Name: a robust discovery platform for the identification of novel mediators of melanoma metastasis
Uploaded: 2022-03-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis at JoVE.com

우리는 NYU Langone Health의 DART(Advanced Research Technologies) 부서, 특히 Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087에 의해 부분적으로 지원되는 실험 병리학 연구소, 게놈 기술 센터, 세포측정 및 세포 분류 실험실, 전임상 이미징 코어에 감사드립니다. 우리는 IRB 승인 프로토콜 (Universal Consent study #s16-00122 및 학제 간 흑색종 협동 그룹 연구 #10362)을 통해 얻은 환자 유래 흑색종 단기 배양 + (10-230BM 및 12-273BM)에 대한 액세스를 제공 한 NYU 학제 간 흑색종 협력 그룹 (PI : Iman Osman 박사)에게 감사드립니다. 113/6-4L 및 131/4-5B1 흑색종 세포주*를 제공해주신 Robert Kerbel 박사(토론토 대학교)와 WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 흑색종 단기 배양**을 제공해주신 Meenhard Herlyn 박사(Wistar Institute)에게 감사드립니다. E.H.는 NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award 및 NIH Melanoma SPORE(NCI P50 CA225450; 파이 : I.O.). 그림 1은 Biorender.com 로 작성되었습니다.

참고 : 다음 프로토콜과 관련된 동물 절차는 뉴욕 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 모든 절차는 실험실 동물 관리 국제 평가 및 인증 협회 (AAALAC)가 승인 한 시설에서 수행됩니다. 도 1은 일반적인 실험 접근법을 도시한다.
1. 환자 유래 흑색종 단기 배양(STCs)
<ol><li>조직을 1mL의 완전 RPMI(10% 태아 소 혈청(FBS), 2mM...

