Name: investigating cardiac metabolism in the isolated perfused mouse heart with hyperpolarized [1-13c]pyruvate and 13c/31p nmr spectroscopy
Uploaded: 2023-04-21T12:00:00
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Dieses Projekt wurde von der Israel Science Foundation im Rahmen der Fördervereinbarung Nr. 1379/18 finanziert; das Jabotinsky-Stipendium des israelischen Ministeriums für Wissenschaft und Technologie für angewandte und ingenieurwissenschaftliche Wissenschaften für direkte Doktoranden Nr. 3-15892 für D.S.; und das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 858149 (AlternativesToGd).

Die gemeinsame Ethikkommission (IACUC) der Hebräischen Universität und des Hadassah Medical Center hat das Studienprotokoll für den Tierschutz (MD-19-15827-1) genehmigt.
1. Krebs-Henseleit-Pufferpräparation
<ol><li>Bereiten Sie einen Tag vor dem Experiment eine modifizierte Version des Krebs-Henseleit-Puffers (KHB) vor26. Zunächst werden 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM Pyruvat, 1,2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3 und 1,2 mM KH2 ...

Wir demonstrieren einen experimentellen Aufbau, der darauf ausgelegt ist, den hyperpolarisierten [1-13C]Pyruvatstoffwechsel, die Gewebeenergetik und den pH-Wert in einem isolierten Mausherzmodell zu untersuchen.
Die kritischen Schritte innerhalb des Protokolls sind wie folgt: 1) Sicherstellen, dass der pH-Wert des Puffers 7,4 beträgt; 2) Sicherstellung, dass alle Komponenten des Puffers enthalten sind; 3) Vermeidung der Blutgerinnung in den Herzgefäßen durch Heparin-Injektionen; ...

