkanal som används. OBS: När du optimerar LED-effekten för bildförvärv med signal (detekterad intensitet av objekt) till brus (detekterad bakgrundsintensitet) -förhållande, bör S / N-förhållandet vara högre än 2. I detta protokoll, 10% LED-effekt för TRITC och FITC; 20% för Cy5 var typiskt.</li>
	<li>Ställ in kamerans exponeringstid på högst 40 ms (25 Hz) och en inspelningstid på 30 sfor strömförvärv för att observera kalciumtransienter som rapporterats av mNG-GECO- och K-GECO-sonder uttryckta i kardiomyocyter (figur 1-3 och figur 5). Öka LED-effekten om signalen / bruset är <2 vid högre bildhastigheter.</li>
	<li>För optogenetisk stimulering (figur 2 och figur 3C,D), optimera effekten (vanligtvis 5%-10%) och frekvensen av blått ljus vid 1 Hz. OBS: I allmänhet slår mänsklig iPSC-CM spontant runt ~ 1 Hz, och operatören måste takta snabbare än den spontana hastigheten.</li>
	<li>Om sekventiella (figur 3) eller utökade (figur 4) mätningar planeras, undvik fototoxicitet till varje pris. Detta kan innebära att minska belysningseffektintensiteten och kompensera för detta genom att öka kamerans exponeringstid, till exempel till 100 ms med time-lapse-protokollet som används för trekanals realtidsobservation av subcellulära Ca2+ -signaler (figur 4).</li>
	<li>Använd det asynkrona dispenseringsprotokollet för 10 mM koffeintillsats via det automatiska mikrofluidiksystemet (se materialförteckning) (figur 4). OBS: Det asynkrona dispenseringsprotokollet tillåter bildförvärv att ske medan läkemedel som koffein tillsätts, utan mellanrum mellan bilder.</li>
	<li>Starta förvärv.</li>
</ol>5. Beredning av små molekyler
<ol><li>Återupphäng E4031, dofetilide och verapamil i DMSO och späd dem med Tyrodes buffert. Den slutliga koncentrationen av DMSO i mediet var 0,1 % (v/v).</li>
	<li>Bered de sammansatta lösningarna vid dubbel (dvs. 2x) önskad arbetskoncentration och balansera vid 37 °C före tillsats. OBS: Att minimera temperaturfluktuationer efter medium tillsats är avgörande eftersom kontraktiliteten är temperaturberoende och effekten av att ändra temperaturen är snabb.</li>
	<li>Ordna föreningar till motsvarande målbrunn.</li>
	<li>Tillsätt 100 μL av föreningarna med dubbel styrka (2x) via det automatiska mikrofluidiksystemet (se materialtabell) i brunnarna och börja anskaffa efter önskad (vanligtvis 15 min) inkubationsperiod.</li>
</ol>6. Bearbetning och analys av bildåtergivning
<ol><li>Isolera signalområdet från bakgrunden genom att automatiskt detektera pulsens funktion över tidsrevolution med programvaran.</li>
	<li>Använd kalciumtoppanalysprogramvaran (se materialförteckning) för att analysera slagfrekvens (BPM), toppsignal (amplitud), kalciumtransient varaktighet 50% (CTD50), kalciumtransient varaktighet 90% (CTD90), stigningstid och sönderfallstid (figur 1C). OBS: I dessa inställningar var fotoblekning uppenbar under de första 10 s, och signalerna stabiliseras efter det. Således analyserades kalciumtoppen från 11-30 s. I trekanalsinspelningar (figur 4) gränsar cellkonturen manuellt för att mäta intensitetsförändring.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Connor, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+3R+principle:+Advancing+clinical+application+of+human+pluripotent+stem+cells.">The 3R principle: Advancing clinical application of human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 4 (2), 21 (2013).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Ovics, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+development+and+the+use+of+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+disease+modeling+and+drug+toxicity+screening.">Drug development and the use of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for disease modeling and drug toxicity screening.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7320 (2020).</li><li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+calcium+indicators.">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li><li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+intracellular+calcium.">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).</li><li>Smith, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Ca(2+)+indicators+directly+inhibit+the+Na,K-ATPase+and+disrupt+cellular+functions.">Fluorescent Ca(2+) indicators directly inhibit the Na,K-ATPase and disrupt cellular functions.</a> Science Signaling. 11 (515), (2018).</li><li>Shen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+Ca2++indicator+based+on+circularly+permutated+sea+anemone+red+fluorescent+protein+eqFP578.">A genetically encoded Ca2+ indicator based on circularly permutated sea anemone red fluorescent protein eqFP578.</a> BMC Biology. 16 (1), 9 (2018).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+near-infrared+fluorescent+calcium+ion+indicator.">A genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicator.</a> Nature Methods. 16 (2), 171-174 (2019).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+fluorescent+genetically+encoded+Ca2++indicators+for+use+in+mitochondria+and+endoplasmic+reticulum.">Red fluorescent genetically encoded Ca2+ indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum.</a> Biochemical Journal. 464 (1), 13-22 (2014).</li><li>Zarowny, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+high-performance+genetically+encoded+Ca2++indicator+based+on+mneongreen+fluorescent+protein.">and high-performance genetically encoded Ca2+ indicator based on mneongreen fluorescent protein.</a> ACS Sensors. 5 (7), 1959-1968 (2020).</li><li>Potekhina, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+with+genetically+encoded+fluorescent+sensors:+today+and+tomorrow.">Drug screening with genetically encoded fluorescent sensors: today and tomorrow.