Name: synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00
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研究得到了美国国家科学基金会的支持，拨款编号为2009522。马沙霉素的NMR分析得到了美国国家科学基金会重大研究仪器计划奖的支持，授予号为1919644。本材料中表达的任何意见，发现和结论或建议均为作者的观点，并不一定反映美国国家科学基金会的观点。

1. 一般方法
注意：所有化合物均从标准供应商处购买，无需进一步纯化即可使用。
<ol><li>在预涂有硅胶XG F254的铝板上进行薄层色谱（TLC）。通过浸入对茴香醛污渍或暴露于I2蒸气来检测紫外灯下的斑点。</li>
	<li>在 400 MHz 光谱仪上记录所有核磁共振 （NMR） 光谱。 注意： 1H-NMR和 13C-NMR光谱参考残留溶剂峰。耦合常数以 [Hz] 为单?...

马沙霉素是 枯草芽孢杆菌35 和肺炎链球菌37 生长的单微摩尔抑菌抑制剂。在 枯草芽孢杆菌中， 马萨利霉素已被证明可以抑制GlcNAcase LytG35，而 肺炎链球菌 细胞壁中的精确分子靶标尚未确定37。使用经典的有机合成或微波程序合成马萨霉素为抑制剂提供了良好的产量和高纯度。马沙霉素的低产率通常可归?...

肽聚糖（PG）是一种网状聚合物，可描绘革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌1，2中的细胞形状和结构。这种杂聚物是由短肽3，4，5，6与由β-（1，4）连接的交替的N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和N-乙酰基壁氨酸（MurNAc）残基组成的主链的氨基糖基质（图1）1。附着在MurNAc的C-3乳酰基部分的是茎肽。PG的代谢涉及生物合成和降解酶的紧密协调系统，以将新材料掺入细胞壁7，8。PG的降解由统称为自溶蛋白9的酶进行，并根据切割的键的特异性进一步分类。自溶蛋白参与许多细胞过程，包括细胞生长，细胞分裂，运动，PG成熟，趋化性，蛋白质分泌，遗传能力，分化和致病性10，11。解开单个自溶蛋白的特定生物学功能可能令人生畏，部分原因是功能冗余。然而，最近的生物物理8，12，13和计算研究12为它们在PG代谢中的作用提供了新的见解。此外，最近的报告提供了对PG代谢中合成14和膜介导的15，16，17步骤的进一步了解。对PG代谢的降解和合成途径之间关系的透彻理解可能会产生以前未开发的抗生素靶标。
虽然在研究真核生物糖生物学的方法上取得了重大进展，但细菌糖生物学，特别是PG代谢并没有以类似的速度发展。目前研究PG代谢的化学方法包括荧光标记的抗生素18，荧光探针19，20和代谢标记21，22，23，24。这些新方法为询问细菌细胞壁代谢提供了新的方法。虽然其中一些策略能够在体内标记PG ， 但它们可以是物种特异性的19，或者仅在缺乏特定自溶素25的菌株中起作用。许多PG标记策略旨在用于分离的细胞壁26 或与 体外 重建的PG生物合成途径20，27，28。荧光标记抗生素的使用目前仅限于生物合成步骤和转吞18。
目前细菌自身溶解素及其在细胞壁代谢中的作用的知识来自遗传和 体外 生化分析11，29，30，31，32。虽然这些方法提供了有关这种重要酶类的大量信息，但破译它们的生物学作用可能具有挑战性。例如，由于功能冗余33，在大多数情况下，自动溶血素的缺失不会导致细菌生长停止。尽管它们在细胞生长和分裂中隐含着作用7，12。另一个并发症是细菌自身溶解素的遗传缺失可引起元表型34。元表型源于受遗传缺失影响的途径与其他相互关联的途径之间的复杂相互作用。例如，元表型可以通过直接 效应（例如 缺乏酶）或间接效应（例如调节剂的破坏）而产生。
目前，只有少数糖苷酶自溶蛋白抑制剂，如N-乙酰氨基葡萄糖酶（GlcNAcase）和N-乙酰基muramidases，可用作化学探针来研究PG的降解。为了解决这个问题，已经鉴定并表征了35 作为 枯草芽孢杆菌 生长的抑菌抑制剂，其靶向GlcNAcase LytG32 （图1）。LytG是一种 外源作用的GlcNAcase36，是糖基水解酶家族73（GH73）中簇2的成员。它是营养生长过程中的主要活性GlcNAcase32。据我们所知，马沙霉素是抑制细胞生长的PG作用GlcNAcase的第一种抑制剂。马沙霉素与 肺炎链球菌 的进一步研究发现，马沙霉素可能抑制该生物体中的细胞壁代谢37。在这里，据报道，马沙霉素的制备被用作化学生物学探针，以研究革兰氏阳性生物 枯草芽孢 杆菌和 肺炎链球菌 的生理学。本文介绍了用马沙霉素进行亚最小抑制浓度治疗的形态学分析实例，以及协同/拮抗作用测定。使用具有明确定义的作用模式的抗生素进行协同作用和拮抗作用测定可以是探索细胞过程38，39，40之间连接的有用方法。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Iodobenzoic acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I7675-25G</td>
			<td>corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>109827-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum backed silica plates</td>
			<td>Sorbtech</td>
			<td>4434126</td>
			<td>silica gel XG F254 on aluminum backed plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform-d</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>151823-50G</td>
			<td>solvent for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Mass Spectrometer</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>Advion CMS</td>
			<td>compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>07-200-90</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-547</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexanecarboxaldehyde</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L INC.</td>
			<td>24451</td>
			<td>flammable, irritant, colorless to pink liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl isocyanide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>133302-5G</td>
			<td>irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexylamine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>240648-100ML</td>
			<td>corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>537446-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flash silica cartridge (12g)</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>PF-50SIHP-F0012</td>
			<td>pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>fixing agent for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H8651-25G</td>
			<td>buffer for microscopy fixing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, mixture of isomers</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>178918-4L</td>
			<td>environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance compact mass spectrometer</td>
			<td>Advion</td>
			<td>expression</td>
			<td>Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vac</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>Vacufuge plus</td>
			<td>vacuum aided by centrifugal force and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>258148-2.5L</td>
			<td>corrosive, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td>strong acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-365-19</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine, resublimed crystals</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41955</td>
			<td>environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mestre Mnova</td>
			<td>MestreLab Research</td>
			<td></td>
			<td>software for processing NMR spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>439193-4L</td>
			<td>flammable, toxic, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td>microscopy stain for staining cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>B21176X</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton broth</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>DF0757-17-6</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>22-310397</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Synthesis Labstation</td>
			<td>MILESTONE</td>
			<td>START SYNTH</td>
			<td>device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tubes</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z562769-5EA</td>
			<td>5mm NMR tubes 600 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Resonance (NMR)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Ascend 400</td>
			<td>large superconducting magnet (400MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optochin</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>AAB21627MC</td>
			<td>ethylhydrocupreine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petrie plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229695</td>
			<td>for preparing agar plates for bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for morphology studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puriFlash</td>
			<td>interchim</td>
			<td>XS520plus</td>
			<td>flash chromatography purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resazurin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R7017-1G</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Hei-VAP Value &#34;The Collegiate&#34;</td>
			<td>solvent evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td>irritant, white powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>S271-1</td>
			<td>crystalline, colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>7985592-500G</td>
			<td>anhydrous, granular, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitney DG250 Workstation</td>
			<td>Microbiology International</td>
			<td>DG250</td>
			<td>anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Lite (blue) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for acquiring micrographs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth

