Name: a robust discovery platform for the identification of novel mediators of melanoma metastasis
Uploaded: 2022-03-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis at JoVE.com

Agradecemos a la División de Tecnologías de Investigación Avanzada (DART) de NYU Langone Health, y en particular, al Laboratorio de Investigación de Patología Experimental, el Centro de Tecnología del Genoma, el Laboratorio de Citometría y Clasificación Celular, el Núcleo de Imágenes Preclínicas, que cuentan con el apoyo parcial de la Subvención de Apoyo del Centro de Cáncer Perlmutter NIH / NCI 5P30CA016087. Agradecemos al NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) por proporcionar acceso a cultivos a corto plazo de melanoma derivado de pacientes + (10-230BM y 12-273BM), que se obtuvieron a través de protocolos aprobados por IRB (estudio de consentimiento universal #s16-00122 y estudio del Grupo Cooperativo interdisciplinario de melanoma # 10362). Agradecemos al Dr. Robert Kerbel (Universidad de Toronto) por proporcionar líneas celulares de melanoma 113/6-4L y 131/4-5B1* y al Dr. Meenhard Herlyn (Instituto Wistar) por proporcionar cultivos a corto plazo de melanoma WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2*. E.H. cuenta con el apoyo de NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, un Premio científico del equipo de la American Cancer Society-Melanoma Research Alliance y una ESPORA de melanoma de los NIH (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). La figura 1 se creó con Biorender.com.

NOTA: Los procedimientos de animales involucrados en el siguiente protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Nueva York (IACUC). Todos los procedimientos se llevan a cabo en instalaciones aprobadas por la Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). La Figura 1 muestra el enfoque experimental general.
1. Cultivos a corto plazo de melanoma derivado...