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 148 (2021).</li><li>Chang, Y. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+phenotyping+and+drug+testing+in+single+cardiomyocytes+or+beta-cells+by+calcium+imaging+and+optogenetics.">Non-invasive phenotyping and drug testing in single cardiomyocytes or beta-cells by calcium imaging and optogenetics.</a> PLoS One. 12 (4), 0174181 (2017).</li><li>Chang, Y. -. F., Arai, Y., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+activation+during+detector+&amp;#34;dead+time&amp;#34;+enables+compatible+real-time+fluorescence+imaging.">Optogenetic activation during detector &amp;#34;dead time&amp;#34; enables compatible real-time fluorescence imaging.</a> Neuroscience Research. 73 (4), 341-347 (2012).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).</li><li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+cardiomyocyte+and+fibroblast+interaction+using+layer-by-layer+deposition+facilitates+synchronisation+of+cardiac+macro+tissues.">Modulating cardiomyocyte and fibroblast interaction using layer-by-layer deposition facilitates synchronisation of cardiac macro tissues.</a> Soft Matter. 16 (2), 428-434 (2020).</li><li>Leonard, R. G., Talbert, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-channel+blocking+agents.">Calcium-channel blocking agents.</a> Clinical Pharmacology. 1 (1), 17-33 (1982).</li><li>Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+components+of+cardiac+delayed+rectifier+K++current.+Differential+sensitivity+to+block+by+class+III+antiarrhythmic+agents.">Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents.</a> The Journal of General Physiology. 96 (1), 195-215 (1990).</li><li>Lees-Miller, J. P., Duan, Y., Teng, G. Q., Duff, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinant+of+high-affinity+dofetilide+binding+to+HERG1+expressed+in+Xenopus+oocytes:+Involvement+of+S6+sites.">Molecular determinant of high-affinity dofetilide binding to HERG1 expressed in Xenopus oocytes: Involvement of S6 sites.</a> Molecular Pharmacology. 57 (2), 367-374 (2000).</li><li>Kamiya, K., Niwa, R., Mitcheson, J. S., Sanguinetti, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+determinants+of+HERG+channel+block.">Molecular determinants of HERG channel block.</a> Molecular Pharmacology. 69 (5), 1709-1716 (2006).</li><li>Fukushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+induction+and+long-term+maintenance+of+high+purity+ventricular+cardiomyocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Specific induction and long-term maintenance of high purity ventricular cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 15 (11), 0241287 (2020).</li><li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging.">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophysical Journal. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li><li>Suzuki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intraorganellar+Ca2++at+subcellular+resolution+using+CEPIA.">Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA.</a> Nature Communications. 5, 4153 (2014).</li><li>Qian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+genetically+encoded+near-infrared+fluorescent+calcium+ion+indicators+for+in+vivo+imaging.">Improved genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicators for in vivo imaging.</a> PLoS Biology. 18 (11), 3000965 (2020).</li><li>Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+targeted+single-channel+optical+recording+reveals+multiple+Orai1+gating+states+and+oscillations+in+calcium+influx.">Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 440-445 (2016).</li><li>Broyles, C. N., Robinson, P., Daniels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent,+bioluminescent,+and+optogenetic+approaches+to+study+excitable+physiology+in+the+single+cardiomyocyte.">Fluorescent, bioluminescent, and optogenetic approaches to study excitable physiology in the single cardiomyocyte.</a> Cells. 7 (6), 51 (2018).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+gene-transfer+efficiency+in+human+embryonic+stem+cells.">Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells.</a> Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).</li><li>Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+sustained+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+lentiviral+vectors.">High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors.</a> Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).</li><li>Haery, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+virus+technologies+and+methods+for+targeted+neuronal+manipulation.">Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93 (2019).</li><li>Nieuwenhuis, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+adeno-associated+viral+vector-mediated+transduction+of+the+corticospinal+tract:+Comparison+of+four+promoters.">Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: Comparison of four promoters.</a> Gene Therapy. 28 (1), 56-74 (2021).</li><li>Smith, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+promoter+function+and+cell-type-specific+expression+from+viral+vectors+in+the+nervous+system.">Characterization of promoter function and cell-type-specific expression from viral vectors in the nervous system.</a> Journal of Virology. 74 (23), 11254-11261 (2000).</li><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+an+immune+cell-specific+chimeric+promoter+in+regulating+anti-PD-1+antibody+expression+in.">Safety and efficacy of an immune cell-specific chimeric promoter in regulating anti-PD-1 antibody expression in.</a> CAR T cells. Molecular Therapy - Methods &amp; Clinical Development. 19, 14-23 (2020).</li></ol>

