Name: stimulating and analyzing adult neurogenesis in the drosophila central brain
Uploaded: 2021-10-08T14:30:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain at JoVE.com

Мы благодарны Стейси Римкус и Бекки Катценбергер за техническую помощь и Эдуардо Морено за совместное использование акций перма-близнецов. Мы хотели бы поблагодарить Барри Ганецки и Дэвида Вассармана за оживленные дискуссии, которые, несомненно, улучшили науку, а также Кента Мока, Кайлу Герру и Бейли Шпигельберга за их вклад в лабораторию. Антитела FasII были разработаны Кори Гудманом и получены из Банка исследований развития hybridoma, созданного NICHD NIH и поддерживаемого в Университете Айовы, Департамент биологии, Айова-Сити, IA 52242. Большинство штаммов дрозофилы , используемых в этом исследовании, были получены из Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC; NIH P40OD018537). Эта работа была поддержана NIH T32 GM007133 (KLC); NIH NS090190 (GBF); NIH NS102698 (GBF); Высшая школа Висконсинского университета (GBF); и Институт лидерства женщин в науке и технике UW-Madison (WISELI) (GBF).

<ol>
	<li>. Report to Congress: Traumatic brain injury in the United States Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/pubs/tbi_report_to_congress.html">https://www.cdc.gov/traumaticbraininjury/pubs/tbi_report_to_congress.html</a> (1999)</li><li>. NIEHS Available from: <a target="_blank" href="https://www.nih.gov/research/supported/health/neurodegenerative/index.cfm">https://www.nih.gov/research/supported/health/neurodegenerative/index.cfm</a> (2021)</li><li>Morton, N. V., Wehman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychosocial+and+emotional+sequelae+of+individuals+with+traumatic+brain+injury:+A+literature+review+and+recommendations.">Psychosocial and emotional sequelae of individuals with traumatic brain injury: A literature review and recommendations.</a> Brain Injury. 9 (1), 81-92 (2017).</li><li>Bonini, N. M., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sustained+impact+of+model+organisms-in+genetics+and+epigenetics.">The sustained impact of model organisms-in genetics and epigenetics.</a> Genetics. 205, 1-4 (2017).</li><li>Brace, E. J., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+axon+regeneration+in+Drosophila.">Models of axon regeneration in Drosophila.</a> Experimental Neurology. 287, 310-317 (2017).</li><li>Hao, Y., Collins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+mechanisms+for+axon+regeneration:+insights+from+injured+axons+in+Drosophila.">Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 44, 84-91 (2017).</li><li>Chiang, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+reconstruction+of+brain-wide+wiring+networks+in+Drosophila+at+single-cell+resolution.">Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution.</a> Current Biology. 21 (1), 1-11 (2011).</li><li>Meinertzhagen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organisation+of+invertebrate+brains:+cells,+synapses+and+circuits.">The organisation of invertebrate brains: cells, synapses and circuits.</a> Acta Zoologica. 91 (1), 64-71 (2010).</li><li>Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience:+A+history+lesson+for+the+future.">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: A history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li><li>Lessing, D., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintaining+the+brain:+insight+into+human+neurodegeneration+from+Drosophila+melanogaster+mutants.">Maintaining the brain: insight into human neurodegeneration from Drosophila melanogaster mutants.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (6), 359-370 (2009).