细菌细胞壁中的肽聚糖（PG）是一种独特的大分子结构，赋予形状和保护周围环境。了解细胞生长和分裂的核心是了解PG降解如何影响生物合成和细胞壁组装。最近，已经报道了通过引入改性糖或氨基酸来标记PG的代谢标记。虽然用小分子抑制剂对生物合成步骤进行化学询问是可能的，但研究自身溶酶降解PG的化学生物学工具尚不发达。细菌自溶素是一类广泛的酶，参与PG的紧密协调降解。这里提出了制备小分子探针masarimycin的详细方案，masarimycin是 枯草芽孢杆菌 中N-乙酰葡萄糖苷酶LytG的抑制剂，以及 肺炎链球菌中的细胞壁代谢。 提供通过 微波辅助和经典有机合成制备抑制剂的方法。介绍了其作为研究生物测定中革兰氏阳性生理学的工具的适用性。

马萨里霉素是枯草芽孢杆菌和肺炎链球菌的小分子抑菌抑制剂，已被证明可抑制枯草芽孢杆菌35，37中的外效GlcNAcase LytG，并靶向肺炎链球菌37中的细胞壁。马沙霉素可以通过经典或微波辅助有机合成有效制备，收率在55%-70%范围内。微波辅助合成的优点是可以显著缩短合成化合物的时间。微波辅助合成将合成?...

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Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

提出了制备抑菌二酰胺马萨霉素的详细方案，马萨里霉素是一种小分子探针，通过靶向细胞壁降解来抑制 枯草芽孢杆菌 和 肺炎链球菌 的生长。其作为化学探针的应用在与 枯草芽孢杆菌 和 肺炎链球菌的协同作用/拮抗作用测定和形态学研究中得到证明。