LumiSTAR har ansökt om patentskydd för användning av K-GECO, NIR-GECO och LAR-GECO.

För att framgångsrikt kunna utföra screening med hög genomströmning måste signalerna fördelas jämnt över odlingskärlet, vilket garanterar att slumpmässigt utvalda regioner av intresse (ROI) kan tillämpas automatiskt under bildförvärv. Även om kemiska kalciumindikatorer lätt uppfyller detta krav, har genetiskt kodade sonder historiskt producerat fläckar, snarare än ark, av signal som begränsar deras användning. Användningen av ett viralt transduktionssystem ger höga27,28 och ekvivalenta uttrycksnivåer för flera indikatorer bland målcellerna jämfört med konventionella transfektionsmetoder. Olika celltyper kan kräva olika promotorer, och valet av genleveranssystem kan behöva ändras i enlighet därmed 29,30,31. I heterogena cellmodeller kan transduktion och uttryckseffektivitet vara olika i specifika celltyper. Å ena sidan kan detta begränsa tillämpningen till vissa celler, men fenomenet kan utnyttjas för att skilja vissa celler i ett samodlingssystem32.
Huvudeffekten av detta tillvägagångssätt är befrielsen från en-till-en-förhållandet mellan experimentet och provet genom automatisering. I ett vanligt multibrunnsexperiment, för att samla in data vid fyra positioner inom en enda brunn, uppskattar vi att det tar cirka 15 timmar vid mikroskopet att samla 30 s-videor från en 96-brunnsplatta. I det automatiserade systemet tar detta ~ 4 h. Dessutom tar analys av data manuellt mycket längre tid än datainsamling. Analyssystemet som används här är cirka 200 gånger snabbare än den manuella motsvarigheten. Nettoresultatet är ett förbättrat arbetsflöde och höga kostnads- och tidsbesparingar.
Till skillnad från primära kardiomyocyter laddade med kalciumfärger som överlever i storleksordningen timmar, kan GECIs uttryckta i iPSC-CM: s via virala leveranssystem ge en signal i en experimentell modell som lever i några månader. Dessa modeller kan underhållas i ett multibrunnsformat och spåras samtidigt för seriell analys i höginnehållsavbildningssystem utvecklade för screening av små molekyler. Detta ger en enkel mänsklig experimentell plattform för att testa läkemedelseffekter under varaktigheter närmare de som upplevs av patienter (veckor eller månader) snarare än de minuter som vanligtvis används i toxikologiska analyser.
Systemet kan utökas för att leverera mätningar med flera parametrar genom att inkludera GECIs med distinkta utsläppsegenskaper från grönt till nära infrarött. Sådana experiment kräver korrekt excitationsljus och filteruppsättningar i den experimentella designen för att hålla signalerna åtskilda. Bred tillämpning i ett läkemedelsscreeningssammanhang kräver robusta och effektiva analysplattformar utöver läkemedelsdispensering. Även om modellen som beskrivs här fokuserar på användningen av flera dynamiska kalciumindikatorer, kan detta modifieras till strukturella markörer för cellform eller funktion. Dessa är vanligtvis lättare att visualisera eftersom de visar liten beat-to-beat-variabilitet jämfört med den hundrafaldiga variationen i intracellulär kalciumkoncentration. Detta tillvägagångssätt kan vara särskilt värdefullt för sällsynta sjukdomar där iPSC-intermediären som härrör från patienter kan innehålla alla genetiska drivkrafter och modifierare av ett visst tillstånd som kan bevaras i en skalbar cellmodell, vilket underlättar läkemedelsupptäckt i olika sjukdomar baserade på cellulära fenotyper som kan visualiseras oberoende av den underliggande biologiska mekanismen som kan vara utmanande att belysa.

Människobaserade inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda modeller anses vara en lovande lösning på 3R-målen (Replacement, Reduction, and Refinement) som anges för djurstudier 1,2. iPSC-härledda kardiomyocyter har använts för sjukdomsmodellering och läkemedelsupptäckt eftersom de rekapitulerar väsentliga aspekter av mänsklig biologi3. Kalciumavbildning, vanligtvis med kemiska färgämnen, har använts för att observera cellulär aktivitet före och efter läkemedelsbehandling 4,5. Kemiska färgämnesbaserade kalciumavkännande sonder hämmar emellertid direkt Na, K-ATPas och stör cellulär funktion6. Således har det varit problematiskt att spåra samma celler över timmar eller dagar när kemiska färgämnen används. Här används en rad genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECIs)7,8,9,10 över ett brett excitations-/emissions- och kalciumaffinitetsspektrum för att bilda en testplattform för hjärttoxicitet som erbjuder realtidsmätningar av flera organeller under längre tidsperioder11.
För att vidareutveckla det kalciumbaserade screeningkonceptet med hög genomströmning i iPSC-CM-modellen bortom det tidigare demonstrerade akademiska sammanhanget med hjälp av genetiskt kodade verktyg för optisk kontroll och kalciumavbildning genom samuttryck av en rödförskjuten kalciumindikator, R-GECO eller K-GECO med ett optogenetiskt verktyg, ChR212,13, har off-the-shelf virala kit genererats. Genom att övergå till ett höginnehållsinstrument utrustat med ett automikrofluidiskt system skiktas enkanals pipettering av sammansatt tillsats ovanpå levande cellavbildning. Slutligen förbättras och automatiseras båda viktiga aspekter av experimentvägen, bildbehandling och analys.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6055302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>auto microfluidic system</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td>A device has a single channel pipetter that can be used to add compound automatically</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caffeine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiosight-S l iPSC derived cardiomyocytes</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>C-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1096780100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dofetilide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PZ0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E4031</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER-LAR-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AA001a</td>
			<td>Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F14201</td>
			<td>Chmical calcium sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging System</td>
			<td>Molecular Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-CMs Maintenance Medium</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CMS-002</td>
			<td>iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium)</td>
			<td>NEXEL</td>
			<td>CMS-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AA005a</td>
			<td>Red-shifted GECI packed into adeno-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LumiCAL software</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>LUCS01a</td>
			<td>Software for analysis of calcium peak in cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mNG-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL008a</td>
			<td>Brighter green GECI packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mt-GCEPIA3 viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL011a</td>
			<td>GECI targgeting on mitochondria packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIR-GECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AV004a</td>
			<td>Near infrared GECI packed into viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orai1-GGECO viral kit</td>
			<td>LumiSTAR</td>
			<td>AL010a</td>
			<td>GECI targgeting on Orai1 packed into lenti-viral vector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrode&#39;s salts</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput optical controlling and recording calcium signal in ipsc-derived cardiomyocytes for toxicity testing and phenotypic drug screening