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	<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Cancer+Statistics+2020:+GLOBOCAN+Estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries.">Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li><li>Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+pathways+in+patients+with+cutaneous+melanoma.">Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).</li><li>Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cutaneous+melanoma;+a+review+of+NRAS+and+BRAF+mutation+frequencies+in+relation+to+histogenetic+subclass+and+body+site.">Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site.</a> Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).</li><li>Alonso, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+study+in+melanoma+identifies+epithelial-mesenchymal+transition+as+a+major+determinant+of+metastasis.">A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis.</a> Cancer Research. 67 (7), 3450-3460 (2007).</li><li>Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+biological+determinants+of+melanoma+progression:+Should+all+be+considered+for+clinical+management.">Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management.</a> Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).</li><li>Plebanek, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-metastatic+cancer+exosomes+induce+immune+surveillance+by+patrolling+monocytes+at+the+metastatic+niche.">Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche.</a> Nature Communications. 8 (1), 1319 (2017).</li><li>Orgaz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+pigment+epithelium-derived+factor+enables+migration,+invasion+and+metastatic+spread+of+human+melanoma.">Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma.</a> Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).</li><li>Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pigment+epithelium-derived+factor+blocks+tumor+extravasation+by+suppressing+amoeboid+morphology+and+mesenchymal+proteolysis.">Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis.</a> Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).</li><li>Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+melanoma+cell-stroma+interaction+in+cell+motility,+invasion,+and+metastasis.">The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis.</a> Frontiers in Medicine - Dermatology. 5, 307 (2018).</li><li>Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+CC+chemokine+receptor-7+and+regional+lymph+node+metastasis+of+B16+murine+melanoma.">Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma.</a> Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+pathways+and+time+courses+in+the+orderly+progression+of+cutaneous+melanoma.">Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma.</a> British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).</li><li>Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+metastasis:+melanoma+and+other+cancers.">Genetics of metastasis: melanoma and other cancers.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).</li><li>Ubellacker, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymph+protects+metastasizing+melanoma+cells+from+ferroptosis.">Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis.</a> Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taking+cell-matrix+adhesions+to+the+third+dimension.">Taking cell-matrix adhesions to the third dimension.</a> Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).</li><li>Cunningham, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+protein+requirement+for+cortical+stability+and+efficient+locomotion.">Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion.</a> Science. 255 (5042), 325-327 (1992).</li><li>Unger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+carcinomas:+physiologically+relevant+3D+models+to+improve+anti-cancer+drug+development.">Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).</li><li>Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heralding+a+new+paradigm+in+3D+tumor+modeling.">Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling.</a> Biomaterials. 108, 197-213 (2016).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+mouse+melanoma+cell+lines+by+their+mortal+malignancy+using+an+experimental+metastatic+model.">Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model.</a> Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).</li><li>Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+YUMM+lines:+a+series+of+congenic+mouse+melanoma+cell+lines+with+defined+genetic+alterations.">The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).</li><li>Koya, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+inhibitor+vemurafenib+improves+the+antitumor+activity+of+adoptive+cell+immunotherapy.">BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy.</a> Cancer Research. 72 (16), 3928-3937 (2012).</li><li>Jenkins, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+murine+BRaf(V600E)+melanoma+cell+lines+with+sensitivity+to+PLX4032.">Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).</li><li>Tuncer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD+signaling+promotes+melanoma+metastasis+independently+of+phenotype+switching.">SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).</li><li>Schwartz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incipient+Melanoma+Brain+Metastases+Instigate+Astrogliosis+and+Neuroinflammation.">Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation.</a> Cancer Research. 76 (15), 4359-4371 (2016).</li><li>Perez-Guijarro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodel+preclinical+platform+predicts+clinical+response+of+melanoma+to+immunotherapy.">Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy.</a> Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).</li><li>Krepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comprehensive+Patient-Derived+Xenograft+Collection+Representing+the+Heterogeneity+of+Melanoma.">A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma.</a> Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).</li><li>Agrawal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systems+biology+approach+identifies+FUT8+as+a+driver+of+melanoma+metastasis.">A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis.</a> Cell. 31 (6), 804-819 (2017).</li><li>Hanniford, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+CDR1as+drives+IGF2BP3-mediated+melanoma+invasion+and+metastasis.">Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis.</a> Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).</li><li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT5+control+of+cGAS/STING+and+NLRC5+pathways+defines+melanoma+response+to+antitumor+immunity.">PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity.</a> Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).</li><li>de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+five+new+melanoma+low+passage+cell+lines+representing+the+clinical+and+genetic+profile+of+their+tumors+of+origin.">Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).</li><li>Morsi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+clinically+relevant+mouse+model+of+melanoma+brain+metastasis.">Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).</li><li>Huynh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vivo+microRNA+targeting+of+liver+metastasis.">Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis.</a> Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).</li><li>Zou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+variables+that+affect+human+hepatocyte+AAV+transduction+in+liver+chimeric+mice.">Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice.</a> Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).</li><li>Kleffman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma-secreted+Amyloid+Beta+Suppresses+Neuroinflammation+and+Promotes+Brain+Metastasis.">Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis.</a> bioRxiv. , 854885 (2019).</li><li>Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+variations+of+skin+pigmentation+in+C57BL/6+mice+affect+optical+bioluminescence+quantitation.">Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation.</a> Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).</li><li>Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+than+skin+deep:+autophagy+is+vital+for+skin+barrier+function.">More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1376 (2018).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+CRISPR+screen+in+a+mouse+model+of+tumor+growth+and+metastasis.">Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis.</a> Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).</li><li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+CRISPR+screens+reveal+fitness+genes+and+genotype-specific+cancer+liabilities.">High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities.</a> Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+essential+genes+in+the+human+genome.">Identification and characterization of essential genes in the human genome.</a> Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).</li><li>Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+Omnibus:+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository.">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).</li><li>Lappalainen, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+European+Genome-phenome+Archive+of+human+data+consented+for+biomedical+research.">The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research.</a> Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).</li><li>Cerami, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cBio+cancer+genomics+portal:+an+open+platform+for+exploring+multidimensional+cancer+genomics+data.">The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data.</a> Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).</li><li>Grossman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+shared+vision+for+cancer+genomic+data.">Toward a shared vision for cancer genomic data.</a> New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).</li></ol>

El objetivo de este informe técnico es ofrecer un flujo de trabajo estandarizado de arriba a abajo para la investigación de actores potenciales en la metástasis del melanoma. Como los experimentos in vivo pueden ser costosos y llevar mucho tiempo, las estrategias para maximizar la eficiencia y aumentar el valor de la información obtenida son primordiales.
Es imperativo utilizar enfoques complementarios para validar los hallazgos dentro del mismo experimento. Por ejemplo, tanto la ...