</li><li>Boone, J. Q., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Drosophila+type+II+neuroblast+lineages+containing+transit+amplifying+ganglion+mother+cells.">Identification of Drosophila type II neuroblast lineages containing transit amplifying ganglion mother cells.</a> Developmental Neurobiology. 68 (9), 1185-1195 (2008).</li><li>Ito, K., Hotta, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+pattern+of+postembryonic+neuroblasts+in+the+brain+of+Drosophila+melanogaster.">Proliferation pattern of postembryonic neuroblasts in the brain of Drosophila melanogaster.</a> Developmental Biology. 149 (1), 134-148 (1992).</li><li>Siegrist, S. E., Haque, N. S., Chen, C. H., Hay, B. A., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+both+Foxo+and+reaper+promotes+long-term+adult+neurogenesis+in+Drosophila.">Inactivation of both Foxo and reaper promotes long-term adult neurogenesis in Drosophila.</a> Current Biology. 20 (7), 643-648 (2010).</li><li>von Trotha, J. W., Egger, B., Brand, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+in+the+Drosophila+adult+brain+revealed+by+clonal+analysis+and+bromodeoxyuridine+labelling.">Cell proliferation in the Drosophila adult brain revealed by clonal analysis and bromodeoxyuridine labelling.</a> Neural Development. 4, 9 (2009).</li><li>Fernandez-Hernandez, I., Rhiner, C., Moreno, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+neurogenesis+in+Drosophila.">Adult neurogenesis in Drosophila.</a> Cell Reports. 3 (6), 1857-1865 (2013).</li><li>Crocker, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+Drosophila+brain.">Neurogenesis in the adult Drosophila brain.</a> Genetics. , (2021).</li><li>Plavicki, J., Mader, S., Pueschel, E., Peebles, P., Boekhoff-Falk, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeobox+gene+distal-less+is+required+for+neuronal+differentiation+and+neurite+outgrowth+in+the+Drosophila+olfactory+system.">Homeobox gene distal-less is required for neuronal differentiation and neurite outgrowth in the Drosophila olfactory system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1578-1583 (2012).</li><li>Aso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+architecture+of+the+mushroom+body+provides+a+logic+for+associative+learning.">The neuronal architecture of the mushroom body provides a logic for associative learning.</a> Elife. 3, 04577 (2014).</li><li>Ito, K., Awano, W., Suzuki, K., Hiromi, Y., Yamamoto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+mushroom+body+is+a+quadruple+structure+of+clonal+units+each+of+which+contains+a+virtually+identical+set+of+neurones+and+glial+cells.">The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells.</a> Development. 124 (4), 761-771 (1997).</li><li>Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+one-step+dissection+protocol+for+whole-mount+preparation+of+adult+Drosophila+brains.">Simple one-step dissection protocol for whole-mount preparation of adult Drosophila brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (118), e55128 (2016).</li><li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+and+immunofluorescent+staining+of+mushroom+body+and+photoreceptor+neurons+in+adult+Drosophila+melanogaster+brains.">Dissection and immunofluorescent staining of mushroom body and photoreceptor neurons in adult Drosophila melanogaster brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).</li><li>Arain, U., Valentino, P., Islam, I. M., Erclik, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+immunohistochemistry+and+mounting+of+larval+and+adult+Drosophila+brains+for+optic+lobe+visualization.">Dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult Drosophila brains for optic lobe visualization.</a> Journal of Visualized Experiments. (170), e61273 (2021).</li></ol>