Veränderungen des Herzstoffwechsels sind mit einer Vielzahl von Kardiomyopathien assoziiert und bilden häufig die Grundlage für die zugrunde liegenden pathophysiologischen Mechanismen1. Es gibt jedoch zahlreiche Hindernisse bei der Untersuchung des Stoffwechsels in lebenden Geweben, da die meisten biochemischen Assays die Homogenisierung des Gewebes und die Zelllyse und/oder die radioaktive Rückverfolgung erfordern. Daher besteht ein dringender Bedarf an neuen Werkzeugen zur Untersuchung des Myokardstoffwechsels in lebenden Geweben. Die Magnetresonanz (MR) von hyperpolarisierten 13C-markierten Substraten ermöglicht Echtzeitmessungen des Stoffwechsels in lebenden Geweben2 ohne den Einsatz ionisierender Strahlung, indem das MR-Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) der markierten Stelle(n) um mehrere Größenordnungenerhöht wird 3. Hier beschreiben wir einen Versuchsaufbau, einen Erfassungsansatz und einen analytischen Ansatz zur Untersuchung des schnellen Stoffwechsels im isolierten Mausherz und präsentieren parallel dazu Indikatoren für die allgemeine Gewebeenergetik und den Säuregehalt. Der pH-Wert des Herzens ist ein wertvoller Indikator, da das Säure-Basen-Gleichgewicht in den frühen Stadien von Herzerkrankungen und Zuständen wie Myokardischämie, maladaptiver Hypertrophie und Herzinsuffizienz gestört ist6.
Die hyperpolarisierte Produktion von [1-13 C]lactat und [13 C]Bicarbonat aus hyperpolarisiertem [1-13C]pyruvat hilft bei der Bestimmung der Produktionsraten von Laktatdehydrogenase (LDH) und Pyruvatdehydrogenase (PDH). Die meisten der früheren Studien, die unter Verwendung hyperpolarisierter Substrate im isolierten Nagetierherz durchgeführt wurden, verwendeten entweder komplexe kinetische Modelle, um die enzymatische Aktivität von LDH und PDH abzuleiten, oder berichteten über die Signalintensitätsverhältnisse des hyperpolarisierten Produkts zu einem Substrat, ohne die tatsächlichen Enzymaktivitätsraten zu berechnen 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Hier haben wir den produktselektiven Sättigungsanregungsansatz 15 verwendet, der es ermöglicht, die Enzymaktivität modellfrei zu überwachen15,16. Auf diese Weise wurden die absoluten enzymatischen Raten (d.h. die Anzahl der Mol des pro Zeiteinheit produzierten Produkts) bestimmt. 31 Die P-Spektroskopie wurde verwendet, um die Signale von anorganischem Phosphat (Pi), Phosphokreatin (PCr) und Adenosintriphosphat (ATP) zu beobachten. Eine multiparametrische Analyse wurde verwendet, um die pH-Verteilung des Herzens zu charakterisieren, wie die heterogene chemische Verschiebung des Pi-Signals des Gewebes zeigt.
Das retrograd durchblutete Mausherz (Langendorff-Herz)17,18,19 ist ein Ex-vivo-Modell für das intakt schlagende Herz. In diesem Modell bleiben die Lebensfähigkeit des Herzens und der pH-Wert für mindestens 80 Minutenerhalten 20 und es hat sich ein Erholungspotenzial nach einer längeren ischämischen Verletzung gezeigt21,22. Nichtsdestotrotz kann eine unbeabsichtigte Variabilität während der Mikrochirurgie zu einer Variabilität der Gewebelebensfähigkeit zwischen den Herzen führen. Frühere Studien haben über die Verschlechterung dieses Herzens im Laufe der Zeit berichtet19; Zum Beispiel wurde eine Verringerung der kontraktilen Funktion von 5%-10% pro Stunde beobachtet18. Es wurde bereits gezeigt, dass das Adenosintriphosphat (ATP)-Signal über den energetischen Status und die Lebensfähigkeit des Myokards berichtet23. Hier stellten wir fest, dass das perfundierte Herz gelegentlich eine unbeabsichtigte Variabilität der Lebensfähigkeit aufweisen kann, wie der ATP-Gehalt zeigt, obwohl wir eine ununterbrochene Perfusion und Sauerstoffversorgung hatten. Wir zeigen hier, dass die Normalisierung der LDH- und PDH-Raten auf den ATP-Gehalt des Herzens die Inter-Herz-Variabilität in diesen Raten reduziert.
Im folgenden Protokoll beschreiben wir den chirurgischen Eingriff zur Herzkanülierung, Isolierung und anschließenden Perfusion im NMR-Spektrometer. Bemerkenswert ist, dass andere chirurgische Ansätze, die darauf abzielen, das Mausherz zu isolieren und zu perfundieren, vor24,25 beschrieben wurden.
Die Methoden zur Erfassung von Daten in Bezug auf die enzymatischen Raten im schlagenden Herzen (unter Verwendung von 13 C-Spektroskopie und hyperpolarisiertem [1-13C] Pyruvat) sowie die Lebensfähigkeit und den Säuregehalt des Herzens (unter Verwendung der 31P-NMR-Spektroskopie) werden ebenfalls beschrieben. Abschließend werden die analytischen Methoden zur Bestimmung der metabolischen Enzymaktivitäten sowie der Lebensfähigkeit und des Säuregehalts des Gewebes erläutert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyperSense DNP Polariser</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td>52-ZNP91000</td>
			<td>HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR spectrometer&#160;</td>
			<td>RS2D</td>
			<td></td>
			<td>NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump&#160;</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>07554-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature probe</td>
			<td>Osensa</td>
			<td>FTX-100-LUX+</td>
			<td>NMR compatible temprature probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somnosuite low-flow anesthesia system</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lines, tubings, suture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum cured silicone tubes</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>HV-96119-16</td>
			<td>L/S 16 I.D. 3.1 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin polyether ether ketone (PEEK) lines</td>
			<td>Upchurch Scientific</td>
			<td></td>
			<td>id. 0.040&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intravenous catheter&#160;</td>
			<td>BD Medical</td>
			<td>381323</td>
			<td>22 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>W577H</td>
			<td>Wire diameter of 3-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals and pharmaceuticals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[1-13C]pyruvic acid</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>CLM-8077-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21074</td>
			<td>CAS: 10043-52-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>CAS: 50-99-77</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium</td>
			<td>Rotexmedica</td>
			<td>HEP5A0130C0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid 37%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td>CAS: 7647-01-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin aspart (NovoLog)</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Terrel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793612</td>
			<td>CAS: 7487-88-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4504</td>
			<td>CAS: 7447-40-7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td>CAS: 7778-77-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Gadot Group</td>
			<td></td>
			<td>CAS: 144-55-8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9625</td>
			<td>CAS: 7647-14-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>655104</td>
			<td>CAS: 1310-73-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7907</td>
			<td>CAS: 7558-79-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monbasic dihydrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6345</td>
			<td>CAS: 13472-35-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS (biotechnology grade)</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0826</td>
			<td>CAS: 77-86-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trityl radical OX063</td>
			<td>GE Healthcare AS</td>
			<td>NC100136</td>
			<td>OX063</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR standards</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C standard sample</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories</td>
			<td>DLM-72A</td>
			<td>40% p-dioxane in benzene-D6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31P standard sample</td>
			<td>Made in house</td>
			<td></td>
			<td>105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel 2016</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MNova</td>
			<td>Mestrelab Research</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating cardiac metabolism in the isolated perfused mouse heart with hyperpolarized [1-13c]pyruvate and 13c/31p nmr spectroscopy