La alta mortalidad asociada con el melanoma metastásico combinada con una incidencia creciente de melanoma en todo el mundo1 (un aumento estimado del 7,86% para 2025) requiere nuevos enfoques de tratamiento. Los avances en el descubrimiento de objetivos dependen de modelos reproducibles de metástasis, un proceso altamente complejo. A lo largo de los pasos de la cascada metastásica, las células de melanoma deben superar innumerables barreras para lograr la evasión del sistema inmune y la colonización de tejidos distantes2. La resiliencia y adaptabilidad de las células de melanoma surgen de multitud de factores, entre ellos su elevada carga mutacional genética3 y su origen en la cresta neural, que confieren una plasticidad fenotípica crucial 3,4,5. En cada paso, los programas transcripcionales permiten que las células de melanoma en metástasis cambien de un estado a otro en función de las señales de la diafonía con el microambiente, que comprende el sistema inmune6, el medio extracelular 7,8 y la arquitectura celular de las barreras físicas9 con las que entran en contacto. Por ejemplo, las células de melanoma escapan a la vigilancia inmune al regular a la baja la expresión de importantes factores secretos por tumores inmunocebadores6.
Los estudios describen un "nicho premetastático", en el que las células de melanoma secretan quimiocinas y citoquinas para preparar el órgano "objetivo" distante para la metástasis10. Estos hallazgos plantean preguntas importantes sobre el tropismo de los órganos de las células de melanoma metastásico y la ruta anatómica que toman para acceder a tejidos distantes. Después de la intravasación, se sabe que las células de melanoma hacen metástasis a través de los linfáticos (diseminación linfática) y los vasos sanguíneos (diseminación hematógena)2,11. Si bien la mayoría de los pacientes presentan enfermedad localizada, un pequeño subconjunto de casos se presenta con enfermedad metastásica a distancia y sin diseminación linfática (afectación negativa de los ganglios linfáticos)11, lo que sugiere la existencia de vías metastásicas alternativas para el melanoma.
Cuando colonizan un sitio metastásico, las células de melanoma experimentan adaptaciones epigenéticas y metabólicas12,13. Para acceder e invadir nuevos compartimentos, las células de melanoma emplean proteasas14 y modificaciones citoesqueléticas 11,15, que les permiten atravesar y crecer en su nueva ubicación. La dificultad para atacar las células de melanoma reside en la complejidad y el número de tales adaptaciones; por lo tanto, el campo debe hacer esfuerzos para recrear experimentalmente tantos pasos y adaptaciones como sea posible. A pesar de los numerosos avances en ensayos in vitro como organoides y cultivos 3D16,17, estos modelos solo recapitulan incompletamente la cascada metastásica in vivo.
Los modelos murinos han demostrado valor al lograr un equilibrio entre la reproducibilidad, la viabilidad técnica y la simulación de enfermedades humanas. Las células de melanoma implantadas intravascular, ortotópica y heterotópicamente a partir de xenoinjertos derivados del paciente o cultivos a corto plazo en ratones inmunocomprometidos o humanizados representan la columna vertebral del descubrimiento de dianas en el melanoma metastásico. Sin embargo, estos sistemas a menudo carecen de una restricción biológica crucial en la metástasis: el sistema inmunológico. Los modelos de metástasis de melanoma singénico que poseen esta restricción son relativamente escasos en el campo. Estos sistemas, desarrollados en ratones inmunocompetentes, incluyendo B16-F1018, la familia YUMM de líneascelulares 19, SM120, D4M321, RIM322 o más recientemente, las líneas celulares de melanoma RMS23 y M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 , facilitan la investigación del complejo papel de la respuesta inmune del huésped en la progresión del melanoma.
Aquí, se presenta una tubería para la identificación del objetivo de metástasis de melanoma. Con el aumento y la generación de conjuntos de datos ómicos a partir de cohortes de pacientes con melanoma, postulamos que los estudios que tienen la promesa más clínica son los que se derivan de la integración de big data, lo que lleva a un meticuloso interrogatorio funcional y mecanicista 25,26,27,28. Mediante el uso de modelos de ratón para estudiar objetivos potenciales en el proceso metastásico, se pueden tener en cuenta los eventos específicos in vivo y las interacciones tisulares, lo que aumenta la probabilidad de traducción clínica. Se describen múltiples métodos para cuantificar la carga metastásica, proporcionando datos complementarios sobre los resultados de cualquier experimento dado. Se describe un protocolo para el aislamiento unicelular de tumores en varios órganos para ayudar a la caracterización imparcial de la expresión génica en células metastásicas, que puede preceder a la secuenciación de ARN unicelular o a granel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >#15 Scapel Blade&#160;</td>
			<td >WPI</td>
			<td >500242</td>