У авторов нет конфликта интересов.

Хотя проникающие повреждения мозга взрослых дрозофил были описаны ранее15,17,18, эти травмы были сосредоточены на зрительных долях, а не на центральном мозге. Кроме того, подробные инструкции о том, как проводить травмы, до сих пор отсутствуют. Этот протокол описывает модель проникающего повреждения центрального мозга взрослой дрозофилы, которая воспроизводит статистически значимые доказательства нейрогенеза взрослых после PTBI.
Воспроизводимость этого протокола PTBI частично обусловлена телом гриба как целевой областью повреждения. Тело гриба большое, состоящее из ~2200 нейронов со сложными дендрритными и аксонными беседками в больших и сильно стереотипных массивах18. Клеточные тела нейронов грибного тела лежат вблизи поверхности мозга и могут быть визуализированы через головную кутикулу с использованием экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) (рисунок 1C). Предшественники грибного тела являются последними нервными стволовыми клетками, подвергшимися апоптозу во время развития13,12,19. Таким образом, многие нейроны грибного тела довольно молоды на момент эклозии. Это привело к гипотезе о том, что грибное тело может иметь больший митотический потенциал, чем другие области мозга16. Кроме того, грибное тело имеет решающее значение для обучения и памяти18. Это позволяет задаться вопросом, приводит ли нейрогенез, вызванный PTBI, к функциональному восстановлению.
Другие факторы, которые способствуют воспроизводимости результатов, включают использование скрещенных мух с последовательными генотипами, выполнение скрещиваний в одном и том же направлении каждый раз, точный контроль температур выращивания и старения и анализ самцов и самок отдельно. Использование мух F1 из ауткросса снижает вероятность гомозиготного анализа мозга на предмет спонтанных мутаций. Стандартный крест y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP;; OK107-GAL4 взрослых самок к y[1] w[1] взрослым самцам мух приводит к F1 потомству генотипа y[1] w[1]; UAS-mCD8-GFP/+;; OK107-GAL4/+. OK107-GAL4 экспрессируется во всех внутренних нейронах тела гриба и управляет экспрессией мембранно-связанного репортера UAS-mCD8-GFP, позволяя визуализировать грибные тела и их проекции. Для перма-близнецовых крестов кресты должны постоянно оставаться при 17 °C, чтобы система отслеживания линий была отключена. Это гарантирует, что во время развития не будут помечены делящиеся клетки и что будут помечены только взрослые нейроны и глия. С этой целью летное отделение также может поддерживаться при температуре 17 °C. Хотя первоначальное описание системы perma-twin15 рекомендовало взращивать мух при 18 °C, это может привести к значительной фоновой маркировке.
Для согласованности также рекомендуется держать контроль неповрежденных мух на площадке CO2 , когда один выполняет PTBI. Это гарантирует, что оба набора мух имеют одинаковую анестезирующую экспозицию. Кроме того, желательно для воспроизводимости полностью проникнуть в голову. Тем не менее, необходимо соблюдать осторожность, чтобы не согнуть кончик штифта против колодки, что сделает его непригодным для будущих травм. Для опытных практиков существует небольшой непреднамеренный вред для мух PTBI. Тем не менее, слишком сильное давление на грудную клетку, чтобы стабилизировать муху во время травмы, может быть смертельным. Одним из способов оценки степени непреднамеренной травмы является количественная оценка смертности мух PTBI через 24 часа после травмы. Для односторонне травмированных мух это может быть 50% и выше для начинающих. Поэтому, чтобы гарантировать, что наблюдаемые результаты связаны с PTBI, а не с непреднамеренной травмой, рекомендуется, чтобы новички практиковали введение PTBI на ~ 20 мух ежедневно в течение нескольких недель и не анализировали полученный мозг до тех пор, пока 24-часовая смертность не будет последовательно <10%.
Для количественной оценки количества пролиферации, стимулируемой центральным ПТБИ головного мозга, можно использовать как иммуноокрашивание антифосфогистона H3 (PH3), так и включение 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU). Anti-PH3 маркирует клетки до и на протяжении всей метафазы, ограничивая обнаружение только частью активно делящихся клеток. Таким образом, окрашивание анти-PH3 обеспечивает лишь частичное проблеск пролиферации. EdU является аналогом тимидина, который может быть включен во вновь синтезированную ДНК. Кормя мух EdU до и после травмы, можно получить более полную картину клеток, которые либо делятся, либо разделились после травмы. Тот факт, что любые клетки, которые делятся, постоянно маркируются, полезен как для идентификации медленно циклических клеток, так и для анализа выживаемости клеток после первоначальной пролиферации. По неясным причинам, но, возможно, из-за ограниченной проницаемости гематоэнцефалического барьера, маркировка EdU неэффективна и недостаточно сообщает о пролиферации клеток во взрослом мозге. Об этом свидетельствует сходное количество клеток PH3+ и EdU+ как в контрольном, так и в экспериментальном мозге через 24 ч после PTBI и наблюдение, что только подмножество новых клеток в клонах перма-близнецов включает EdU16. Для максимальной маркировки важно предварительно кормить мух EdU, потому что травмированные мухи не возобновляют кормление в течение нескольких часов после PTBI. Кормление оценивали путем добавления пищевого красителя в раствор EdU и мониторинга количества красителя в кишечнике через брюшную кутикулу16.
Следует отметить, что, хотя мы предоставили протокол вскрытия мозга на этапе 4, могут быть использованы альтернативные методы. Некоторые из них доступны в ранее опубликованных протоколах20,21,22. Drosophila melanogaster предлагает недорогую модель с мощными генетическими и молекулярными инструментами, которые могут быть использованы для изучения механизмов, лежащих в основе регенерации нескольких тканей, включая кишечник и компоненты нервной системы. Здесь изложена новая и воспроизводимая модель травмы, которая может быть использована для изучения реакции на черепно-мозговую травму. Данные, полученные с использованием этих протоколов, подтверждают идею о том, что центральный мозг взрослой дрозофилы сохраняет пролиферативную способность, генерируя новые нейроны в ответ на травму. Эти наблюдения требуют дальнейшего изучения как степени взрослого нейрогенеза, так и лежащих в его основе молекулярных механизмов. Как только компоненты, участвующие в нейронной регенерации, будут идентифицированы в этой системе, мы сможем преобразовать наши знания о нейрогенезе взрослых дрозофилы к людям.