<ol>
	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Cancer+Statistics+2020:+GLOBOCAN+Estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+pathways+in+patients+with+cutaneous+melanoma.">Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).</li><li>Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cutaneous+melanoma;+a+review+of+NRAS+and+BRAF+mutation+frequencies+in+relation+to+histogenetic+subclass+and+body+site.">Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site.</a> Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).</li><li>Alonso, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+study+in+melanoma+identifies+epithelial-mesenchymal+transition+as+a+major+determinant+of+metastasis.">A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis.</a> Cancer Research. 67 (7), 3450-3460 (2007).</li><li>Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+biological+determinants+of+melanoma+progression:+Should+all+be+considered+for+clinical+management.">Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management.</a> Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).</li><li>Plebanek, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-metastatic+cancer+exosomes+induce+immune+surveillance+by+patrolling+monocytes+at+the+metastatic+niche.">Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche.</a> Nature Communications. 8 (1), 1319 (2017).</li><li>Orgaz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+pigment+epithelium-derived+factor+enables+migration,+invasion+and+metastatic+spread+of+human+melanoma.">Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma.</a> Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).</li><li>Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pigment+epithelium-derived+factor+blocks+tumor+extravasation+by+suppressing+amoeboid+morphology+and+mesenchymal+proteolysis.">Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis.</a> Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).</li><li>Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+melanoma+cell-stroma+interaction+in+cell+motility,+invasion,+and+metastasis.">The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis.</a> Frontiers in Medicine - Dermatology. 5, 307 (2018).</li><li>Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CC+chemokine+receptor-7+and+regional+lymph+node+metastasis+of+B16+murine+melanoma.">Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+pathways+and+time+courses+in+the+orderly+progression+of+cutaneous+melanoma.">Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma.</a> British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).</li><li>Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+metastasis:+melanoma+and+other+cancers.">Genetics of metastasis: melanoma and other cancers.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).</li><li>Ubellacker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+protects+metastasizing+melanoma+cells+from+ferroptosis.">Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis.</a> Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li><li>Cunningham, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+protein+requirement+for+cortical+stability+and+efficient+locomotion.">Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion.</a> Science. 255 (5042), 325-327 (1992).</li><li>Unger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+carcinomas:+physiologically+relevant+3D+models+to+improve+anti-cancer+drug+development.">Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).</li><li>Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+melanoma+cell+lines+by+their+mortal+malignancy+using+an+experimental+metastatic+model.">Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model.</a> Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).</li><li>Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+YUMM+lines:+a+series+of+congenic+mouse+melanoma+cell+lines+with+defined+genetic+alterations.">The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).</li><li>Koya, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+inhibitor+vemurafenib+improves+the+antitumor+activity+of+adoptive+cell+immunotherapy.">BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy.</a> Cancer Research. 72 (16), 3928-3937 (2012).</li><li>Jenkins, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+murine+BRaf(V600E)+melanoma+cell+lines+with+sensitivity+to+PLX4032.">Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).</li><li>Tuncer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD+signaling+promotes+melanoma+metastasis+independently+of+phenotype+switching.">SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).</li><li>Schwartz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incipient+Melanoma+Brain+Metastases+Instigate+Astrogliosis+and+Neuroinflammation.">Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation.</a> Cancer Research. 76 (15), 4359-4371 (2016).</li><li>Perez-Guijarro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodel+preclinical+platform+predicts+clinical+response+of+melanoma+to+immunotherapy.">Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy.</a> Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).</li><li>Krepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Patient-Derived+Xenograft+Collection+Representing+the+Heterogeneity+of+Melanoma.">A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma.</a> Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).</li><li>Agrawal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+approach+identifies+FUT8+as+a+driver+of+melanoma+metastasis.">A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis.</a> Cell. 31 (6), 804-819 (2017).</li><li>Hanniford, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+CDR1as+drives+IGF2BP3-mediated+melanoma+invasion+and+metastasis.">Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis.</a> Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT5+control+of+cGAS/STING+and+NLRC5+pathways+defines+melanoma+response+to+antitumor+immunity.">PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity.</a> Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).</li><li>de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+five+new+melanoma+low+passage+cell+lines+representing+the+clinical+and+genetic+profile+of+their+tumors+of+origin.">Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).</li><li>Morsi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+clinically+relevant+mouse+model+of+melanoma+brain+metastasis.">Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).</li><li>Huynh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+microRNA+targeting+of+liver+metastasis.">Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis.</a> Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).</li><li>Zou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+variables+that+affect+human+hepatocyte+AAV+transduction+in+liver+chimeric+mice.">Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).</li><li>Kleffman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma-secreted+Amyloid+Beta+Suppresses+Neuroinflammation+and+Promotes+Brain+Metastasis.">Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis.</a> bioRxiv. , 854885 (2019).</li><li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL/6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation.">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).</li><li>Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+skin+deep:+autophagy+is+vital+for+skin+barrier+function.">More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1376 (2018).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+CRISPR+screen+in+a+mouse+model+of+tumor+growth+and+metastasis.">Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis.</a> Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+CRISPR+screens+reveal+fitness+genes+and+genotype-specific+cancer+liabilities.">High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).</li><li>Lappalainen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+European+Genome-phenome+Archive+of+human+data+consented+for+biomedical+research.">The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research.</a> Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).</li><li>Cerami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cBio+cancer+genomics+portal:+an+open+platform+for+exploring+multidimensional+cancer+genomics+data.">The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data.</a> Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).</li><li>Grossman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+shared+vision+for+cancer+genomic+data.">Toward a shared vision for cancer genomic data.</a> New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).</li></ol>

이 기술 보고서의 목적은 흑색종 전이의 잠재적 인 행위자에 대한 조사를위한 표준화 된 상하 워크 플로우를 제공하는 것입니다. 생체 내 실험은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요될 수 있으므로 효율성을 극대화하고 획득한 정보의 가치를 높이기 위한 전략이 가장 중요합니다.
동일한 실험 내에서 결과를 교차 검증하기 위해 보완적인 접근법을 사용하는 것이 필수?...