			<td >For surgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >#3 Scapel Handle</td>
			<td >WPI</td>
			<td >500236</td>
			<td>For surgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >1 mL Tuberculin syringe, slip tip&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >309626</td>
			<td>Injections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10 mL syringe, slip tip&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >301029</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >10% Formalin Sodium Buffered</td>
			<td >EK Industries</td>
			<td >4499-20L</td>
			<td>For perfusion/tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 mL Conical</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td>430052</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td>352196</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 Proof Ethanol</td>
			<td >Deacon Labs</td>
			<td >04-355-223</td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22G &#8211; 22mm needle</td>
			<td >BD</td>
			<td >305156</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4-0 Vicryl Suture</td>
			<td >Ethicon</td>
			<td >J464G</td>
			<td>Suture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4% Carson&#39;s phosphate buffered paraformaldehyde&#160;</td>
			<td >EMS</td>
			<td >15733-10</td>
			<td>For perfusion/tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >40&#181;m</td>
			<td >Corning</td>
			<td >431750</td>
			<td>Tissue processing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-0 Absorbable Suture&#160;</td>
			<td >Ethicon</td>
			<td >6542000</td>
			<td>Closure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 mL Conical&#160;</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >430828</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >7-0 Silk suture&#160;</td>
			<td >FST</td>
			<td >18020-70</td>
			<td>Ligature</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70&#181;m</td>
			<td >Corning</td>
			<td >431751</td>
			<td>Tissue processing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-fade mounting media&#160;&#160;</td>
			<td >Vector Labs</td>
			<td >H-1000-10</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Approximator applying Forceps, 10cm&#160;</td>
			<td >WPI</td>
			<td>14189</td>
			<td>For microsurgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Avance</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >3 HD</td>
			<td>NMR Console&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Biospec 7030&#160;</td>
			<td >Bruker</td>
			<td >7030</td>
			<td>Micro MRI</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BSA</td>
			<td >Bioreg</td>
			<td >A941</td>
			<td>NuMA Staining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm&#160;</td>
			<td >WPI</td>
			<td>WP5025501</td>
			<td>For microsurgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coplin Staining Jar</td>
			<td >Bel-Art&#160;</td>
			<td >F44208-1000</td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542-1MG</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >dCas9-KRAB</td>
			<td >Addgene</td>
			<td >110820</td>
			<td>Genetic manipulation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >NEB</td>
			<td >M0303L</td>
			<td>Tissue processing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DPBS</td>
			<td >Corning</td>
			<td >21-030-CM</td>
			<td>Tissue processing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade</td>
			<td >GEM</td>
			<td >62-0167</td>
			<td>Tissue processing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Extracellular Matrix Substrate&#160;</td>
			<td >Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FBS</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fiji Image J</td>
			<td >Fiji Image J</td>
			<td >Software</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer&#160;</td>
			<td >Thermo Fisher</td>
			<td >A16104</td>
			<td>NuMA Staining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat Serum</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >PCN5000</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HBSS</td>
			<td >Corning</td>
			<td >21-020-CV</td>
			<td>Tissue processing</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Hematoxylin&#160;</td>
			<td>Richard-Allan Scientific&#160;</td>
			<td >7231</td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Illumina III&#160;</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>BLI Instrument</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulin syringe 28G - 8mm needle</td>
			<td >BD</td>
			<td >329424</td>
			<td>Injections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulin syringe 31G - 6mm needle&#160;</td>
			<td >BD</td>
			<td >326730</td>
			<td>Injections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated</td>
			<td >WPI</td>
			<td >504478</td>
			<td>For perfusion and surgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isoflurane USP</td>
			<td >Covetrus</td>
			<td >11695067772</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip</td>
			<td >WPI</td>
			<td>WP6570</td>