Повреждение мозга и нервной системы является основной причиной смерти и инвалидности во всем мире. Примерно 1,5 миллиона американцев страдают черепно-мозговыми травмами (ЧМТ) каждый год1, в то время как, по оценкам, 6 миллионов человек только в Соединенных Штатах страдают от нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и Альцгеймера2. Как заболевание, так и повреждение головного мозга могут вызвать нервную дегенерацию, приводящую к сенсорным, когнитивным и двигательным дефектам3. Разработка терапевтических стратегий восстановления человеческого мозга была затруднена из-за сложной физиологии мозга. Модельные организмы, такие как Drosophila melanogaster, обеспечивают простую систему для идентификации фундаментальных механизмов, лежащих в основе нейродегенерации и потенциальных терапевтических целей4.
Плодовая муха Drosophila melanogaster уже более века является мощным модельным организмом, продвигая области генетики, биологии развития и неврологии5,6. Мозг дрозофилы содержит всего ~ 90 000 нейронов7, что в миллион раз меньше, чем средний человеческий мозг8, но они имеют много общего. Как человеческий, так и мышиный мозг используют нейротрансмиттеры ГАМК, глутамат, ацетилхолин и биогенные амины дофамин и серотонин9. Дрозофила и нейроны человека также функционируют аналогично, с общей синаптической архитектурой и аналогичными типами нейронных клеток10. Меньший размер мозга дрозофилы и наличие передовых методов генетики в сочетании с сохранением молекулярных, клеточных и физиологических механизмов между дрозофилой и млекопитающими позволяет исследователям дрозофилы задавать вопросы, на которые непрактично или трудно ответить в моделях млекопитающих.
Наше нынешнее понимание нейрогенеза взрослых у дрозофилы, как во время гомеостаза, так и после травмы, остается ограниченным. Больше известно о нейрогенезе при нормальном развитии. Например, нейроны и глия создаются во время развития из клеток-предшественников, называемых нейробластами10,11. По крайней мере, три различных типа нейробластов были выделены в центральном мозге. Нейробласты линии I и II типа выходят из клеточного цикла через ~20-30 ч после образования пупариума12. Напротив, нейробласты грибного тела являются последними, кто прекращает деление клеток и делает это через Жнец-зависимый апоптоз ~ 85-90 ч после образования пупариума13. После эклозии мозг взрослой дрозофилы имеет несколько делящихся клеток (~ 1 клетка / мозг), преимущественно glia14. Взрослые зрительные доли обладают медленно циклическими нейробластами, способными к нейрогенезу15, в то время как взрослый центральный мозг не имеет известных нейробластов. Дефицит нейронных предшественников и ограниченная пролиферация клеток сильно напоминают ситуацию в мозге взрослых млекопитающих, подчеркивая потенциальную актуальность механизмов взрослого нейрогенеза у дрозофилы для человека.
Открытие низких уровней взрослого нейрогенеза в зрительных долях взрослой дрозофилы после травмы15 привело к гипотезе о том, что центральный мозг взрослой дрозофилы также может быть способен к взрослому нейрогенезу16. Этот протокол описывает создание строгой, воспроизводимой модели центральной черепно-мозговой травмы у взрослых дрозофил , которая может быть использована для исследования нейрогенеза в центральном мозге взрослого человека. Учитывая сходство между архитектурой и функцией мозга человека и дрозофилы , эти открытия могут привести к выявлению критических целей для терапевтического нейрогенеза в поврежденном и больном человеческом мозге.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#11 disposable scalpels</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-395923</td>
			<td>used for separating Drosophila heads from trunks prior to brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm diameter black Sylgard dishes</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1696157</td>
			<td>made in the laboratory with reagents from Dow; used for brain dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm coverslips</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>for mounting brains on microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>made from 95% ethanol sourced variously</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse Cy5</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-175-151</td>
			<td>for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit 568</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A11036</td>
			<td>for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>SIgma Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td>for immunohistochemisty</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>for sealing coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-It EdU labeling kit</td>
			<td>InVitrogen</td>
			<td>C10640</td>
			<td>to detect newly synthesized DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 bubbler</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-181</td>
			<td>for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 pad</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-114</td>
			<td>for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 regulator and supply</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>for imaging fixed, stained and mounted brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton plugs</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>51-101</td>
			<td>for EdU labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>for EdU labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fix buffer (Pipes, EGTA, Magnesium; PEM)</td>
			<td>components sourced from various companies</td>
			<td></td>
			<td>for fixing adult brains; 100 mM piperazine-N,N&#8217;-bis(2-ethanesulfonic acid) [PIPES], 1 mM EGTA, 1 mM MgSO4, pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252549</td>
			<td>for fixing adult brains, added to PEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grade 3 round Whatman filters, 23 mm round</td>
			<td>Tisch Scientific</td>
			<td>1003-323</td>
			<td>for EdU labeling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfuge tubes</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>for fixing and staining reactions and for storing Minutien pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>for mounting brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>for brain injury; 12.5 &#956;m diameter tip and 100 &#956;m diameter rod</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-Fasiclin II</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>1D4-s</td>
			<td>for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIGHTSEA stereo microscope fluorescence adaptor</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>SFA-GR</td>
			<td>fluorescence setup for dissecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P20, P200 and P1000 pipettors and tips</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>for measuring solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saliine (PBS)</td>
			<td>components sourced from various companies</td>
			<td></td>
			<td>for dissecting brains and making immunohistochemistry blocking and washing solutions; 100 mM of K2HPO4, 140 mM of NaCl, pH 7.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 (PT)</td>
			<td>components sourced from various companies</td>
			<td></td>
			<td>for washing dissected brains</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline with 0.1% Triton X-100 + 2% bovine serum albumin (PBT)</td>
			<td>components sourced from various companies</td>
			<td></td>
			<td>blocking solution for immunohistochemistry and for diluting antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-PH3</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc</td>
			<td>sc-8656-R</td>
			<td>for immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reinforcement labels</td>
			<td>Avery</td>
			<td>5721</td>
			<td>to maintain space between the microscope slide and the coverslip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Size 0 paintbrushes</td>
			<td>any</td>
			<td></td>
			<td>to manipulate and stabilize adult Drosophila during injury</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two pair of #5 watchmakers forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td>used to hold the Minutien pins and for brain dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>mounting medium for microscope slides</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stimulating and analyzing adult neurogenesis in the drosophila central brain

Молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе нейрогенеза в ответ на болезнь или травму, не совсем понятны. Тем не менее, понимание этих механизмов имеет решающее значение для разработки нейронной регенеративной терапии. Drosophila melanogaster является ведущей моделью для исследований развития нейронов, но исторически не использовалась для исследования регенерации мозга взрослых. Это в первую очередь связано с тем, что взрослый мозг проявляет очень низкую митотическую активность. Тем не менее, проникающая черепно-мозговая травма (PTBI) в центральный мозг взрослой дрозофилы вызывает генерацию новых нейронов и новой глии. Мощные генетические инструменты, доступные у дрозофилы , в сочетании с простым, но строгим протоколом травмы, описанным здесь, теперь делают мозг взрослой дрозофилы надежной моделью для исследований нейронной регенерации. Здесь приведены подробные инструкции для (1) проникающих повреждений центрального мозга взрослого человека и (2) рассечения, иммуногистохимии и визуализации после травмы. Эти протоколы дают высоковоспроизводимые результаты и облегчат дополнительные исследования для препарирования механизмов, лежащих в основе нейронной регенерации.

Watch this Scientific Journal Video about Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain at JoVE.com

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain (Video) | JoVE

В этой статье представлены подробные протоколы нанесения проникающей черепно-мозговой травмы (PTBI) взрослой дрозофиле и изучения результирующего нейрогенеза.

Стимуляция и анализ нейрогенеза взрослых в центральном мозге дрозофилы

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these ...

Этот протокол важен, потому что он демонстрирует метод центральной черепно-мозговой травмы, который запускает нейрогенез у взрослых при дрозофиле, где обычно его нет. Мы ожидаем, что использование этой техники для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе нейрогенеза взрослых, будет иметь отношение к регенерации нейронов человека. Изучение этой техники требует терпения и настойчивости.Мы рекомендуем практиковать от пяти до 10 мозгов ежедневно в течение нескольких недель, прежде чем собирать мозг для анализа. После обезболивания мухи на углекислотной подушке. Отсортируйте молодых самцов F1 в течение шести часов после эклозии и поместите их в чистые флаконы, содержащие пищу с 40 или менее мухами на флакон.Если планируется маркировка делящихся клеток с помощью EdU, приготовьте 200 микролитров 50 млн или более EdU в 10% сахарозе и поместите приготовленный раствор на 23-миллиметровую фильтровальную бумагу круглого сорта три в пустой флакон, затем поместите самцов мух во флакон для предварительного кормления за шесть часов до травмы. Затем продезинфицируйте Minutien Pins, поместив примерно 100 штифтов в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, заполненную 70% этанолом в течение пяти минут. Затем продезинфицируйте прокладку из углекислого газа и кисть, распыляя 70% этанола и вытирая насухо чистой безворсовой тканью.Как только инструменты будут чистыми и сухими, перенесите 40 или менее отсортированных самцов F1 на чистую площадку и разделите их на две группы. Одна группа будет служить в качестве контроля неповрежденных мух. А вторая экспериментальная группа подвергнется проникающей черепно-мозговой травме.Затем с помощью щипцов вытащите четыре-пять новых штифтов Minutien из трубки микроцентрифуги и поместите их к краю прокладки углекислого газа. Затем под рассекающим прицелом выбирают прямую булавку Minutien с острым острием. Повторно используйте острые штифты и поместите поврежденные или тупые штифты в отдельную трубку, содержащую 70% этанола для безопасной утилизации.