Name: synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth at JoVE.com

تم دعم البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم تحت رقم المنحة 2009522. تم دعم تحليل NMR ل masarimycin من قبل جائزة برنامج الأجهزة البحثية الرئيسية للمؤسسة الوطنية للعلوم تحت رقم المنحة 1919644. أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المادة هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر المؤسسة الوطنية للعلوم.

1. الطرق العامة
ملاحظة: تم شراء جميع المركبات من الموردين القياسيين واستخدامها دون مزيد من التنقية.
<ol><li>نفذ كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) على صفيحة ألومنيوم مغلفة مسبقا بهلام السيليكا XG F254. الكشف عن البقع تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية، عن طريق الغمر في بقعة p-an...

Masarimycin هو مثبط واحد للجراثيم الدقيقة مولار لنمو B. subtilis35 و S. pneumoniae37. في B. subtilis ، ثبت أن masarimycin يثبط GlcNAcase LytG35 ، في حين لم يتم تحديد الهدف الجزيئي الدقيق في جدار الخلية من S. pneumoniae 37. يوفر تخليق ماساريميسين باستخدام إما التوليف ا?...

Peptidoglycan (PG) هو بوليمر يشبه الشبكة يحدد شكل الخلية وبنيتها في كل من البكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام 1,2. هذا البوليمر المتغاير عبارة عن مصفوفة من السكريات الأمينية المرتبطة بالببتيدات القصيرة3،4،5،6 مع العمود الفقري المكون من بقايا N-acetylglucosamine (GlcNAc) و N-acetylmuramic acid (MurNAc) المرتبطة β (1،4) (الشكل 1)1. تعلق على C-3 لاكتيل moiety من MurNAc هو الببتيد الجذعي. يتضمن استقلاب PG نظاما منسقا بإحكام من الإنزيمات الاصطناعية الحيوية والتحلل لدمج مواد جديدة في جدار الخلية 7,8. يتم تحلل PG بواسطة إنزيمات يشار إليها مجتمعة باسم autolysins9 ويتم تصنيفها بشكل أكبر بناء على خصوصية الرابطة المشقوقة. تشارك Autolysins في العديد من العمليات الخلوية بما في ذلك نمو الخلايا ، وانقسام الخلايا ، والحركة ، ونضج PG ، و chemotaxis ، وإفراز البروتين ، والكفاءة الوراثية ، والتمايز ، والإمراض10,11. يمكن أن يكون الكشف عن الوظائف البيولوجية المحددة ل autolysins الفردية أمرا شاقا ، ويرجع ذلك جزئيا إلى التكرار الوظيفي. ومع ذلك ، قدمت الدراسات الفيزيائية الحيوية الحديثة8،12،13 والدراسات الحسابية12 نظرة ثاقبة جديدة على أدوارها في استقلاب PG. بالإضافة إلى ذلك ، قدمت التقارير الأخيرة مزيدا من التبصر في التوليف 14 وخطوات 15،16،17 بوساطة الغشاء في استقلاب PG. إن الفهم الشامل للعلاقة بين المسارات التحلل والاصطناعية لاستقلاب PG يمكن أن يؤدي إلى أهداف المضادات الحيوية غير المستغلة سابقا.
في حين كان هناك تقدم كبير في منهجية لدراسة علم الأحياء السكرية في حقيقيات النوى ، فإن علم الأحياء السكرية البكتيرية ، وعلى وجه الخصوص ، لم يتقدم استقلاب PG بمعدل مماثل. تشمل الأساليب الكيميائية الحالية لدراسة استقلاب PG المضادات الحيوية ذات العلامات الفلورية18 ، ومجسات الفلورسنت19،20 ، ووضع العلامات الأيضية21،22،23،24. توفر هذه الأساليب الجديدة طرقا جديدة لاستجواب استقلاب جدار الخلية البكتيرية. في حين أن بعض هذه الاستراتيجيات قادرة على وضع علامات PG في الجسم الحي ، إلا أنها يمكن أن تكون19 نوعا خاصا ، أو تعمل فقط في سلالات تفتقر إلى autolysin25 معين. العديد من استراتيجيات وضع العلامات PG مخصصة للاستخدام مع جدران الخلايا المعزولة26 أو مع مسارات التخليق الحيوي PG المعاد تشكيلها في المختبر 20،27،28. يقتصر استخدام المضادات الحيوية ذات العلامات الفلورية حاليا على خطوات التخليق الحيوي و transpeptidation18.
المعرفة الحالية من autolysins البكتيرية ودورها في استقلاب جدار الخلية تأتي من التحليل الكيميائي الحيوي الوراثي وفي المختبر 11،29،30،31،32. في حين أن هذه الأساليب قد وفرت ثروة من المعلومات حول هذه الفئة المهمة من الإنزيمات ، فإن فك رموز دورها البيولوجي يمكن أن يكون تحديا. على سبيل المثال ، بسبب التكرار الوظيفي33 ، لا يؤدي حذف autolysin في معظم الحالات إلى وقف نمو البكتيريا. هذا على الرغم من دورها الضمني في نمو الخلايا وانقسامها 7,12. ومن المضاعفات الأخرى أن الحذف الجيني لل autolysins البكتيرية يمكن أن يؤدي إلى ظهور أنماط ظاهرية ميتا34. تنشأ الأنماط الظاهرية الفوقية من التفاعل المعقد بين المسار المتأثر بالحذف الجيني والمسارات المترابطة الأخرى. على سبيل المثال ، يمكن أن ينشأ النمط الظاهري الفوقي عن طريق تأثير مباشر مثل عدم وجود إنزيم ، أو تأثير غير مباشر مثل تعطيل المنظمين.
حاليا ، لا يوجد سوى عدد قليل من مثبطات الغليكوزيداز autolysins مثل N-acetylglucosaminidases (GlcNAcase) و N-acetylmuramidases ، والتي يمكن استخدامها كمجسات كيميائية لدراسة تدهور PG. لمعالجة هذا ، تم تحديد diamide masarimycin (الذي كان يطلق عليه سابقا باسم fgkc) ووصف35 كمثبط للجراثيم لنمو Bacillus subtilis الذي يستهدف GlcNAcase LytG32 (الشكل 1). LytG هو GlcNAcase36 ذو مفعول خارجي ، وهو عضو في المجموعة 2 ضمن عائلة هيدرولاز غليكوزيل 73 (GH73). وهو GlcNAcase النشط الرئيسي أثناء النمو الخضري32. على حد علمنا ، Masarimycin هو أول مثبط ل GlcNAcase الذي يعمل PG والذي يمنع النمو الخلوي. وجدت دراسات إضافية على ماساريميسين مع العقدية الرئوية أن ماساريميسين من المحتمل أن يمنع استقلاب جدار الخلية في هذا الكائن الحي37. هنا ، يتم الإبلاغ عن إعداد masarimycin للاستخدام كمسبار بيولوجيا كيميائية لدراسة علم وظائف الأعضاء في الكائنات الحية إيجابية الجرام B. subtilis ، و S. pneumoniae. يتم تقديم أمثلة على التحليل المورفولوجي لعلاج التركيز المثبط دون الحد الأدنى باستخدام ماساريميسين ، بالإضافة إلى فحص التآزر / الخصومة. يمكن أن تكون مقايسات التآزر والعداء باستخدام المضادات الحيوية مع طرق عمل محددة جيدا طريقة مفيدة لاستكشاف الروابط بين العمليات الخلوية38،39،40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Iodobenzoic acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I7675-25G</td>