			<td>For microsurgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ketamine HCl 100mg/mL</td>
			<td >Mylan Ind.</td>
			<td >1049007</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >lentiCRISPRv2</td>
			<td >Addgene</td>
			<td>98290</td>
			<td>Genetic manipulation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649</td>
			<td >Invitrogen</td>
			<td>L32472</td>
			<td>Vascular endothelial cells marker</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM non-essential amino acids X 100</td>
			<td >Corning</td>
			<td>25-025-CI</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Metzenbaum Scissors</td>
			<td >WPI</td>
			<td >503269</td>
			<td>For surgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microinjection Unit</td>
			<td >KOPF</td>
			<td >5000</td>
			<td>Intracardiac injections</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NaCl</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>S25877&#160;</td>
			<td>NuMA Staining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle 30G x 25mm</td>
			<td >BD</td>
			<td>305128</td>
			<td>Intracardiac Injection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle 33G x 15mm</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>7747-01</td>
			<td>Intracarotid Injection</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws</td>
			<td >WPI</td>
			<td>14137-G</td>
			<td>For microsurgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td >005557</td>
			<td>Murine model</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NU/J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td >002019</td>
			<td>Murine model</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human&#160;</td>
			<td >Abcam</td>
			<td >97585</td>
			<td>NuMA Staining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin-Streptomycin 10000U/mL</td>
			<td >Gibco</td>
			<td >15140122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Percoll</td>
			<td >GE</td>
			<td >0891-01</td>
			<td>density separation solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PI Classic Surgical Gloves</td>
			<td >Cardinal Health</td>
			<td >2D72PT75X</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pLKO Tet-On</td>
			<td >Addgene</td>
			<td >21915</td>
			<td>Genetic manipulation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Povidone-Iodine 10% Solution</td>
			<td >Medline</td>
			<td >MDS093943</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Proparacaine Drops 0.5%</td>
			<td >Akorn Pharma</td>
			<td>AX0501</td>
			<td>Opthalmic local anesthetic</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment</td>
			<td >Dechra</td>
			<td >83592</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Razor Blade Double Edge Blades&#160;</td>
			<td >EMS</td>
			<td >72000</td>
			<td>Shaving and Vibrotome Brain Slicing&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reflex 9mm EZ Clip&#160;</td>
			<td >Braintree</td>
			<td>EZC-&#160;KIT</td>
			<td>Wound closure</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640&#160;</td>
			<td >Corning</td>
			<td >10-040-CM</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades</td>
			<td >WPI</td>
			<td>501235</td>
			<td>For microsurgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome</td>
			<td >Leica</td>
			<td >VT1200</td>
			<td>Brain Slice Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Channel Anesthesia Vaporizer System</td>
			<td >Kent Scientific</td>
			<td >VetFlo-1210S&#160;</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower</td>
			<td >EZ Systems</td>
			<td >TT4000</td>
			<td>CO2 Euthanasia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile Fenestrated Disposable Drape</td>
			<td >Medline</td>
			<td >NON21002</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves</td>
			<td >Medline</td>
			<td >DYNJP2715</td>
			<td>Surgery</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T25 Flask</td>
			<td >Corning&#160;</td>
			<td >430639</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tris</td>
			<td >Corning</td>
			<td >46-031-CM</td>
			<td>NuMA Staining</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Triton X-100</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >X100-500ML</td>
			<td>Immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform</td>
			<td >WPI</td>
			<td>WP505210</td>
			<td>For microsurgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg</td>
			<td >WPI</td>
			<td>15911</td>
			<td>For microsurgical procedures</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Visiopharm</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td>Visiopharm</td>
			<td>NuMA Staining Quantification Software</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylasine 100mg/mL</td>
			<td >Akorn Pharma</td>
			<td >59399-111-50</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Xylene</td>
			<td >Fisher</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td>Histology</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a robust discovery platform for the identification of novel mediators of melanoma metastasis