Далее, для мух со стандартным перекрестным переключателем генотипа на стереомикроскопе светодиодная лампа оснащена соответствующими фильтрами возбуждения и излучения для белка зеленой флуоресценции, который допускает возбуждение при 440-460 нанометрах и позволяет визуализировать на 500-560 нанометрах. Затем выберите муху экспериментальной группы и расположите муху так, чтобы экспериментатор имел дорсальный вид головной капсулы с головой мухи головой справа. С помощью щипцов подберите и удерживайте выбранную булавку Minutien в одной руке, а кисть в другой руке.Затем поместите кисть на переднюю часть спинной грудной клетки и осторожно надавите вниз, чтобы стабилизировать муху. Направьте кончик булавки Minutien на тела грибов клеточные тела с правой стороны головы и проникните в головную капсулу. При использовании ориентиров нацелена на кутикулу спинной головки между оцеллиями и дорсальным краем глаза.После завершения травмы используйте кисть, чтобы осторожно оттолкнуть голову от булавки Minutien. При использовании мозга для секвенирования РНК или QRT ПЦР нам делают вторую травму на левой стороне головы. После того, как все экспериментальные мухи получили травмы, поместите контрольные и поврежденные мухи в отдельные маркированные флаконы, содержащие пищу.Уложите флаконы горизонтально, чтобы мухи не попали в пищу. Поместите стандартные поперечные мухи при 25 градусах Цельсия, а окунь летает при 30 градусах Цельсия до возраста. При старении дольше 24 часов переводите мух на чистую пищу каждые один-два дня.Значительное увеличение пролиферации наблюдалось через 24 часа после травмы с использованием анти-рН3-маркера для клеток, активно подвергающихся митозу. Приблизительно три pH3-положительные клетки наблюдаются в каждом из контрольных центральных мозгов. И 11 pH3 положительных клеток в каждом из поврежденных центральных мозгов.К семи дням в каждой из контрольных клеток присутствует в среднем две EdU-положительные клетки мозга. И 11 EdU положительных клеток в каждом из поврежденных центральных мозгов, что аналогично результатам, полученным через 24 часа после травмы с антителом pH3. Через 14 дней контрольная группа в среднем имела одну положительную клетку EdU на центральный мозг, а поврежденный мозг в среднем 29 положительных клеток EdU на центральный мозг.Демонстрация того, что пролиферация клеток продолжается, по крайней мере, на второй неделе после проникающей черепно-мозговой травмы. Самый сильный пролиферативный ответ в центральном мозге наблюдается, когда мозг повреждается в течение первых 24 часов после эклозии. К семи дням после эклозии проникающая травма все еще вызывает значительное увеличение пролиферации.Однако к 14 дням способность клеток делиться значительно снижается до одной делящейся клетки на мозг. Что похоже на контроль мозга. Используя систему маркировки permatwin, больше клонов permatwin было обнаружено в поврежденных образцах через два дня, за две недели, по сравнению с контрольной группой.При этом количество клонов увеличивается с течением времени после травмы. Через две недели после травмы в 50% поврежденных мозгов появились новые нейроны грибного тела. Эти новые нейроны проецировали свои дендриты примерно на чашечку тела гриба, а аксоны на доли тела гриба.Другие области мозга, которые, по-видимому, регенерируют, включают эллипсоидное тело Антеннальные доли и боковой рог. Обязательно используйте острый штифт Minutien при нанесении черепно-мозговых травм, так как использование тупого или изогнутого штифта увеличит смертность. Также не давите слишком сильно на мух кистью, так как это также увеличит смертность.После этой процедуры иммуногистохимия может быть использована для количественной оценки самораспространения, а также для идентификации новых нейронов и глии.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae (Video) | JoVE