Att förstå hur exciterbara celler fungerar vid hälsa och sjukdom och hur det beteendet kan förändras av små molekyler eller genmanipulation är viktigt. Genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI) med flera emissionsfönster kan kombineras (t.ex. för samtidig observation av distinkta subcellulära händelser) eller användas i utökade applikationer med andra ljusberoende ställdon i exciterbara celler (t.ex. kombinera genetiskt kodad optogenetisk kontroll med spektralt kompatibla kalciumindikatorer). Sådana metoder har använts i primära eller stamcellsderiverade neuroner, kardiomyocyter och beta-celler i bukspottkörteln. Det har dock varit utmanande att öka genomströmningen, eller varaktigheten av observationen, av sådana tillvägagångssätt på grund av begränsningar av instrumenten, analysprogramvaran, indikatorprestanda och genleveranseffektivitet. Här kombineras en högpresterande grön GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) och rödförskjuten GECI, K-GECO, med optogenetisk kontroll för att uppnå alloptisk kontroll och visualisering av cellulär aktivitet i ett bildformat med hög genomströmning med hjälp av ett High-Content Imaging System. Applikationer som visar kardiotoxicitetstestning och fenotypisk läkemedelsscreening med friska och patient-härledda iPSC-CM visas. Dessutom demonstreras multiparametriska bedömningar med kombinationer av spektral- och kalciumaffinitetsindikatorvarianter (NIR-GECO, LAR-GECO och mtGCEPIA eller Orai1-G-GECO) begränsade till olika cellulära fack i iPSC-CM-modellen.