Der Stoffwechsel ist die Grundlage wichtiger Prozesse im zellulären Leben. Die Charakterisierung der Funktionsweise von Stoffwechselnetzwerken in lebenden Geweben liefert entscheidende Informationen für das Verständnis der Mechanismen von Krankheiten und die Entwicklung von Behandlungen. In dieser Arbeit beschreiben wir Verfahren und Methoden zur Untersuchung der zellinternen Stoffwechselaktivität in einem retrograden perfundierten Mausherz in Echtzeit. Das Herz wurde in situ isoliert, in Verbindung mit einem Herzstillstand, um die Myokardischämie zu minimieren, und wurde in einem Kernspinresonanzspektrometer (NMR) perfundiert. Während des Spektrometers und unter kontinuierlicher Perfusion wurde dem Herzen hyperpolarisiertes [1-13 C]pyruvat verabreicht, und die anschließenden hyperpolarisierten [1-13 C]Laktat- und [13C]Bicarbonat-Produktionsraten dienten dazu, in Echtzeit die Raten der Laktatdehydrogenase- und Pyruvatdehydrogenase-Produktion zu bestimmen. Diese metabolische Aktivität von hyperpolarisiertem [1-13C]pyruvat wurde mit NMR-Spektroskopie modellfrei unter Verwendung des produktselektiven Ansatzes zur Erfassung von Sättigungsanregungen quantifiziert. 31 Die P-Spektroskopie wurde zwischen den hyperpolarisierten Aufnahmen angewendet, um die Herzenergetik und den pH-Wert zu überwachen. Dieses System ist einzigartig nützlich für die Untersuchung der Stoffwechselaktivität im gesunden und kranken Mausherzen.

Die 31P-Spektren, die von einem mit KHB perfundierten Mausherz und nur vom Puffer aufgenommen wurden, sind in Abbildung 1A dargestellt. Die Signale von α-, β- und γ-ATP, PCr und Pi wurden im Herzen beobachtet. Das Pi-Signal setzte sich aus zwei Hauptkomponenten zusammen: Im höheren Feld (linke Seite des Signals) war das Pi-Signal hauptsächlich auf die KHB bei einem pH-Wert von 7,4 zurückzuführen; Im unteren Feld (rechte Seite des Signals) war das Pi-Signal aufgrund der saur...

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Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

Wir beschreiben einen Versuchsaufbau zur Verabreichung von hyperpolarisierten 13C-markierten Metaboliten im kontinuierlichen Perfusionsmodus an ein isoliertes perfundiertes Mausherz. Ein spezieller 13-C-NMR-Erfassungsansatz ermöglichte die Quantifizierung der metabolischen Enzymaktivität in Echtzeit, und eine multiparametrische 31-P-NMR-Analyseermöglichte die Bestimmung des ATP-Gehalts und des pH-Werts des Gewebes.