Визуализация проприорецепторов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Личинки и куколки

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat (Video) | JoVE

Стереотаксической хирургии эксайтотоксичного Поражение конкретных областей мозга в взрослых крыс

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster (Video) | JoVE

Маркировка отдельных клеток в центральной нервной системе<em&gt; Дрозофилы</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition (Video) | JoVE

Функциональная Допрос взрослых гипоталамуса нейрогенеза с Focal радиологической ингибирования

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

Methods for the Modulation and Analysis of NF-ÃŽÂºB-dependent Adult Neurogenesis (Video) | JoVE

Методы модуляции и анализа NF-kB-зависимой нейрогенез

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System (Video) | JoVE

В естественных условиях Optogenetic возбуждение нервной системы грызунов Центральной

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration (Video) | JoVE

Ножевое ранение Травма данио рерио взрослых мозге: Метод по расследованию позвоночных мозг нейрогенеза и Регенерация

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining (Video) | JoVE

Оценка первичного нейрогенеза в<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбрионы Использование Иммунологическое

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains (Video) | JoVE

Простой Одношаговый Вскрытие Протокол целом монтажа подготовки взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Мозги

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light (Video) | JoVE

Анализ Synaptic модуляция<em&gt; Дрозофилы</em&gt; Фоторецепторы после экспозиции продолжительному воздействию света

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...