전이성 흑색종과 관련된 높은 사망률과 전 세계적으로 흑색종의 발생률 증가와 결합 1 (2025 년까지 약 7.86 % 증가)은 새로운 치료 접근법을 요구합니다. 표적 발견의 발전은 매우 복잡한 과정인 재현 가능한 전이 모델에 달려 있습니다. 전이성 캐스케이드의 단계를 통틀어, 흑색종 세포는 면역계 회피 및 먼 조직의 식민지화를 달성하기 위해 무수한 장벽을 극복해야 한다2. 흑색종 세포의 탄력성과 적응성은 높은 유전 적 돌연변이 부담 3과 신경 볏 기원을 포함한 다양한 요인에서 발생하며, 이는 중요한 표현형 가소성 3,4,5를 부여합니다. 각 단계에서, 전사 프로그램은 전이된 흑색종 세포가 면역계(6), 세포외 환경(7,8), 및 이들이 접촉하는 물리적 장벽(9)의 세포 구조를 포함하는 미세환경과의 누화로부터의 단서에 기초하여 한 상태에서 다른 상태로 전환하도록 허용한다. 예를 들어, 흑색종 세포는 중요한 면역프라이밍 종양-분비 인자6의 발현을 하향조절함으로써 면역 감시를 탈출한다.
연구는 흑색종 세포가 전이를 위해 먼 "표적"기관을 프라이밍하기 위해 케모카인과 사이토카인을 분비하는 "전이성 틈새 시장"을 기술합니다10. 이러한 발견은 전이성 흑색종 세포의 장기 기증과 먼 조직에 접근하기 위해 취하는 해부학 적 경로에 대한 중요한 질문을 제기합니다. 혈관 내 후, 흑색종 세포는 림프학(림프성 확산) 및 혈관(hematogenous spread)2,11을 통해 전이되는 것으로 알려져 있다. 대부분의 환자들이 국소화된 질환을 앓고 있는 반면, 소수의 사례들은 먼 전이성 질환과 림프 전파(음성 림프절 침범)11를 나타내지 않으며, 이는 흑색종에 대한 대안적인 전이성 경로의 존재를 시사한다.
그들이 전이성 부위를 식민지화할 때, 흑색종 세포는 후성유전학적 및 대사적 적응을 겪는다12,13. 새로운 구획에 접근하고 침범하기 위해, 흑색종 세포는 프로테아제 14 및 세포골격 변형11,15를 이용하여, 이들이 그들의 새로운 위치로 횡단하고 성장할 수 있게 한다. 흑색종 세포를 표적화하는 어려움은 그러한 적응의 복잡성과 수에 상주한다; 따라서 이 분야는 가능한 한 많은 단계와 적응을 실험적으로 재현하기 위해 노력해야 한다. 오가노이드 및 3D 배양물(16,17)과 같은 시험관내 분석에서의 수많은 진보에도 불구하고, 이들 모델은 단지 생체내 전이성 캐스케이드를 불완전하게 재분석한다.
뮤린 모델은 재현성, 기술적 타당성 및 인간 질병의 시뮬레이션 사이의 균형을 유지함으로써 가치를 보여주었습니다. 혈관내, 직교적 및 이종국적으로 이식된 흑색종 세포는 환자 유래 이종이식편 또는 단기 배양물로부터 면역-손상 또는 인간화 마우스로 전이성 흑색종에서 표적 발견의 중추를 나타낸다. 그러나 이러한 시스템은 종종 전이에 대한 중요한 생물학적 제약 조건, 즉 면역 체계가 부족합니다. 이 제약을 가진 합성 흑색종 전이 모델은 현장에서 상대적으로 부족합니다. 이들 시스템은, B16-F10 18, YUMM 패밀리 세포주19, SM1 20, D4M3 21, RIM322 또는 보다 최근에, RMS 23 및M1 (Mel114433),M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 흑색종 세포주를 포함하는 면역적격 마우스에서 개발되어, 흑색종 진행에서 숙주 면역 반응의 복잡한 역할의 조사를 용이하게 한다.
여기서, 흑색종 전이 표적 식별을 위한 파이프라인이 제시된다. 흑색종 환자 코호트에서 점점 더 큰 'omics'데이터 세트가 생성됨에 따라, 우리는 가장 임상 적 약속을 지키고있는 연구가 빅 데이터 통합에서 비롯된 연구이며 세심한 기능 및 기계론적 심문25,26,27,28로 이어진다고 가정합니다. 마우스 모델을 사용하여 전이성 과정에서 잠재적 표적을 연구함으로써, 생체내 특이적 사건 및 조직 상호작용을 설명할 수 있고, 따라서 임상 번역의 확률을 증가시킬 수 있다. 전이성 부담을 정량화하는 여러 가지 방법이 요약되어 주어진 실험 결과에 대한 보완적인 데이터를 제공합니다. 다양한 기관에서 종양으로부터 단리하기 위한 프로토콜이 단일 세포 또는 벌크 RNA 시퀀싱에 선행할 수 있는 전이성 세포에서 유전자 발현의 편향되지 않은 특성화를 돕기 위해 기술된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >#15 Scapel Blade&#160;</td>
			<td >WPI</td>
			<td >500242</td>
			<td >For surgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#3 Scapel Handle</td>
			<td >WPI</td>
			<td >500236</td>
			<td>For surgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mL Tuberculin syringe, slip tip&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >309626</td>
			<td>Injections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mL syringe, slip tip&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >301029</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% Formalin Sodium Buffered</td>
			<td >EK Industries</td>
			<td >4499-20L</td>
			<td>For perfusion/tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 mL Conical</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td>430052</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 Proof Ethanol</td>
			<td >Deacon Labs</td>
			<td >04-355-223</td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22G &#8211; 22mm needle</td>
			<td >BD</td>
			<td >305156</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-0 Vicryl Suture</td>
			<td >Ethicon</td>
			<td >J464G</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4% Carson&#39;s phosphate buffered paraformaldehyde&#160;</td>
			<td >EMS</td>
			<td >15733-10</td>
			<td>For perfusion/tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40&#181;m</td>
			<td >Corning</td>
			<td >431750</td>
			<td>Tissue processing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-0 Absorbable Suture&#160;</td>
			<td >Ethicon</td>
			<td >6542000</td>
			<td>Closure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mL Conical&#160;</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >430828</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 Silk suture&#160;</td>
			<td >FST</td>
			<td >18020-70</td>
			<td>Ligature</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70&#181;m</td>
			<td >Corning</td>
			<td >431751</td>
			<td>Tissue processing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-fade mounting media&#160;&#160;</td>
			<td >Vector Labs</td>
			<td >H-1000-10</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Approximator applying Forceps, 10cm&#160;</td>
			<td >WPI</td>
			<td>14189</td>
			<td>For microsurgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avance</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >3 HD</td>
			<td>NMR Console&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biospec 7030&#160;</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >7030</td>
			<td>Micro MRI</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSA</td>
			<td >Bioreg</td>
			<td >A941</td>
			<td>NuMA Staining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm&#160;</td>
			<td >WPI</td>
			<td>WP5025501</td>
			<td>For microsurgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coplin Staining Jar</td>
			<td >Bel-Art&#160;</td>
			<td >F44208-1000</td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542-1MG</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dCas9-KRAB</td>
			<td >Addgene</td>
			<td >110820</td>
			<td>Genetic manipulation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0303L</td>
			<td>Tissue processing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td >Corning</td>
			<td >21-030-CM</td>
			<td>Tissue processing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade</td>
			<td >GEM</td>
			<td >62-0167</td>
			<td>Tissue processing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extracellular Matrix Substrate&#160;</td>
			<td >Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fiji Image J</td>
			<td >Fiji Image J</td>