Observationen av spontan kalciumoscillation i mNG-GECO10 uttryckt av iPSC-härledda kardiomyocyter (iPSC-CM) med eller utan läkemedelsbehandlingar visas i figur 1 och animerad video 1. Kinetiska spår erhållna med mNG-GECO visar att små molekylära jonkanalhämmare, verapamil, dofetilid och E4031, påverkade kalciumtransienter (figur 1B) som förväntat. Den typiska kalciumtransienten som visas i figur 1C kan analyseras av kalciumtoppanalysprogramvara för att härleda toppsignal (amplitud), kalciumövergående varaktighet 50% (CTD50), kalciumövergående varaktighet 90% (CTD90), stigtid och sönderfallstid. Verapamil, en kalciumblockerare av L-typ17, hämmar helt kalciuminflödet i cellerna som förväntat (figur 1B). Dofetilid och E4031 är hERG-kanalhämmare18,19,20, listade som experimentella klass III-antiarytmiska läkemedel. Sönderfallstiden förlängs med både Dofetilide (p < 0,05) och E4031 behandling (p < 0,001) jämfört med vehikelgruppen. Förlängning av CTD50 (p < 0,01) och CTD90 (p < 0,001) med E4031-behandling observerades jämfört med endast vehikel (tabell 1), dessa resultat överensstämmer med rapporterade effekter på QT-intervallet, en kliniskt relevant mätning av repolarisering bestämd från ytelektrokardiogrammet från lång tid mellan början av Q-vågen och slutet av T-vågen, i tidigare studier 12,21.
En svårighet med CTD-bedömning i spontant slående celler är variabilitetstakten som åläggs CTD. Detta är ett särskilt problem för iPSC-CM-modellen, där varje brunn i en 96-brunnsplatta kan ha sin egen beathastighet trots att alla celler kommer från samma moderflaska. Det är möjligt att införa en takthastighet genom optisk eller elektrisk pacing. För att utvärdera dosresponsen för E4031 under standardiserade tempoförhållanden styrdes ChR2 och K-GECO7 som uttrycker iPSC-CM optiskt med 1 Hz 470 nm ljuspulser och observerades med hjälp av den röda K-GECO-signalen (figur 2A och kompletterande figur 1). Progressiva minskningar av toppamplituden (p < 0,01) och ökning av sönderfallstiden (p < 0,05) av kalciumtransienterna sker med ökande koncentrationer av E4031 (figur 2B1). En dosberoende effekt av E4031 var tydligast för minskningarna av toppamplituden (figur 2B1,B2).
Även om korttidsstudier som varar i minuter vanligtvis används för kardiotoxicitetsbedömningar, finns det en blind fläck för kroniska toxicitetsbedömningar som parallell patientexponering för läkemedel under veckor, månader eller år. Det skulle vara fördelaktigt att studera sjukdoms- eller toxicitetseffekter under de intervall som återspeglar de behandlingstider som är relevanta för klinisk praxis. Vi använde vårt heloptiska kontroll- och detektionssystem för att studera iPSC-härledda kardiomyocyter från en patient med vänster ventrikulär icke-komprimering (LVNC). iPSC-CM transducerades med ett K-GECO-viralt kit (steg 2.2-2.6) efter differentiering dag 25. K-GECO-signalen spårades sedan var 1-2: e vecka i samma brunnar, med eller utan ytterligare läkemedelsbehandlingar. Både spontan kalciumaktivitet (figur 3A,3B) och kalciumdynamik under optisk pacing (figur 3C,D, steg 4.11) erhölls med hjälp av high-Content Imaging System (steg 4.1-4.12) och bearbetades av kalciumtoppanalysprogramvara (steg 6). Som visas i figur 3A,C förblir klara kalciumtransienter synliga en månad efter viral transduktion, med eller utan det extra ljus som används för optisk pacing. Detta arbete identifierade ett läkemedel som verkar öka slagfrekvensen, reglera sammandragningsintervallet och öka den övergående kalciumamplituden i LVNC iPSC-CM-modellen (figur 3A, B). Det finns två viktiga observationer att göra utifrån dessa data. För det första, ur det terapeutiska perspektivet, verkar läkemedelseffekten hållbar vid dag 63 och dag 70-tidpunkter. För det andra, och av relevans för ett fält som i allmänhet analyserar sammansatta effekter under korta fönster (<1 min) vid tidigare tidpunkter (vanligtvis <50 dagar); de sjukdomsfenotypmodifierande effekterna av föreningen är endast uppenbara efter dag 60, vilket tyder på att det kan vara lätt att rabattera läkemedel som har långsamma verkningsmekanismer i standard screeningprotokoll.