Untersuchung des kardialen Stoffwechsels im isolierten perfundierten Mausherz mit hyperpolarisierter [1-13 C]Pyruvat- und 13C/31P-NMR-Spektroskopie

Metabolism is the basis of important processes in cellular life. Characterizing how metabolic networks function in living tissues provides crucial ...

Hi.In diesem Video erfahren Sie, wie Sie hyperpolarisierte MR-Untersuchungen des perfundierten Mausherzens durchführen. David Shaul, ein MD/PhD-Student im Labor, führt Sie durch die verschiedenen Techniken und Verfahren. Heute lernen wir ein Protokoll zur Untersuchung des hyperpolarisierten Kohlenstoff-13-Pyruvat-Metabolismus in Kombination mit 31P-NMR-Spektroskopie.Der Pyruvatstoffwechsel steht an der Kreuzung von aerobem und anaerobem Stoffwechsel. Und als solches ist es von großem Wert für die Untersuchung verschiedener Zustände des Herzens. Also lasst uns loslegen.Das Mausherz wird isoliert und mit Krebs-Hensleit-Puffer in einem 10-Millimeter-NMR-Röhrchen perfundiert. Das Herz wird dann in das NMR-Spektrometer eingeführt. Dort wird ein 31P-Spektrum aufgezeichnet, um die Herzenergetik und den pH-Wert zu beobachten, indem die Resonanzen von Adenosintriphosphat, Phosphokreatin und anorganischem Phosphat beobachtet werden.Währenddessen wird eine Pyruvatprobe, die an erster Stelle mit Kohlenstoff-13 markiert ist, hyperpolarisiert. Und nachdem die Auflösung aufgetreten ist, wird es in das Herz injiziert, um die Messung von Laktat, anorganischen Stoffen und Pyruvat der organisierten Aktivitäten in Echtzeit zu ermöglichen. Bereiten Sie einen Tag vor dem Experiment 400 Milliliter modifizierten Krebs-Henselet-Puffer vor.Im ersten Schritt lösen wir diese Inhaltsstoffe in doppelt destilliertem Wasser. Dann blasen Sie diese Lösung 20 Minuten lang mit dieser Sauerstoffmischung und fügen Sie dann Calciumchlorid hinzu. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein.Fügen Sie am Tag des Experiments Glukose und Insulin hinzu. Stellen Sie das Wasserbad auf 40 Grad Celsius ein. Setzen Sie die mittelgroße Flasche mit 200 Millilitern KH-Puffer in das Bad ein.Verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um den KH-Puffer zu recyceln. Schließen Sie daran eine Zuflussleitung und zwei Abflussleitungen an. Führen Sie die Zu- und Abflussleitungen in den beheizten KH-Puffer ein.Verwenden Sie einen Sauerstoffmischer mit 95% O2 und 5% CO2. Führen Sie dann die Sauerstoffleitung in den erhitzten KH-Puffer ein. Schalten Sie die Schlauchpumpe ein und stellen Sie sie auf ein konstantes Durchflussgewicht von 7,5 Millilitern pro Minute ein.Wir wollen das System kalibrieren, bevor wir das Herz einführen. Führen Sie daher die Zu- und Abflussleitungen in ein 10-Millimeter-NMR-Röhrchen ein und setzen Sie einen optischen Temperaturfühler ein, der NMR-kompatibel ist. Führen Sie den NMR-Röhrchen in die Magnetbohrung ein.Stellen Sie den Heiztank auf 42 Grad Celsius ein und verwenden Sie die NMR-Heizung, um die Temperatur im Inneren des Magneten auf 37 Grad Celsius einzustellen. Beachten Sie, dass die NMR-Temperatur tatsächlich im KH-Puffer im Inneren des Magneten mit einem NMR-kompatiblen Temperaturkern überwacht wird. Jetzt können wir die 31P-Spektroskopie verwenden, um das Signal von anorganischem Phosphat im Puffer zu beobachten.Dies ist die Ausrüstung, die für den chirurgischen Eingriff erforderlich ist. Geben Sie 100 Milliliter KH-Puffer in Eis und blasen Sie es mit der gleichen Sauerstoffmischung. Betäuben Sie die Maus in der Kastenkammer mit 3,3% Isofluran, gemischt mit Raumluft zur Induktion, bei einer Durchflussrate von 340 Millilitern pro Minute.