			<td >Software</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td >A16104</td>
			<td>NuMA Staining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >PCN5000</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS</td>
			<td >Corning</td>
			<td >21-020-CV</td>
			<td>Tissue processing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hematoxylin&#160;</td>
			<td>Richard-Allan Scientific&#160;</td>
			<td >7231</td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Illumina III&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>BLI Instrument</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulin syringe 28G - 8mm needle</td>
			<td >BD</td>
			<td >329424</td>
			<td>Injections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulin syringe 31G - 6mm needle&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >326730</td>
			<td>Injections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated</td>
			<td >WPI</td>
			<td >504478</td>
			<td>For perfusion and surgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane USP</td>
			<td >Covetrus</td>
			<td >11695067772</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip</td>
			<td >WPI</td>
			<td>WP6570</td>
			<td>For microsurgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine HCl 100mg/mL</td>
			<td >Mylan Ind.</td>
			<td >1049007</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lentiCRISPRv2</td>
			<td >Addgene</td>
			<td>98290</td>
			<td>Genetic manipulation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>L32472</td>
			<td>Vascular endothelial cells marker</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM non-essential amino acids X 100</td>
			<td >Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Metzenbaum Scissors</td>
			<td >WPI</td>
			<td >503269</td>
			<td>For surgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microinjection Unit</td>
			<td >KOPF</td>
			<td >5000</td>
			<td>Intracardiac injections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>S25877&#160;</td>
			<td>NuMA Staining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle 30G x 25mm</td>
			<td >BD</td>
			<td>305128</td>
			<td>Intracardiac Injection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle 33G x 15mm</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>7747-01</td>
			<td>Intracarotid Injection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws</td>
			<td >WPI</td>
			<td>14137-G</td>
			<td>For microsurgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td >005557</td>
			<td>Murine model</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NU/J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td >002019</td>
			<td>Murine model</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human&#160;</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >97585</td>
			<td>NuMA Staining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin 10000U/mL</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Percoll</td>
			<td >GE</td>
			<td >0891-01</td>
			<td>density separation solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI Classic Surgical Gloves</td>
			<td >Cardinal Health</td>
			<td >2D72PT75X</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pLKO Tet-On</td>
			<td >Addgene</td>
			<td >21915</td>
			<td>Genetic manipulation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-Iodine 10% Solution</td>
			<td >Medline</td>
			<td >MDS093943</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proparacaine Drops 0.5%</td>
			<td >Akorn Pharma</td>
			<td>AX0501</td>
			<td>Opthalmic local anesthetic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment</td>
			<td >Dechra</td>
			<td >83592</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Razor Blade Double Edge Blades&#160;</td>
			<td >EMS</td>
			<td >72000</td>
			<td>Shaving and Vibrotome Brain Slicing&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reflex 9mm EZ Clip&#160;</td>
			<td >Braintree</td>
			<td>EZC-&#160;KIT</td>
			<td>Wound closure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640&#160;</td>
			<td >Corning</td>
			<td >10-040-CM</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades</td>
			<td >WPI</td>
			<td>501235</td>
			<td>For microsurgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome</td>
			<td >Leica</td>
			<td >VT1200</td>
			<td>Brain Slice Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Channel Anesthesia Vaporizer System</td>
			<td >Kent Scientific</td>
			<td >VetFlo-1210S&#160;</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower</td>
			<td >EZ Systems</td>
			<td >TT4000</td>
			<td>CO2 Euthanasia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile Fenestrated Disposable Drape</td>
			<td >Medline</td>
			<td >NON21002</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves</td>
			<td >Medline</td>
			<td >DYNJP2715</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 Flask</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >430639</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris</td>
			<td >Corning</td>
			<td >46-031-CM</td>
			<td>NuMA Staining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >X100-500ML</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform</td>
			<td >WPI</td>
			<td>WP505210</td>
			<td>For microsurgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg</td>
			<td >WPI</td>
			<td>15911</td>
			<td>For microsurgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Visiopharm</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td>NuMA Staining Quantification Software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylasine 100mg/mL</td>
			<td >Akorn Pharma</td>
			<td >59399-111-50</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust discovery platform for the identification of novel mediators of melanoma metastasis