Variationen i slagfrekvens och den efterföljande påverkan på kalciumövergående varaktighet är inte bara ett väl-till-bra-problem vid varje given tidpunkt. Det förändras också när iPSC-CM bibehålls i kulturen, som varierar inom en brunn över tiden (figur 3B). För att införa konsekvens inom sekventiella experiment kan 1 Hz optisk pacing tillämpas med eller utan läkemedelsbehandling (figur 3C,D). Här även om dag 63-resultaten visar de uppmuntrande trenderna i kalciumtransienten med en signifikant högre amplitud, kortare CTD90 och kortare sönderfallstid; vid 70-dagars tidpunkt - och indikerar behovet av kroniska bedömningar under läkemedelsscreeningsprocessen för sällsynta sjukdomar - tidigt efter att depolariseringar (EAD) har upptäckts. Värdet av att lägga till ett pacingprotokoll till sjukdomsfenotypning, eller småmolekylutvärdering, kan bedömas kvalitativt genom jämförelse av resultaten som presenteras i figur 3B, D för slaghastighet, kalciumövergående amplitud, CTD90 och sönderfallstid.
En fördel med en GECI, jämfört med kemiskt färgämne, baserad metod för att visualisera kalciumtransienten är förmågan att begränsa sonden till ett specifikt fack i en cell. Detta kan utökas ytterligare genom att multiplexera flera färg- och/eller affinitetsvarianter i enskilda celler. Därför har flera GECIs inklusive ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA 22,23 (eller Oria1-G-GECO) och NIR-GECO2 8,24 utvecklats för uttryck enskilt eller i kombination i cellmodeller för mätning av kalciumaktivitet i realtid som uppstår i endoplasmatisk retikulum / sarkoplasmatisk retikulum (ER / SR), mitokondrier (eller CRAC-kanal) respektive cytosol. De kan kombineras i iPSC-CM-modellen (figur 4A,C) för att studera interaktionen mellan olika intracellulära kalciumlager. Till exempel kan 10 mM koffeinbehandling användas för att tömma SR-kalciumlagret. Här var en minskning av ER-LAR-GECO-signalen (indikerande på förlust av kalcium från SR) parallellt med en nedgång av NIR-GECO-signalen (vilket indikerar en ökning av cytosolisk kalciumkoncentration) som förväntat. Hur andra intracellulära fack påverkas av dessa fluktuationer är inte väl studerat. Ändå visar införandet av en grön mitokondriellt riktad mtGCEPIA3 att kalciumupptag sker i mitokondrier under dessa förhållanden (figur 4A,B).
På samma sätt kan visualisering av samspelet mellan olika kalciumströmmar ses genom att inkludera en sond, Orai1-G-GECO25, för att avslöja kalciumfrisättningsaktiverad kanal (CRAC) Ca2+ ström (figur 4C, D). I iPSC-CM-modellen ökar denna signal med den spontana cytosoliska kalciumtransienten (figur 4D1,D2). I linje med detta framkallar behandling med koffein en stor kalciumövergående i både cytosolen och från Orai1-kanalen.
Det är erkänt att de flesta kalciumövergående avbildningar i kardiomyocytmodeller har bestämts med användning av kalciumfärger26. En genetiskt kodad kalciumindikator jämfördes med ett kemiskt färgämne i den iPSC-härledda kardiomyocytmodellen för att möjliggöra en jämförelse sida vid sida av olika kalciumavbildningsmetoder. K-GECO som uttrycker iPSC-CM avbildades tillsammans med Fluo-4-laddade celler. K-GECO som uttrycker kardiomyocyter visade konsekvent slagbeteende över tid (figur 5A, C). Fluo-4-laddning påverkade dock både taktfrekvensen och CTD i denna modell (figur 5B, C), vilket tyder på att Fluo-4 i sig kan påverka resultaten av sådana experiment. Detta kommer att vara särskilt sant efter långvarig exponering för bildsonden, vilket kan inträffa i flerväggsavbildningsformatet om well-by-well-avbildning sker med en minuts uppehållstid per brunn.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig01.jpg"> Figur 1: Småmolekylära jonkanalhämmare applicerade på iPSC-härledda kardiomyocyter . (A-B) Time-lapse-bilder av iPSC-CM som uttrycker mNG-GECO tagna vid 25 Hz. Skalstreck = 50 μm. (B) Representativa Ca2+ svängningar efter sammansatt tillsats. Fluorescerande signaler erhållna från mNG-GECO-uttryckande celler presenteras som ett fluorescensförhållande F/F0, där F0 definieras som basalintensitet och F den intensitet som detekteras vid varje tidpunkt. (C) Kalciumtoppanalysprogramvara kan extrahera parametrar inklusive halv maximal bredd (CTD50), 90% övergående varaktighet (CTD 90), stigningstid och sönderfallstid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig02.jpg"> Figur 2: Exempel på dosrespons med hERG-hämmaren E4031 i ett optiskt pacingsystem . (A) Spår av optisk