La metástasis es un proceso complejo que requiere que las células superen barreras que solo se modelan de manera incompleta mediante ensayos in vitro . Se estableció un flujo de trabajo sistemático utilizando modelos in vivo robustos y reproducibles y métodos estandarizados para identificar nuevos actores en la metástasis del melanoma. Este enfoque permite la inferencia de datos en etapas experimentales específicas para caracterizar con precisión el papel de un gen en la metástasis. Los modelos se establecen mediante la introducción de células de melanoma modificadas genéticamente a través de inyecciones intracardíacas, intradérmicas o subcutáneas en ratones, seguidas de monitoreo con imágenes seriales in vivo . Una vez que se alcanzan los criterios de valoración preestablecidos, los tumores primarios y / o los órganos portadores de metástasis se extraen y procesan para diversos análisis. Las células tumorales se pueden clasificar y someter a cualquiera de varias plataformas "ómicas", incluida la secuenciación de ARN unicelular. Los órganos se someten a análisis de imagen e inmunohistopatológicos para cuantificar la carga general de metástasis y mapear su ubicación anatómica específica. Esta tubería optimizada, que incluye protocolos estandarizados para el injerto, monitoreo, recolección de tejidos, procesamiento y análisis, se puede adoptar para cultivos a corto plazo derivados de pacientes y líneas celulares humanas y murinas establecidas de varios tipos de cáncer sólido.