			<td>corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>109827-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum backed silica plates</td>
			<td>Sorbtech</td>
			<td>4434126</td>
			<td>silica gel XG F254 on aluminum backed plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform-d</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>151823-50G</td>
			<td>solvent for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Mass Spectrometer</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>Advion CMS</td>
			<td>compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>07-200-90</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-547</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexanecarboxaldehyde</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L INC.</td>
			<td>24451</td>
			<td>flammable, irritant, colorless to pink liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl isocyanide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>133302-5G</td>
			<td>irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexylamine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>240648-100ML</td>
			<td>corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>537446-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flash silica cartridge (12g)</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>PF-50SIHP-F0012</td>
			<td>pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>fixing agent for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H8651-25G</td>
			<td>buffer for microscopy fixing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, mixture of isomers</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>178918-4L</td>
			<td>environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance compact mass spectrometer</td>
			<td>Advion</td>
			<td>expression</td>
			<td>Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vac</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>Vacufuge plus</td>
			<td>vacuum aided by centrifugal force and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>258148-2.5L</td>
			<td>corrosive, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td>strong acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-365-19</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine, resublimed crystals</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41955</td>
			<td>environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mestre Mnova</td>
			<td>MestreLab Research</td>
			<td></td>
			<td>software for processing NMR spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>439193-4L</td>
			<td>flammable, toxic, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td>microscopy stain for staining cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>B21176X</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton broth</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>DF0757-17-6</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>22-310397</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Synthesis Labstation</td>
			<td>MILESTONE</td>
			<td>START SYNTH</td>
			<td>device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tubes</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z562769-5EA</td>
			<td>5mm NMR tubes 600 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Resonance (NMR)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Ascend 400</td>
			<td>large superconducting magnet (400MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optochin</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>AAB21627MC</td>
			<td>ethylhydrocupreine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petrie plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229695</td>
			<td>for preparing agar plates for bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for morphology studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puriFlash</td>
			<td>interchim</td>
			<td>XS520plus</td>
			<td>flash chromatography purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resazurin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R7017-1G</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Hei-VAP Value &#34;The Collegiate&#34;</td>
			<td>solvent evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td>irritant, white powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>S271-1</td>
			<td>crystalline, colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>7985592-500G</td>
			<td>anhydrous, granular, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitney DG250 Workstation</td>
			<td>Microbiology International</td>
			<td>DG250</td>
			<td>anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Lite (blue) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for acquiring micrographs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth

Peptidoglycan (PG) في جدار الخلية من البكتيريا هو بنية جزيئية كبيرة فريدة من نوعها تمنح الشكل والحماية من البيئة المحيطة. من الأمور الأساسية لفهم نمو الخلايا وانقسامها معرفة كيفية تأثير تدهور PG على التخليق الحيوي وتجميع جدار الخلية. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن وضع العلامات الأيضية ل PG من خلال إدخال السكريات المعدلة أو الأحماض الأمينية. في حين أن الاستجواب الكيميائي لخطوات التخليق الحيوي مع مثبطات الجزيئات الصغيرة أمر ممكن ، فإن أدوات البيولوجيا الكيميائية لدراسة تدهور PG بواسطة autolysins غير متطورة. ال autolysins البكتيرية هي فئة واسعة من الإنزيمات التي تشارك في التدهور المنسق بإحكام من PG. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لإعداد مسبار جزيء صغير ، masarimycin ، وهو مثبط ل N-acetylglucosaminidase LytG في Bacillus subtilis ، واستقلاب جدار الخلية في العقدية الرئوية. يتم توفير إعداد المثبط عن طريق التوليف العضوي بمساعدة الميكروويف والكلاسيكية. يتم تقديم إمكانية تطبيقه كأداة لدراسة فسيولوجيا إيجابية الجرام في الفحوصات البيولوجية.

Masarimycin هو مثبط للجراثيم جزيء صغير من B. subtilis و S. pneumoniae وقد ثبت أنه يثبط GlcNAcase LytG المفعول في B. subtilis 35,37 ويستهدف جدار الخلية في S. pneumoniae 37. يمكن تحضير Masarimycin بكفاءة إما عن طريق التوليف العضوي الكلاسيكي أو بمساعدة الميكروويف مع غلة ف?...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth at JoVE.com

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

يتم تقديم بروتوكول مفصل لإعداد الدياميد ماساريميسين المضاد للجراثيم ، وهو مسبار جزيء صغير يمنع نمو Bacillus subtilis والمكورات العقدية الرئوية عن طريق استهداف تدهور جدار الخلية. يظهر تطبيقه كمسبار كيميائي في اختبارات التآزر / العداء والدراسات المورفولوجية مع B. subtilis و S. pneumoniae.