stimulering med 10% blått ljus i olika koncentrationer av E4031. Time-lapse-bilder av iPSC-härledda kardiomyocyter som uttrycker K-GECO tagna vid 25 Hz. (B1) Representativa spår av kalciumtransienter erhållna med olika sammansatta doser. Toppanalys och dos-respons av E4031 i amplitud (B2) och sönderfallstid (B3). Blå staplar indikerar 1 Hz 470 nm pulsljusstimulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig03.jpg"> Figur 3: Alloptisk plattform som används för långvarig läkemedelsfenotypisk screening i LVNC-patient-härledda kardiomyocyter. (A) Representativt spår av spontan slagaktivitet i patient-härledda kardiomyocyter (efter differentiering dag 70) med (röd) eller utan (blå) 5 μM läkemedelsbehandling. (B) Toppanalys av spontan slagaktivitet med eller utan 5 μM läkemedelsbehandling. (C) Intensitetsspår av läkemedelsrespons vid patient-härledd iPSC-CM under 1 Hz optisk stimulering. (D) Toppanalys av patient-härledda kardiomyocyter med 1 Hz optisk stimulering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig04.jpg"> Figur 4: Tre kanaler subcellulär Ca 2+ avbildning i iPSC-CM-modellen. (A-B) iPSC-CM transducerades med subcellulära kalciumprober för cytoplasman, NIR-GECO2 (röd), endoplasmatisk retikulum ER-LAR-GECO (gul) och mtGCEPIA3 (cyan), en mitokondriell Ca2+ indikator. (B) Trekanals time-lapse kalciumavbildning före och efter 10 mM koffeinbehandling. (C-D) iPSC-CMs transducerade med cytoplasmatiska, NIR-GECO2 (röd), endoplasmatisk retikulum ER-LAR-GECO (gul) och CRAC-kanalindikatorer Orai1-G-GECO (cyan) visualiserades. (D) Trekanals time-lapse kalciumavbildning fångades. (D1) Spontan beat-to-beat-aktivitet observerades med NIR-GECO2 och Orai1-G-GECO. (D2) Kalciumefflux från ER (minskning av ER-LAR-GECO-signalen) åtföljde en ökning av den cytosoliska kalciumsignalen vid koffeinbehandling. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63175/63175fig05.jpg"> Figur 5: Jämförelse av den genetiskt kodade kalciumindikatorn (K-GECO) med det kemiska kalciumkänsliga färgämnet (Fluo-4) i iPSC-CMs. (A-B) Representativa kalciumspår av K-GECO (A) och Fluo-4 (B) presenteras över tiden. (C) Kalciumtransient analys av K-GECO transducerad eller Fluo-4-laddad iPSC-CM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/63175fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Bpm</td>
			<td>CTD50 (s)</td>
			<td>CTD90 (s)</td>
			<td>Amplitud (F/F0)</td>
			<td>Stig tid</td>
			<td>Förfallstid (er)</td>
		</tr><tr><td>Fordon (0,1% DMSO)</td>
			<td>112.3657+/-10.95</td>
			<td>0.25+/-0.04</td>
			<td>0.41+/-0.01</td>
			<td>1.99+/-0.02</td>
			<td>0.07+/-0.01</td>
			<td>0.28+/-0.01</td>
		</tr><tr><td>Verapamil (1 uM)</td>
			<td>0</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Dofetilid (5 nM)</td>
			<td>103.42+/-9.87**</td>
			<td>0.23+/-0.03</td>
			<td>0.46+/-0.03</td>
			<td>1.91+/-0.03</td>
			<td>0.07+/-0.01</td>
			<td>0.35+/-0.02*</td>
		</tr><tr><td>E4031 (30 nM)</td>
			<td>75.73+/-12.08***</td>
			<td>0.37+/-0.04**</td>
			<td>0.58+/-0.08***</td>
			<td>1.55+/-0.02**</td>
			<td>0.11+/-0.04***</td>
			<td>0.35+/-0.07**</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Effekter av sammansatt tillsats till övergående kalciumparametrar i iPSC-CM-modellen. Signifikansvärden indikeras av *(p ≤ 0,05), **(p < 0,01) och ***(p < 0,001). 
Animerad video 1: Spontan kalciumaktivitet observerades av mNG-GECO i iPSC-härledda kardiomyocyter med endast vehikel. En pseudofärgad film av en gråskalebild tillhandahålls. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/fig1-video.avi" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
Kompletterande figur 1: Schematisk representation av adenoviralvektorn. Detta inkluderar kanalrhodopsin ChR2 som ställdon, med en röd fluorescerande kalciumindikator K-GECO som kalciumreporter för en helt optisk analys. Den ljuskänsliga jonkanalen gör att exciterbara celler kan depolariseras av ljus i det blågröna området för det synliga spektrumet. 470 nm ljus användes i dessa experiment. Kalciumtransienter i exciterbara celler kan samtidigt avbildas av K-GECO, vilket kräver grönt excitationsljus, vilket ger röda utsläpp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63175/Sup%20r1.pdf" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening at JoVE.com