Las siguientes figuras ilustran cómo se ha aplicado el flujo de trabajo descrito para la identificación de nuevos impulsores de la metástasis del melanoma. La Figura 2 resume los resultados de un estudio publicado en el que se estudiaron los efectos del silenciamiento de la fucosiltransferasa FUT8 en metástasis de melanoma in vivo 26. Brevemente, el análisis de los datos glucómicos del paciente humano (obtenidos por matrices de lectinas) y el perfil tra...

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A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

Este artículo describe un flujo de trabajo de técnicas empleadas para probar nuevos mediadores candidatos de metástasis de melanoma y sus mecanismos de acción.

Una plataforma de descubrimiento robusta para la identificación de nuevos mediadores de la metástasis del melanoma

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...

Este protocolo describe una serie de técnicas dentro de un flujo de trabajo continuo que pueden utilizarse para evaluar los efectos in vivo de los candidatos reguladores de la metástasis del melanoma, pero también de la metástasis de otras neoplasias malignas sólidas. La principal ventaja de nuestro flujo de trabajo sistemático es una mayor reproducibilidad de los datos debido a modelos y técnicas in vivo robustos y estandarizados. Esta tubería ofrece una vía para el descubrimiento de objetivos y el desarrollo de terapias mediante la prueba de candidatos inferidos a partir de datos ómicos o ensayos in vitro en un entorno in vivo.La curva de aprendizaje asociada a las técnicas presentadas en este protocolo se acorta utilizando los materiales proporcionados y siguiendo la descripción detallada al practicar los pasos. Ayudando a demostrar el procedimiento estará Orlando Aristizabal, un científico investigador en The Preclinical Imaging Core y Ran Moubarak, un instructor en mi laboratorio. Para inyecciones intradérmicas, anestesia y afeita a un ratón de ocho a 10 semanas de edad dentro de un gabinete de bioseguridad mientras mantiene condiciones asépticas.Luego agarre y retraiga la piel hacia atrás contra la trayectoria de la puñalada de la aguja y, con una aguja de jeringa de insulina de calibre 31 de seis milímetros de largo, perfore suavemente la piel en un ángulo agudo con el bisel hacia arriba. Inyecte 30 microlitros de la suspensión de células tumorales lentamente, hasta que se observe una rueda en forma de cúpula. Controle la progresión del crecimiento del tumor, la pérdida de peso y el estado de salud general.Durante estas sesiones de monitoreo, tome medidas con pinzas y use las dimensiones de longitud y anchura del tumor para calcular el volumen. Para inyecciones intracardíacas, transfiera un ratón anestesiado a la plataforma calentada de la máquina de ultrasonido. Luego, con cinta hipoalergénica, asegure el mouse al cono de la nariz.Afeitar el tórax con una cuchilla de afeitar recta o una hoja de bisturí, inclinada en un ángulo de 30 grados y limpiar la piel alrededor del área del procedimiento con 10% de povidona yodada. Luego, coloque la sonda de ultrasonido en el centro del tórax en el lado izquierdo del mouse para capturar una ventana horizontal orientada a obtener una vista transversal del ventrículo izquierdo. Con el eje largo de la sonda mirando hacia arriba, fije la sonda en un ángulo de 50 grados y la plataforma calentada en un ángulo de 20 grados, luego bloquee la sonda y el marco de soporte en la posición.Mientras trabaja dentro del gabinete de seguridad, extraiga la suspensión celular en una jeringa de tuberculina de un mililitro con una aguja de una pulgada de calibre 30. Retire las burbujas de aire presentes en la jeringa. Bloquee la jeringa en el inyector estereotáctico.Y luego, bajo guía de ultrasonido, avance la aguja a través de la pared torácica hacia el ventrículo izquierdo del corazón e inyecte de 100 a 250 microlitros de la suspensión de células tumorales lentamente. Para la cirugía de supervivencia por etapas, coloque el ratón anestesiado en la almohadilla de calentamiento y limpie la piel alrededor del área del procedimiento con una solución de yodo de povidona al 10%. Después de ponerse equipos estériles de protección personal y guantes, coloque una cortina estéril sobre el cuerpo del animal.A continuación, con tijeras Iris o un bisturí, incise la piel, manteniendo un margen de resección de cinco a siete milímetros desde el borde del tumor. En caso de tumores intradérmicos, reseque el tumor junto con la piel circunferencial. Para los tumores subcutáneos, diseccionar y extirpar el tumor debajo de la piel.Después de la resección del tumor, cierre la herida con un dispositivo de grapado de nueve milímetros. Para imágenes in vivo, administre sustrato de d-luciferina al ratón mediante inyección intraperitoneal con una jeringa de insulina de un mililitro y una aguja de calibre 28, luego anestesia al ratón y colóquelo en un cono nasal dentro del escáner de imágenes de bioluminiscencia. Inicie el instrumento presionando inicializar y establezca el tiempo de exposición en automático.Para capturar una imagen en blanco para la resta de fondo, haga clic en adquirir y guarde la imagen una vez completada la secuencia de adquisición. Para el análisis de datos y el mismo software de imágenes in vivo, navegue a la carpeta donde se guardan las imágenes y abra las imágenes de todos los ratones de un experimento. Configure las unidades a radiancia y asegúrese de que la casilla de verificación que indica individuo no esté marcada, ya que esto impedirá la normalización de la señal entre grupos.A continuación, utilizando la herramienta de dibujo de región de interés o ROI, dibuje ROI circulares para la región del cerebro y ROI rectangulares para el cuerpo, excluya las orejas y la nariz en el ROI del cerebro, ya que tienden a emitir luminancia inespecífica. Para minimizar el sesgo, dibuje rois en las fotografías de los ratones sin la señal luminiscente superpuesta, luego seleccione medir el ROI para cuantificar la señal y exportar los datos a una hoja de cálculo. Analizar las diferencias entre grupos trazando el flujo luminiscente total en las regiones corporales de interés.Después de una tinción de NuMA con software, dibuje un ROI para incluir todas las células teñidas de NuMA dentro del tejido del órgano, excepto otros parénquimas de órganos y espacios vacíos. Ajuste la configuración para categorizar las células NuMA positivas y NuMA negativas mientras usa los controles positivos y negativos apropiados para cada órgano. Utilice un algoritmo de software establecido para cuantificar el número total de porcentaje de células NuMA positivas para cada muestra.La bioluminiscencia, el campo brillante, la fluorescencia ex vivo y las imágenes de tinción de hematoxilina y eosina ilustran el enfoque múltiple para el análisis de los efectos de los genes candidatos en la metástasis del melanoma. El silenciamiento de la fucosiltransferasa perjudicó la diseminación metastásica de las células de melanoma. Las secciones pulmonares teñidas de NuMA de células de melanoma infectadas con el virus Linda de control y con un supresor de metástasis que expresa el virus Linda se muestran aquí.Las células de melanoma metastásico están marcadas de verde y el área del órgano está delimitada por una línea verde eclosionada. Mantener una tensión adecuada en la piel al realizar inyecciones intradérmicas, evitar la embolia aérea al preparar jeringas y obtener márgenes de resección adecuados que no interfieran con la locomoción del animal ni predispongan a complicaciones de la herida, ayudan a mejorar la tasa de éxito y la reproducibilidad. El empleo adicional de imágenes multiplex para examinar la filtración inmune, la secuenciación de ARN de una sola célula para el análisis de expresión génica y la transcriptómica espacial podrían proporcionar vías complementarias para examinar la heterogeneidad intratumoral.La combinación de técnicas descritas en este protocolo nos ayudó a identificar nuevos reguladores en la metástasis cerebral del melanoma, como el papel del melanoma beta amiloide secretado en la supresión de la neuroinflamación y la promoción de la metástasis cerebral.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Avanzada modelo animal de colorrectal metástasis en hígado: Técnicas de imagen y propiedades metastásicas de los clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Detección del flujo Cytometric recién formado cáncer similares a células madre de células de mama después de la revocación de la Apoptosis