전이는 복잡한 과정으로, 세포가 시험관내 분석에 의해서만 불완전하게 모델링되는 장벽을 극복해야 합니다. 강력하고 재현 가능한 생체 내 모델과 흑색종 전이에서 새로운 선수를 식별하기위한 표준화 된 방법을 사용하여 체계적인 워크 플로우가 수립되었습니다. 이 접근법은 특정 실험 단계에서 데이터 추론을 허용하여 전이에서 유전자의 역할을 정확하게 특성화합니다. 모델은 마우스에 심장내, 피내 또는 피하 주사를 통해 유전자 변형 흑색종 세포를 도입한 다음, 일련의 생체내 영상으로 모니터링함으로써 확립된다. 일단 미리 확립된 종점에 도달하면, 원발성 종양 및/또는 전이-보유 장기가 다양한 분석을 위해 수확되고 처리된다. 종양 세포를 분류하고 단일 세포 RNA 시퀀싱을 포함한 여러 'omics'플랫폼 중 하나를 실시할 수 있습니다. 장기는 전이의 전반적인 부담을 정량화하고 특정 해부학 적 위치를지도화하기 위해 이미징 및 면역 조직 병리학 적 분석을 거칩니다. 생착, 모니터링, 조직 수확, 처리 및 분석을 위한 표준화된 프로토콜을 포함하는 이 최적화된 파이프라인은 환자 유도, 단기 배양 및 다양한 고형암 유형의 확립된 인간 및 뮤린 세포주에 채택될 수 있다.