Übertragen Sie die Maus in die Nasenanästhesie. Bei gleicher Durchflussrate auf 2,9 % Isofluran reduzieren. Drücken Sie den Fuß zusammen, um einen negativen Pedalschmerzreflex zu überprüfen und sicherzustellen, dass die Maus vollständig betäubt ist.Injizieren Sie der Maus 300 Einheiten Natriumheparin intraperitoneal. Schneiden Sie die Haut zwei Zentimeter unterhalb des Xiphoid-Prozesses. Schneiden Sie die Bauchdecke ab, um die Bauchhöhle freizulegen.Platzieren Sie die Scherenklemme zwischen dem Xiphoidfortsatz und der Brusthaut und verwenden Sie sie, um die Brustwand zurückzuziehen und das Zwerchfell freizulegen. Durchstechen Sie den rechten Lappen des Zwerchfells und schneiden Sie dann den Rest des Zwerchfells ab. Schneiden Sie über die Mittellinie der Brustwand und vermeiden Sie dabei den Kontakt mit tieferen Organen wie dem Herzen und den Gefäßen.Injizieren Sie 200 Einheiten Natriumheparin in den linken Ventrikel des Herzens. Injizieren Sie dem Herzen 0,1 Milliliter 0,5 Molar KCL, um einen Herzstillstand zu erreichen. Ziehen Sie das Thymusgewebe nach vorne zurück und schneiden Sie es von seiner Wurzel ab, um die darunter liegende Aorta freizulegen.Versuchen Sie, so viel Thymusgewebe wie möglich zu entfernen und gleichzeitig Schäden an der Aorta zu vermeiden. Entfernen Sie restliches Brustkorbgewebe, um den intravenösen Katheter frei passieren zu lassen. Legen Sie die gebogene Pinzette unter die Aorta und legen Sie damit einen Seidennahtknoten um die Aorta.Platzieren Sie eine gebogene Pinzette an der Aortenwurzel und ziehen Sie das Herz nach unten zurück, um die Aorta freizulegen und zu dehnen. Injizieren Sie drei Milliliter eiskalten KH-Puffer in den linken Ventrikel, um Blutgerinnsel aus der Aorta zu entfernen und die Lebensfähigkeit des Herzens zu erhalten. Geben Sie auch einige Tropfen auf die Herzoberfläche.Verwenden Sie eine intravenöse Katheternadel, um die Arterienwand der Aorta zu punktieren, ohne die hintere Wand zu beschädigen. Führen Sie dann den Katheter mit der Nadel etwa drei Millimeter ein. Entfernen Sie anschließend die Nadel und führen Sie gleichzeitig den Katheterschlauch für weitere fünf Millimeter ein, vermeiden Sie jedoch das Eindringen in die linke Ventrikelkammer.Legen Sie Cyanacrylatkleber in den Einstichbereich der Aorta, um zu verhindern, dass der Katheterschlauch beim Anziehen der Naht aus der Aorta rutscht. Binden Sie vorsichtig einen Knoten zwischen der Aorta und dem Kanülenschlauch. Injizieren Sie zusätzliche fünf Milliliter KH-Puffer in den linken Ventrikel und überprüfen Sie, ob er durch das Kanülierungsröhrchen fließt.Dies bedeutet, dass die Kanülierung erfolgreich war. Entfernen Sie die gebogene Pinzette von der Aortenwurzel. Trennen Sie das Herz von den umgebenden Eingeweiden und vermeiden Sie dabei den Kontakt mit dem Kanülierungsmittel und dem Herzgewebe.Schließen Sie die Kanüle sofort an eine fließende eiskalte KH-Pufferspritze an. Es ist wichtig, das Eindringen von Luftblasen in das Herz zu vermeiden. Entfernen Sie nicht-kardiales Gewebe.In diesem Stadium sollten Sie beobachten, wie das Herz wieder