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Micromanipulation of Circulating Tumor Cells for Downstream Molecular Analysis and Metastatic Potential Assessment

Micromanipulación de células tumorales circulantes para análisis molecular descendente y evaluación potencial metastásica

Blood-borne metastasis accounts for&#160;most cancer-related deaths and involves circulating tumor cells (CTCs) that are successful in establishing new ...

Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice

Generación de una plataforma de xenoinjerto de melanoma uveal humano ortotópico hepático en ratones inmunodeficientes

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Un novedoso modelo de esferoides de tumor 3D modulado por fibroblastos para el estudio de la interacción tumor-Stroma y el descubrimiento de fármacos

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Viabilidad mejorada para cultivos de hidrogel 3D Ex vivo de xenoinjertos derivados del paciente en una plataforma microfluídica perfundida

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Análisis patológico de metástasis pulmonares después de la inyección lateral de células tumorales en la vena de la cola

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Modeling Primary Bone Tumors and Bone Metastasis with Solid Tumor Graft Implantation into Bone

Modelado de tumores óseos primarios y metástasis óseas con implantación de injerto de tumor sólido en hueso

Primary bone tumors or bone metastasis from solid tumors result in painful osteolytic, osteoblastic, or mixed osteolytic/osteoblastic lesions. These ...

Modeling Brain Metastasis Via Tail-Vein Injection of Inflammatory Breast Cancer Cells

Modelado de metástasis cerebral mediante inyección en la vena de cola de células inflamatorias de cáncer de mama

Metastatic spread to the brain is a common and devastating manifestation of many types of cancer. In the United States alone, about 200,000 patients are ...

Portal Vein Injection of Colorectal Cancer Organoids to Study the Liver Metastasis Stroma

Inyección en la vena porta de organoides de cáncer colorrectal para estudiar la metástasis hepática del estroma

Hepatic metastasis of colorectal cancer (CRC) is a leading cause of cancer-related death. Cancer-associated fibroblasts (CAFs), a major component of the ...