다음 그림은 흑색종 전이의 새로운 동인을 식별하기 위해 설명 된 워크 플로가 어떻게 적용되었는지 보여줍니다. 도 2 는 생체내 흑색종 전이에서 푸코실트랜스퍼라제 FUT8을 침묵시키는 효과가 연구되었던 공개된 연구의 결과를 요약한 것이다(26). 간략하게, 인간 환자 글리코믹 데이터(렉틴 어레이에 의해 얻어짐) 및 전사 프로파일링의 분석은 1차 ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis at JoVE.com

A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

이 기사는 흑색종 전이의 새로운 후보 매개체와 그 작용 메커니즘을 테스트하는 데 사용되는 기술의 워크 플로우에 대해 설명합니다.

흑색종 전이의 새로운 중재자 식별을 위한 강력한 발견 플랫폼

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...

이 프로토콜은 흑색종 전이의 후보 조절자의 생체 내 효과를 평가하는 데 사용할 수있는 연속 워크 플로 내의 일련의 기술뿐만 아니라 다른 고형 악성 종양의 전이를 설명합니다. 우리의 체계적인 워크 플로우의 가장 큰 장점은 강력하고 표준화 된 생체 내 모델 및 기술로 인해 데이터의 재현성이 증가한다는 것입니다. 이 파이프라인은 생체 내 환경에서 Omics 데이터 또는 시험관내 분석으로부터 추론된 후보물질을 시험함으로써 표적 발견 및 치료 개발을 위한 경로를 제공한다.이 프로토콜에 제시된 기술과 관련된 학습 곡선은 제공된 자료를 사용하고 단계를 연습 할 때 자세한 설명을 수행함으로써 단축됩니다. 이 절차를 시연하는 데 도움이되는 것은 전임상 이미징 코어의 연구 과학자 인 Orlando Aristizabal과 내 실험실의 강사 인 Ran Moubarak입니다. 피내 주사의 경우, 무균 상태를 유지하면서 생물 안전 캐비닛 안에 여덟 ~ 10 주령의 마우스를 마취시키고 면도하십시오.그런 다음 바늘 찌르기의 궤적에 대해 피부를 뒤로 잡고 수축시키고 6 밀리미터 길이의 31 게이지 인슐린 주사기 바늘을 사용하여 베벨이 위쪽을 향하게하여 급성 각도로 피부를 부드럽게 뚫습니다. 돔 모양의 바퀴가 관찰 될 때까지 종양 세포 현탁액 30 마이크로 리터를 천천히 주입하십시오. 종양 성장, 체중 감소 및 전반적인 건강 상태의 진행을 모니터링합니다.이러한 모니터링 세션 중에 캘리퍼로 측정하고 종양의 길이와 너비 치수를 사용하여 부피를 계산하십시오. 심장 내 주사의 경우, 마취 된 마우스를 초음파 기계의 가열 된 플랫폼으로 옮깁니다. 그런 다음 저자 극성 테이프를 사용하여 마우스를 코 원뿔에 고정시킵니다.직선 면도날 또는 메스 블레이드로 흉부를 면도하고 30도 각도로 기울어 10 % 포비돈 요오드로 절차 영역 주위의 피부를 닦으십시오. 그 후, 마우스 좌측의 흉부 중앙에 초음파 프로브를 위치시켜 배향된 수평 창을 캡처하여 좌심실의 단면도를 얻었다. 프로브의 긴 축을 위쪽으로 향하게 하여 프로브를 50도 각도로 고정하고 가열된 플랫폼을 20도 각도로 고정한 다음 프로브와 지지 프레임을 제자리에 고정합니다.안전 캐비닛 내부에서 작업하는 동안 30 게이지 한 인치 바늘이있는 투베르쿨린 한 밀리리터 주사기에 세포 현탁액을 그립니다. 주사기에 존재하는 기포를 제거하십시오. 스테레오택틱 인젝터에 주사기를 잠급니다.그런 다음 초음파 지침에 따라 흉부를 통해 바늘을 심장의 좌심실로 밀어 넣고 종양 세포 현탁액 100 ~ 250 마이크로 리터를 천천히 주입하십시오. 단계적 생존 수술을 위해, 마취된 마우스를 워밍 패드에 올려놓고 10% 포비돈 요오드 용액으로 시술 부위 주위의 피부를 닦으십시오. 멸균 된 개인 보호 장비와 장갑을 착용 한 후 동물의 몸 위에 멸균 드레이프를 놓습니다.다음으로, 홍채 가위 또는 메스를 사용하여 피부를 절개하여 종양의 가장자리에서 다섯 ~ 일곱 밀리미터의 절제 마진을 유지합니다. 피내 종양의 경우 원주 피부와 함께 종양을 절제하십시오. 피하 종양의 경우 피부 아래의 종양을 해부하고 제거하십시오.종양 절제 후, 아홉 밀리미터 스테이플링 장치로 상처를 닫으십시오. 생체내 영상화를 위해, 한 밀리리터 인슐린 주사기와 28게이지 바늘로 복강내 주사하여 d-루시페린 기질을 마우스에 투여한 다음, 마우스를 마취시키고 생체발광 이미징 스캐너 내부의 코콘에 넣는다. 초기화를 눌러 계측기를 시작하고 노출 시간을 auto로 설정합니다.배경 빼기를 위해 빈 이미지를 캡처하려면 가져오기를 클릭하고 수집 순서가 완료된 후 이미지를 저장합니다. 