schlägt. Schneiden Sie die restlichen Seidennahtränder ab. Trennen Sie im NMR-Raum die Kanüle von der Spritze und schließen Sie sie an den 37-Grad-KH-Puffer des Perfusionssystems an.Führen Sie dann das Herz in das 10-Millimeter-NMR-Röhrchen ein. Platzieren Sie das Herz in der Mitte der Sonde und führen Sie dann das NMR-Röhrchen mit dem Herzen in die Bohrung des NMR-Spektrometers ein. Führen Sie "Shim" mit dem Wassersignal auf dem 1H-Kanal durch, bis eine Leitungsbreite von 10 bis 20 Hertz erreicht ist.Erfassen Sie dann 31P-Spektren des Herzens, indem Sie einen Flip-Winkel von 50 Grad und einen TR von 1,1 Sekunden im stationären Zustand verwenden. Diese Bedingungen begünstigen das Signal von ATP gegenüber den Signalen von PCr und anorganischem Phosphat. Die Beobachtung der Signale von ATP und PCr bedeutet, dass das Gewebe im NMR-Spektrometer lebensfähig ist.Verwenden Sie ein spezielles Verarbeitungsprogramm, um die Spektren zu analysieren. Führen Sie eine exponentielle Aufrüstung von sieben Hertz durch. Verwenden Sie die Basislinienkorrektur und weisen Sie dann das Phosphokreatinsignal minus 2,5 ppm zu.Beobachten Sie die Signale von anorganischem Phosphat, Phosphokreatin und ATP. Polarisieren Sie die Pyruvatprobe, die an erster Stelle mit Kohlenstoff 13 markiert ist, 80 Minuten lang. Nach 80 Minuten Polarisation ist die Probe bereit für die Lösung.So erfolgt die Auflösung. Injizieren Sie den Auflösungsinhalt mit dem kontinuierlichen Perfusionsansatz in das Herz. Dieser Ansatz wurde entwickelt, um das Pyruvat ohne Unterbrechung der Gewebeperfusion und des Sauerstoffgehalts zu liefern.Das Lösungsmedium, das das hyperpolarisierte Pyruvat enthält, wird in ein konisches Röhrchen injiziert, dann manuell in einen Bypass injiziert, und dann leiten wir die Perfusion durch den Bypass, und der Bypass-Inhalt fließt kontinuierlich durch das Herz und wird schließlich ausgewaschen. Wir verwenden eine Perfusionsrate von 7,5 Millilitern pro Minute und ein Bypassvolumen von 22 Millilitern. So dass die hyperpolarisierten Medien etwa drei Minuten lang durch das Herz fließen.In diesem Zeitfenster verwenden wir die Kohlenstoff-13-Spektroskopie, um Pyruvat-, Laktat- und Bicarbonatsignale zu messen. Wir verwenden ein Anregungsschema, das zwischen Laktatanregung und Bikarbonatanregung mit Intervallen von sechs Sekunden wechselt. Wir haben eine sättigende selektive Anregung verwendet, um das Kohlenstoff-13-Signal zu erhalten.Bei diesem Ansatz wird das Substrat Pyruvat minimal angeregt, während die Metaboliten, Laktat und Bicarbonat, vollständig angeregt werden. Beobachten und zeichnen Sie den Kohlenstoff-13-Pyruvatstoffwechsel etwa drei Minuten lang auf. Die metabolische Untersuchung ist abgeschlossen, nachdem das Pyruvatsignal abgeklungen ist.Diese Abbildung zeigt 31P-Spektren, die von einem mit KH-Puffer durchbluteten Mausherzen aufgenommen wurden. Das vom Herzen erfasste Spektrum zeigt die Signale von Alpha-, Beta- und Gamma-ATP, PCr und Pi. Das Pi-Signal besteht aus zwei Hauptkomponenten. Die Komponente auf der linken Seite, die in einem höheren Feld erscheint, stellt ein Pi-Signal dar, das hauptsächlich auf KH-Puffer bei einem pH-Wert von 7,4 zurückzuführen ist. Der Rand und die weniger homogene Komponente auf der rechten Seite, die sich in einem unteren Feld befindet, zeigt das Pi-Signal, das sich in einer saureren