تخليق ماساريميسين ، وهو مثبط جزيء صغير للنمو البكتيري الإيجابي الجرام

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Masarimycin هو واحد من المثبطات القليلة لل autolysins البكتيرية التي توقف نمو الخلايا البكتيرية. يمكن استخدامه للتحقيق في الاختلافات بين التعطيل الكيميائي والجيني لل autolysins ، ويوفر نهجا متعامدا لعلم الوراثة لدراسة فسيولوجيا البكتيريا. قد يبدو تخليق ماساريميسين شاقا.اتبع الخطوات الموضحة عن كثب. عندما تكون في شك إذا نجحت خطوة التفاعل ، تأكد من خلال كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة والتغيرات في قيم RF. للبدء ، قم بإعداد محلول مولاري 0.1 من سيكلوهيكسيلامين ، وكربوكسالدهيد سيكلوهيكسيل ، وحمض أورثو يودوبنزويك ، وسيكلوهكسيل إيزوسيانيد في الميثانول.أضف شريط التحريك المغناطيسي ، ثم امزج خمسة ملليلتر من السيكلوهيكسيلامين وخمسة ملليلتر من كربوكسالدهيد السيكلوهيكسيل في قارورة مستديرة القاع مغطاة وضع القارورة في حمام رملي على مقلب صفيحة ساخنة لمدة 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية. راقب درجة الحرارة باستخدام ميزان حرارة يوضع تحت سطح الرمال حوالي سنتيمتر واحد. بعد 30 دقيقة ، أضف خمسة ملليلتر من إيزوسيانيد السيكلوهيكسيل إلى المحلول وحرك لمدة 20 دقيقة إضافية عند 50 درجة مئوية.ثم ، أضف خمسة ملليلترات من حمض أورثو يودوبنزويك إلى خليط التفاعل واستمر في التحريك عند 55 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى خمس ساعات. بعد ثلاث ساعات من التحريك ، راقب تقدم التفاعل بشكل دوري بواسطة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ، أو TLC ، على فترات زمنية مدتها ساعة واحدة تقريبا. ضع في اعتبارك أن التفاعل يكتمل عندما تكون بقعة واحدة فقط ذات عامل احتفاظ يساوي 0.3 مرئية على لوحة TLC.قم بإزالة المذيب في المبخر الدوار تحت ضغط منخفض. بمجرد تبخر كل الميثانول ، قم بإذابة المنتج الخام المجفف في 30 ملليلتر من خلات الإيثيل ونقله إلى قمع منفصل. استخراج خلات الإيثيل بالتتابع مع حمض الهيدروكلوريك المولي واحد ، والماء ، ومحلول بيكربونات الصوديوم المشبع ، والماء مرة أخرى ، ومحلول كلوريد الصوديوم المشبع ، مع التخلص من الطبقات المائية في كل استخراج.ثم ، قم بإزالة طبقة خلات الإيثيل من القمع الفاصل وجمعها في قارورة Erlenmeyer. أضف ملعقة مليئة بكبريتات الصوديوم اللامائية لإزالة الماء المتبقي من خلات الإيثيل. قم بتصفية محلول خلات الإيثيل المجفف من خلال ورقة ترشيح رقم واحد لإزالة كبريتات الصوديوم.ثم اغسل ورق الترشيح بكمية صغيرة من خلات الإيثيل. تم تبخر محلول خلات الإيثيل المصفى حتى يجف على مبخر دوار تحت ضغط منخفض للحصول على ماساريميسين كزيت بمجرد إزالة جميع خلات الإيثيل. يذوب زيت ماساريميسين في ملليلتر إلى ملليلتر من محلول هيكسان 9: 1 إلى إيزوبروبانول ويحرك على صفيحة تحريك مغناطيسية حتى يذوب المركب بأكمله.لتنقية ماساريميسين المذاب ، قم بإجراء كروماتوغرافيا فلاش مع عمود فلاش سيليكا بوزن 12 جراما ، عادي الطور. قم بموازنة عمود الفلاش مع 10 أحجام أعمدة من المرحلة المتنقلة مع ضبط الأدوات بمعدل تدفق يبلغ 15 ملليلتر في الدقيقة. بعد اكتمال التوازن ، ارسم الماساريميسين المذاب باستخدام حقنة سعة خمسة ملليلتر.قم بتوصيل المحقنة مباشرة بالجزء العلوي من عمود الفلاش المتوازن وحقن المحلول في العمود. أعد توصيل العمود الذي تم تحميله بنظام كروماتوغرافيا الفلاش وابدأ إزالة التدرج. إلوت ماساريميسين من العمود باستخدام إزالة التدرج إلى تركيز المرحلة المتنقلة النهائي من 10:90 الهكسان إلى الأيزوبروبانول على 12 حجم عمود.