데이터 분석 및 동일한 생체 내 이미징 소프트웨어의 경우 이미지가 저장된 폴더로 이동하여 한 실험에서 모든 마우스의 이미지를 엽니 다. 단위를 광도로 설정하고 그룹 간 신호 정규화를 방해하므로 개인을 나타내는 확인란이 선택되지 않았는지 확인하십시오.다음으로, 관심 영역 또는 ROI 그리기 도구를 사용하여 뇌 영역에 대한 원형 ROI를 그리고 신체에 대한 직사각형 ROI를 그리며 비특이적 휘도를 방출하는 경향이 있으므로 뇌 ROI의 귀와 코를 제외합니다. 바이어스를 최소화하려면 발광 신호가 겹쳐져 있지 않은 마우스 사진에 ROI를 그린 다음 ROI 측정을 선택하여 신호를 정량화하고 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다. 관심 있는 신체 영역에서 총 발광 플럭스를 플로팅하여 그룹 간의 차이를 분석합니다.소프트웨어를 이용한 NuMA 염색 후, 다른 장기 실질 및 빈 공간을 제외한 모든 NuMA 염색된 세포를 장기 조직 내에 포함하도록 ROI를 그립니다. NuMA 양성 및 NuMA 음성 세포를 분류하는 동시에 각 장기에 대해 적절한 양성 및 음성 대조군을 사용하도록 설정을 조정합니다. 확립된 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 각 샘플에 대한 NuMA 양성 세포의 총 백분율 수를 정량화합니다.생체발광, 밝은 장, 생체외 형광 및 헤마톡실린 및 에오신 염색 이미지는 흑색종 전이에 대한 후보 유전자의 분석을 위한 다각적 접근법을 예시한다. Fucosyltransferase 침묵은 흑색종 세포의 전이성 보급을 손상시켰다. 대조군 린다 바이러스에 감염된 흑색종 세포의 NuMA 염색된 폐 절편과 린다 바이러스를 발현하는 전이 억제인자가 여기에 제시되어 있다.전이성 흑색종 세포는 녹색으로 표시되고 장기 영역은 녹색 부화 선으로 구분됩니다. 피내 주사를 할 때 피부에 적절한 긴장을 유지하고, 주사기를 준비 할 때 공기 색전증을 피하고, 동물의 움직임을 방해하거나 상처 합병증을 유발해서는 안되는 적절한 절제 마진을 얻으면 성공률과 재현성을 향상시키는 데 도움이됩니다. 면역 여과를 검사하기 위한 멀티플렉스 이미징의 추가 고용, 유전자 발현 분석을 위한 단일 세포 RNA 시퀀싱 및 공간 전사체학은 모두 종양내 이질성을 검사할 수 있는 보완적인 방법을 제공할 수 있다.이 프로토콜에 설명 된 기술의 조합은 신경 염증을 억제하고 뇌 전이를 촉진하는 흑색종 분비 아밀로이드 베타의 역할과 같은 흑색종 뇌 전이에서 새로운 조절자를 식별하는 데 도움이되었습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

고급 동물의 간에서 대장 전이의 모델 : 이미징 기술 및 전이성 클론의 특성

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

연구

암 연구학

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

새로 형성 된 유방암 줄기 세포와 같은 세포 Apoptosis 반전 후 흐름 Cytometric 감지

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

하류 분자 분석 및 전이성 전위 평가를 위한 순환 종양 세포의 미세 조작

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice

면역결핍 마우스에서 간 직교 인간 편도 흑색종 Xenograft 플랫폼의 생성

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

종양-기질 상호 작용 및 약물 발견을 연구하기 위한 새로운 기질 섬유아세포 변조 3D 종양 스페로이드 모델

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Perfused 마이크로 유체 플랫폼에서 환자 유래 제노이식의 Ex vivo 3D 하이드로겔 배양에 대한 향상된 생존력

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

원발성 뼈 종양 및 뼈에 이식된 고형 종양을 통한 뼈 전이 모델링

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

간 전이 스트로마를 연구하기 위해 대장암 오가노이드의 포털 정맥 주사

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...