Umgebung befindet.Diese Komponente entsteht aus dem Herzgewebe. Als nächstes wurde das Pi-Signal des Gewebes erhalten, indem das Puffer-Pi-Signal vom gesamten Pi-Signal subtrahiert wurde. Es wurde dann von einer ppm-Skala in eine pH-Skala umgewandelt.Der pH-Wert wird mit einer multiparametrischen Analyse des Gewebe-Pi-Signals untersucht, indem der gewichtete Mittelwert, der gewichtete Median, das globale Maximum und die Schiefe berechnet werden. Diese Abbildung zeigt ein typisches Kohlenstoff-13-NMR-Spektrum, das unter Verwendung des hyperpolarisierten produktselektiven Sättigungsanregungsansatzes während der hyperpolarisierten Kohlenstoff-13-Pyruvat-Injektion in das perfundierte Mausherz erhalten wurde. Beachten Sie Laktatpyruvat- und Bicarbonatsignale.Das Pyruvatsignal wird hier zu Anzeigezwecken abgeschnitten. Die Änderungen der Signalintensitäten des Substrats und der Metaboliten sind auf die T1-Relaxation, die Anregungsfrequenz und die Fließeigenschaften zurückzuführen. Als nächstes werden die integrierten Intensitäten dieser Signale aufgetragen.Darüber hinaus haben wir in schwarzen Kreisen die in Pyruvat integrierte Intensität aufgetragen, die für den T1-Zerfall und für den Effekt von 4D-Frequenzanregungen unter Verwendung einer effektiven Abklingzeitkonstante von 32 Sekunden gesammelt wurde. Es wurde festgestellt, dass diese Korrektur die erwartete Fließdynamik für das Substrat ergibt. Einwaschen, Plateau und Auswaschen.Anhand dieses korrigierten Signalzeitverlaufs wählten wir für die weitere Analyse das hellblau markierte Zeitfenster aus, in dem die Pyruvatkonzentration im NMR-Röhrchen konstant und maximal war. Die Raten von LDH und PDH wurden für jeden der ausgewählten Zeitpunkte berechnet und dann gemittelt. Die Hauptwerte für diese Injektion werden in Einheiten von Nanomol pro Sekunde angegeben.Zusammenfassend haben wir das Experimentiersystem zur Durchführung von hyperpolarisierten Pyruvat-Stoffwechselstudien im perfundierten Mausherz gezeigt. Wir hoffen, dass diese Informationen nützlich waren.

Research

JoVE Journal

Biology

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optische Abbildung von Langendorff-perfundierten Rattenherzen

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Forschung

Biologie

Characterization of the Isolated, Ventilated, and Instrumented Mouse Lung Perfused with Pulsatile Flow

Charakterisierung der isolierten, ventilierten und Instrumented Maus Lung mit pulsatilen Fluss perfundierten

The isolated, ventilated and instrumented mouse lung preparation allows steady and pulsatile pulmonary vascular pressure-flow relationships to be measured ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Nachweis von Stickstoffmonoxid und Superoxid-Radikalanion von paramagnetischer Resonanzspektroskopie von Zellen mit Spinfallen

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

Intravitalmikroskopie der Mikrozirkulation in der Maus Cremaster-Muskel für die Analyse der peripheren Stammzell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optische Kartierung der Intra-Retikulum Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Und Transmembranpotential in der Langendorff-perfundierten Kaninchen Herz

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen von Erwachsenen Maus Herzen

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...