راقب إزالة الماساريميسين عن طريق الامتصاص عند 230 و 254 نانومتر. بالنسبة لدراسة المورفولوجيا ، تنمو عصية subtilis 11774 على ألواح أجار LB عند 37 درجة مئوية. في جميع التجارب اللاحقة ، استخدم خلايا الممر الثاني المزروعة في خمسة ملليلترات من مرق LB حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى 1.بعد ذلك ، باستخدام ماصة ، أضف ماساريميسين إلى أنابيب الاستزراع المصنفة المعالجة بتركيز نهائي من 3.8 ميكرومولات. بالنسبة لأنابيب الاستزراع المسماة بالتحكم، أضف حجما مكافئا من DMSO. ضع العينات في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة مع الاهتزاز عند 150 دورة في الدقيقة.بعد 90 دقيقة ، قم بإصلاح الثقافات كيميائيا في مزيج 1:10 من وسائط الثقافة وتثبيت المخزن المؤقت عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، استخدم ماصة لتطبيق 10 إلى 20 ميكرولتر من العينات الثابتة كيميائيا على شرائح المجهر الزجاجية والسماح لها بالجفاف في الهواء. بعد ذلك ، قم بإصلاح العينات المجففة بالهواء عن طريق تسخين الشرائح الزجاجية باستخدام موقد Bunsen.بعد تثبيت الحرارة ، قم بتلطيخ العينات ب 100 ميكرولتر من 0.1٪ من أزرق الميثيلين. بعد حضانة لمدة 10 دقائق مع البقعة ، اغسل الصبغة الزائدة بالماء المقطر. ثم ، سخني الشرائح الملطخة بلطف إلى 60 درجة مئوية في فرن لمدة 15 إلى 20 دقيقة لإحضار الخلايا إلى مستوى بؤري مشترك.ختم العينات الملطخة عن طريق وضع غطاء المجهر الانزلاق فوق الخلايا الملطخة. ثم ، قم بإغلاق الحواف باستخدام أسمنت شريحة المجهر. ضع شريحة المجهر المختومة على مرحلة المجهر واجعل الصورة في بؤرة التركيز عند تكبير 100X باستخدام المجهر الساطع المجال.ضع قطرة من زيت الغمر على شريحة المجهر واجعل مجال الرؤية يركز باستخدام التكبير 1000X. الحصول على الصور المجهرية باستخدام كاميرا متصلة بالمجهر والبرامج المرتبطة به. احصل على صور باستخدام إعدادات توازن اللون الأبيض التلقائي وفتحة العدسة الخاصة بالبرنامج.كروماتوغرافيا فلاش يسمح لتنقية سريعة من masarimycin مع نقاء عالية. يتم عرض تقييم التآزر أو العداء مع مثبط ATPase optochin في S.pneumoniae هنا. يعتبر أدنى تركيز للمركب لتثبيط نمو البكتيريا ، المشار إليه باللون الأزرق ، الحد الأدنى لقيمة التركيز المثبطة في وجود دواء مشترك.في المقابل ، تشير الآبار ذات اللون الوردي إلى نمو البكتيريا. أظهرت اختبارات النمط الظاهري باستخدام ماساريميسين عند 0.75 ضعف الحد الأدنى من التركيزات المثبطة نمطا ظاهريا يشبه النقانق ل B.subtilis ونمطا ظاهريا متكتلا ل S.pneumoniae. انتبه إلى درجة حرارة التفاعل.تأكد من اكتمال التفاعل عن طريق المراقبة باستخدام TLC. يمكن استخدام هذه الطريقة بالاقتران مع المضادات الحيوية ذات العلامات الفلورية للتحقيق في التغييرات التي تطرأ على جدار الخلية عن طريق الفحص المجهري.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

تحديد البروتينات ملزمة جزيء صغير في الخلوي البيئة الأصلية التي تعيش خلية Photoaffinity وصفها

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

طريقة لتحديد الصغيرة جزيء مثبطات التفاعل البروتين البروتين بين HCN1 وTRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

تعزيز نموذج المتعدد من الأنسجة عن طريق الجمع بين السلائف النظائر وسمها وإسوي الضغط توصيف (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

الغربية النشاف بروتوكول لإعداد صغيرة من الخلايا الجذعية المكونة للدم

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

فحص مثبطات كيناز في ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1 بوساطة التوليف الأنزيمي وتجميد البروتين المبلمر للمطاطي للقوة أحادية الجزيء

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-تقارب تنقية مقرونة تسلسل الحمض النووي الريبي في البكتيريا إيجابية الغرام

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...