High-Throughput Optical Controlling and Recording Calcium Signal in iPSC-Derived Cardiomyocytes for Toxicity Testing and Phenotypic Drug Screening

Detta protokoll beskriver alloptisk kontroll och observation av utlöst cellulär aktivitet i iPSC-härledda kardiomyocyter (iPSC-CM) för läkemedelsscreening och toxicitetstestning med hög genomströmning. Multiparametrisk kvantifiering av fenotypiska mönster i tid och rum visas. Långtidseffekter av läkemedel över timmar, eller sekventiella mätningar över dagar, demonstreras.

Optisk styrning och inspelning av kalciumsignal med hög genomströmning i iPSC-härledda kardiomyocyter för toxicitetstestning och fenotypisk läkemedelsscreening

Understanding how excitable cells work in health and disease and how that behavior can be altered by small molecules or genetic manipulation is important. ...

Vi demonstrerar otaliga metoder för all optisk kontroll och observation av utlöst cellulär aktivitet i iPSC-härledda kardiomyocyter för läkemedelsscreening och toxicitetstest med hög kapacitet. Aktivera multiparametrisk kvantifiering av de fenotypiska mönstren i tid och rum, gör det möjligt att observera effekten av läkemedel över timmar eller dagar. Denna metod kan tillämpas på olika typer av celler, såsom neuros eller betaceller, för funktionell screening och toxicitetstest.Demonstrerar proceduren kommer att vara Wan-Chi Su, en bioavbildningsingenjör från mitt laboratorium. Förbered flerbrunnsplattan innan iPSC-kardiomyocyter tas bort från kylförvaring för upptining. Täck varje brunn på mikroplattan med 96 brunnar med 100 mikroliter 0,02% gelatinlösning med 50 mikrogram per milliliter fibronektin för att täcka alla ytor noggrant.Överför iPSC-kardiomyocyterna från lagringstanken för flytande kväve till ett 37 grader Celsius vattenbad. Ta injektionsflaskan till ett biosäkerhetsskåp av klass två och överför försiktigt innehållet till ett nytt 15 ml koniskt rör som innehåller nio milliliter rumstemperaturmedium. Centrifugera cellerna vid 200 gånger G i tre minuter vid rumstemperatur.Kassera supernatanten med pipett och suspendera försiktigt cellerna i en milliliter medium med 10 mikromolar ROCK-hämmare Y27632. Plattceller belagda 96 brunnsplattor med densiteten 100 000 till 150 000 celler per kvadratcentimeter, enligt tillverkarens instruktioner. Efter 24 timmar, se till att cellerna som är fästa vid plattans yta är i kontakt med andra celler.Efter plätering av cellerna i 72 timmar tina GECIs virala kit på is. Förbered en virusstamlösning med dubbel styrka med underhållsmediet. Förbered cellerna för infektion genom att justera medelvolymen till 100 mikroliter per brunn.Tillsätt 100 mikroliter av den förblandade viruslösningen till brunnar och inkubera i åtta till 16 timmar vid 37 grader Celsius. Efter inkubation, ersätt med 200 mikroliter förvärmt medium. Visualisera GECIs-uttrycket 24 timmar efter transduktion med hjälp av ett bildsystem.Behåll celler i den fuktade inkubatorn innan funktionella analyser utförs. Slå på alla enheter i bildsystemet med högt innehåll. Kontrollera att kammartemperaturen når 37 grader Celsius med 5% koldioxidtillskott.Öppna bildprogramvaran och välj plattinställningen för en 96-brunnsplatta. Placera en 96-brunnsplatta utan lock i kammaren och ladda den levande celltätningsringen ovanpå. Välj 20X, 60X och 20X vattenfördjupningsobjektivlins, enligt den rumsliga upplösning som krävs.Justera fokus för att ta tydliga bilder innan experimentellt förvärv. Välj tre till fem regioner slumpmässigt per brunn för inspelning av kalciumaktivitet. Välj lämpliga filter för olika indikatorer.Ställ in lämplig lysdiodeffekt för varje bildkanal som används. Ställ in kamerans exponeringstid på högst 40 millisekunder eller 25 hertz och en inspelningstid på 30 sekunder för strömförvärv för att observera kalciumtransienter, rapporterade av MNG-GECO- och K-GECO-sonder uttryckta i kardiomyocyter. Öka LED-effekten om signal-brusförhållandet är mindre än två vid högre bildhastigheter.För optogenetisk stimulering, optimera kraften och frekvensen av blått ljus vid en hertz och börja förvärva. Stäng av E4031 Dofetilide och Verapamil i DMSO och späd dem med Tyrodes buffert. Ordna föreningar till motsvarande målbrunn.Tillsätt 100 mikroliter av dubbelhållfasthetsföreningen via det automatiska mikrofluidiska systemet i brunnarna och börja förvärva efter önskad inkubationsperiod. Isolera signalområdet från bakgrunden genom att automatiskt upptäcka pulsfunktionen, över tidsupplösning, med programvaran. Använd kalciumtoppanalysprogramvaran för att analysera slagfrekvensen, toppsignalen, kalciumövergående varaktighet 50% kalciumövergående varaktighet 90% stigningstid och sönderfallstid.Observationen av spontan kalciumoscillation i NMG-GECO uttryckt av iPSC-härledda kardiomyocyter med eller utan läkemedelsbehandlingar demonstreras i videon. Kinetiska spår erhållna med MNG-GECO visade att små molekylära jonkanalhämmare Verapamil, Dofetilide och E4031 påverkade kalciumtransienter som förväntat. För att utvärdera dosresponsen för E4031 under standardiserade, tempoförhållanden kanalrhodepsin-2 och K-GECO uttrycker iPSC CM kontrollerades optiskt med hjälp av en hertz och 470 nanometer ljuspulser och observerades med hjälp av den röda K-GECO-signalen.Progressiva minskningar av toppamplituden och ökning av sönderfallstiden för kalciumtransienterna sker med ökande koncentrationer av E4031. En dosberoende effekt av E4031 var tydligast för minskningarna av toppamplituden. Klara kalciumtransienter förblir synliga en månad efter viral transduktion, eller utan det extra ljus som används för optisk pacing.Grafen visar ett läkemedel som verkar öka takthastigheten, reglera sammandragningsintervallet och öka den övergående kalciumamplituden i LVNC iPSC CM-läget. Variationen i slagfrekvens och den efterföljande påverkan på kalciumövergående varaktighet förändras också när iPSC CM upprätthålls i kulturen. Flera GECIs, inklusive ER LAR-GECO, MTG-Sepia och NIR-GECO, har utvecklats för uttryck enskilt eller i kombination i cellmodeller för mätning av kalciumaktivitet i realtid som uppstår i endoplasmatisk retikulum, sarkoplasmatisk retikulum, mitokondrier respektive cytosol.GECIs kan kombineras i iPSC CM-modellen för att studera olika intracellulära kalciumlager. K-GECO som uttrycker kardiomyocyter visade konsekvent slagbeteende över tid. Fluo-4-laddning påverkade dock både taktfrekvensen och CTD i den här modellen, vilket tyder på att Fluo-4 i sig kan påverka resultaten av sådana experiment.Vi levererar ett enkelt sätt att studera fenotypiska profiler från kontroll- och patientderiverade celler, medan iPSC-intermediär kan belysa läkemedelsupptäckt vid olika sjukdomar.

Research

JoVE Journal

Medicine

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

Mus Eye enucleation för Remote hög kapacitet Fenotypning

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Screening för melanom Modifieringar med en Zebrafish Autoktont tumörmodell

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells

En Multiplex Luciferas screening plattform för Förhöra cancer-associerade Signaltransduktion i odlade celler

Genome-scale interrogation of gene function using RNA interference (RNAi)  holds tremendous promise for the rapid identification of chemically tractable  ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

En Organotypic hög genomströmning system för karakterisering av läkemedelskänslighet av primära multipelt myelom celler

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A Neonatal Mouse Spinal Cord Compression Injury Model

En neonatal mus ryggmärgskompression skada Modell

Spinal cord injury (SCI) typically causes devastating neurological deficits, particularly through damage to fibers descending from the brain to the spinal ...

Echocardiographic Approaches and Protocols for Comprehensive Phenotypic Characterization of Valvular Heart Disease in Mice

Ekokardiografiska Tillvägagångssätt och protokoll för omfattande Fenotypisk karakterisering av Klaffsjukdom hos möss

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in ...

Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Bedömning av sarkoplasmatiska nätmagen kalcium reserv och intracellulära diastoliskt kalcium borttagning i isolerade ventrikulära hjärtmuskelcellerna

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Optimerad LC-MS/MS metod för High-throughput analys av kliniska prover av ivakaftor, dess huvudmetaboliter och lumakaftor i biologiska vätskor av cystisk fibros patienter

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain

Studera hypotalamus Insulin signalen till perifera glukosintolerans med en kontinuerlig drog infusionssystemet in i musen hjärnan

Insulin regulates systematic metabolism in the hypothalamus and the peripheral insulin response. An inflammatory reaction in peripheral adipose tissues ...