马萨霉素的合成，一种革兰氏阳性细菌生长的小分子抑制剂

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

马萨里霉素是为数不多的阻止细菌细胞生长的细菌自身溶解素抑制剂之一。它可用于研究自身溶酶的化学和遗传失活之间的差异，并为研究细菌生理学的遗传学提供了一种正交的方法。马萨霉素的合成可能看起来令人生畏。请严格按照所示步骤操作。当怀疑反应步骤是否有效时，通过薄层色谱法确认RF值的变化。首先，在甲醇中制备0.1摩尔环己胺，环己基甲醛，邻碘苯甲酸和环己基异腈溶液。加入磁力搅拌棒，然后将五毫升环己胺和五毫升环己基甲醛混合在带盖的圆底烧瓶中，并将烧瓶置于热板搅拌器上的沙浴中，在40摄氏度下30分钟。使用放置在沙子表面以下约一厘米的温度计监测温度。30分钟后，向溶液中加入五毫升环己基异氰化物，并在50摄氏度下再搅拌20分钟。然后，向反应混合物中加入五毫升邻碘苯甲酸，并继续在55摄氏度下搅拌三至五小时。搅拌三小时后，通过薄层色谱法或TLC以大约一小时的间隔定期监测反应的进展。当TLC板上只有一个保留因子等于0.3的点可见时，考虑反应完成。减压除去旋转蒸发器中的溶剂。一旦所有甲醇蒸发，将干燥的粗产品溶解在30毫升乙酸乙酯中，并将其转移到分液漏斗中。依次用单摩尔盐酸、水、饱和碳酸氢钠溶液、水、饱和氯化钠溶液依次提取乙酸乙酯，每次提取时丢弃水层。然后，从分液漏斗中取出乙酸乙酯层并将其收集在锥形瓶中。加入充满无水硫酸钠的刮刀，以除去乙酸乙酯中的残留水分。通过一号滤纸过滤干燥的乙酸乙酯溶液，以除去硫酸钠。然后，用少量乙酸乙酯清洗滤纸。过滤后的乙酸乙酯溶液在减压旋转蒸发器上蒸发至干，一旦除去所有乙酸乙酯，即得油状马萨利霉素。将马萨霉素油溶解在一至两毫升的9：1己烷中至异丙醇溶液中，并在磁力搅拌板上搅拌，直到整个化合物溶解。为了纯化溶解的马沙霉素，使用12克正相二氧化硅闪光柱进行快速色谱。用10列体积的流动相平衡闪蒸柱，仪器以每分钟15毫升的流速设置。平衡完成后，使用五毫升注射器抽取溶解的马沙霉素。将注射器直接连接到平衡的闪蒸柱的顶部，并将溶液注入塔中。将上样柱重新连接到闪光色谱系统并启动梯度洗脱。从色谱柱中洗脱马沙霉素，使用梯度洗脱至最终流动相浓度为10∶90的己烷至异丙醇超过12柱体积。通过吸收监测马萨利霉素在230和254纳米的洗脱。对于形态学研究，在37摄氏度的LB琼脂平板上生长枯草芽孢杆菌11774。在所有后续实验中，使用在五毫升LB肉汤中生长的第二代细胞，直到600纳米处的光密度达到1。接下来，使用移液管，将马沙霉素加入到标记处理的培养管中，最终浓度为3.8微摩尔。对于标记的培养管对照，添加等量的DMSO。将样品置于37摄氏度的培养箱中90分钟，并以150 RPM振荡。90分钟后，将培养物化学固定在培养基和固定缓冲液的1：10混合物中，在4摄氏度下过夜。第二天，使用移液器将10至20微升化学固定样品施加到玻璃显微镜载玻片上，并使其风干。然后，通过使用本生燃烧器加热载玻片来热固定风干样品。热固后，用100微升0.1%亚甲基蓝染色样品。与污渍一起孵育10分钟后，用蒸馏水洗去多余的染料。然后，在烤箱中轻轻加热染色载玻片至60摄氏度15至20分钟，将细胞带到共同的焦平面。通过在染色细胞上放置显微镜盖玻片来密封染色的样品。然后，使用显微镜载玻片水泥密封边缘。将密封的显微镜载玻片放在显微镜载物台上，并使用明场显微镜以100倍放大倍率将图像聚焦。在显微镜载玻片上滴一滴浸油，并使用1000X放大倍率将视场聚焦。使用连接到显微镜及其相关软件的相机获取显微照片。使用软件的自动白平衡和光圈设置采集图像。快速色谱法可以快速纯化高纯度的马萨霉素。本文介绍了肺炎链球菌中与 ATP 酶抑制剂 optochin 的协同作用或拮抗作用的评估。抑制细菌生长的化合物的最低浓度，以蓝色表示，被认为是在存在共药的情况下的最小抑制浓度值。相反，粉红色的孔表示细菌生长。使用马沙霉素的表型测定是最低抑制浓度的0.75倍，显示枯草芽孢杆菌具有香肠样表型，肺炎链球菌具有结块表型。注意反应的温度。通过TLC监测确保反应完成。该方法可以与荧光标记的抗生素结合使用，通过显微镜检查细胞壁的变化。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

小分子结合蛋白的鉴定在天然细胞环境由活细胞光亲和标记

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

科研

生物化学

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

方法确定HCN1和TRIP8b之间蛋白 - 蛋白相互作用的小分子抑制剂

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

使用硝酸纤维素结合分析细菌组氨酸激酶自身磷酸化的定量分析

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

增强组织样品使用组合前体同位素标记和标记等压的复用（cPILOT）

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

一种用于小数目造血干细胞的西方印迹协议

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

自组装的人类蛋白质微阵列中的激酶抑制剂筛选

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

用于筛选小分子抑制剂的NADH耦合ATPase分析的半高通量自适应

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

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OaAEP1介导酶合成和聚合蛋白固定，用于单分子力光谱

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

单分子鱼的转录活性等位基因单细胞分析

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2亲和力纯化与革兰阳性细菌中的RNA测序相结合

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...