Name: synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth at JoVE.com

Forskningen blev støttet af National Science Foundation under bevillingsnummer 2009522. NMR-analyse af masarimycin blev støttet af National Science Foundation store forskningsinstrumenteringsprogramtildeling under bevillingsnummer 1919644. Eventuelle meninger, resultater og konklusioner eller anbefalinger, der udtrykkes i dette materiale, er forfatternes og afspejler ikke nødvendigvis National Science Foundations synspunkter.

1. Generelle metoder
BEMÆRK: Alle forbindelser blev købt hos standardleverandører og brugt uden yderligere rensning.
<ol><li>Udfør tyndtlagskromatografi (TLC) på en aluminiumsplade forbelagt med silicagel XG F254. Registrer pletter under en UV-lampe, ved nedsænkning i p-anisaldehydplet eller ved at udsætte for I2-damp.</li>
	<li>Optag alle NMR-spektre (nuclear magnetic resonance) på et 400 MHz spektrometer. BEMÆRK: 1H-NMR og 13...

Masarimycin er en enkelt mikromolær bakteriostatisk hæmmer af B. subtilis35 og S. pneumoniae37 vækst. I B. subtilis har masarimycin vist sig at hæmme GlcNAcase LytG35, mens det præcise molekylære mål i cellevæggen hos S. pneumoniae ikke er blevet identificeret37. Syntese af masarimycin ved hjælp af enten den klassiske organiske syntese eller mikrobølgeprocedure giver hæmmeren i godt udbytt...

Peptidoglycan (PG) er en mesh-lignende polymer, der afgrænser celleform og struktur i både Gram-positive og Gram-negative bakterier 1,2. Denne heteropolymer er en matrix af aminosukker, der er tværbundet af korte peptider 3,4,5,6 med en rygrad sammensat af β(1,4)-bundne vekslende N-acetylglucosamin (GlcNAc) og N-acetylmuraminsyre (MurNAc) rester (figur 1)1. Vedhæftet til C-3 lactyl moiety af MurNAc er stammepeptidet. Metabolismen af PG involverer et tæt koordineret system af biosyntetiske og nedbrydende enzymer til at inkorporere nyt materiale i cellevæggen 7,8. Nedbrydning af PG udføres af enzymer, der kollektivt betegnes som autolysiner9 og yderligere klassificeres baseret på specificiteten af den spaltede binding. Autolysiner deltager i mange cellulære processer, herunder cellevækst, celledeling, bevægelighed, PG-modning, kemotaxis, proteinsekretion, genetisk kompetence, differentiering og patogenicitet10,11. Unraveling de specifikke biologiske funktioner af individuelle autolysiner kan være skræmmende, delvis på grund af funktionel redundans. Nylige biofysiske 8,12,13 og beregningsmæssige undersøgelser12 har imidlertid givet ny indsigt i deres roller i PG-metabolisme. Derudover har nylige rapporter givet yderligere indsigt i syntesen14 og membranmedieret 15,16,17 trin i PG-metabolisme. En grundig forståelse af forholdet mellem nedbrydende og syntetiske veje for PG-metabolisme kan give anledning til tidligere uudnyttede antibiotikamål.
Mens der har været betydelige fremskridt i metodologi til undersøgelse af glykobiologi i eukaryoter, har bakteriel glykobiologi og især PG-metabolisme ikke udviklet sig med en lignende hastighed. Nuværende kemiske tilgange til undersøgelse af PG-metabolisme omfatter fluorescerende mærkede antibiotika18, fluorescerende sonder19,20 og metabolisk mærkning 21,22,23,24. Disse nye tilgange giver nye måder at forhøre bakteriel cellevægmetabolisme på. Mens nogle af disse strategier er i stand til at mærke PG in vivo, kan de være artsspecifikke19 eller kun arbejde i stammer, der mangler en bestemt autolysin25. Mange PG-mærkningsstrategier er beregnet til brug med isolerede cellevægge26 eller med in vitro-rekonstituerede PG-biosynteseveje 20,27,28. Anvendelsen af fluorescerende mærkede antibiotika er i øjeblikket begrænset til biosyntetiske trin og transpeptidering18.
Den nuværende viden om bakterielle autolysiner og deres rolle i cellevægsmetabolisme kommer fra genetisk og in vitro biokemisk analyse 11,29,30,31,32. Mens disse tilgange har givet et væld af oplysninger om denne vigtige klasse af enzymer, kan det være udfordrende at dechiffrere deres biologiske rolle. På grund af funktionel redundans33 resulterer sletning af en autolysin f.eks. i de fleste tilfælde ikke i at standse bakterievæksten. Dette er på trods af deres underforståede rolle i cellevækst og deling 7,12. En anden komplikation er, at genetisk deletion af bakterielle autolysiner kan give anledning til metafænotyper34. Metafænotyper opstår fra det komplekse samspil mellem den vej, der påvirkes af den genetiske deletion og andre indbyrdes forbundne veje. For eksempel kan en metafænotype opstå via en direkte effekt som manglen på et enzym eller en indirekte effekt såsom en forstyrrelse af regulatorer.
I øjeblikket er der kun få hæmmere af glycosidase autolysiner, såsom N-acetylglucosaminidaser (GlcNAcase) og N-acetylmuramidaser, som kan bruges som kemiske sonder til at studere nedbrydningen af PG. For at imødegå dette er diamidmasarimycin (tidligere betegnet som fgkc) blevet identificeret og karakteriseret35 som en bakteriostatisk hæmmer af Bacillus subtilis vækst, der er rettet mod GlcNAcase LytG32 (figur 1). LytG er en exo-virkende GlcNAcase36, et medlem af klynge 2 inden for glycosylhydrolasefamilie 73 (GH73). Det er den største aktive GlcNAcase under vegetativ vækst32. Så vidt vi ved, er masarimycin den første hæmmer af en PG-virkende GlcNAcase, der hæmmer cellulær vækst. Yderligere undersøgelser af masarimycin med Streptococcus pneumoniae viste, at masarimycin sandsynligvis hæmmer cellevægsmetabolismen i denne organisme37. Her rapporteres fremstillingen af masarimycin til brug som kemisk biologisk sonde til undersøgelse af fysiologi i de grampositive organismer B. subtilis og S. pneumoniae. Eksempler på morfologisk analyse af sub-minimum hæmmende koncentrationsbehandling med masarimycin samt et synergi/antagonisme-assay præsenteres. Synergi og antagonisme assays ved hjælp af antibiotika med veldefinerede virkningsmåder kan være en nyttig måde at udforske forbindelser mellem cellulære processer 38,39,40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Iodobenzoic acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I7675-25G</td>
			<td>corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>109827-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum backed silica plates</td>
			<td>Sorbtech</td>
			<td>4434126</td>
			<td>silica gel XG F254 on aluminum backed plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform-d</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>151823-50G</td>
			<td>solvent for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Mass Spectrometer</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>Advion CMS</td>
			<td>compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>07-200-90</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-547</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexanecarboxaldehyde</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L INC.</td>
			<td>24451</td>
			<td>flammable, irritant, colorless to pink liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl isocyanide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>133302-5G</td>
			<td>irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexylamine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>240648-100ML</td>
			<td>corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>537446-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flash silica cartridge (12g)</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>PF-50SIHP-F0012</td>
			<td>pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>fixing agent for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H8651-25G</td>
			<td>buffer for microscopy fixing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, mixture of isomers</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>178918-4L</td>
			<td>environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance compact mass spectrometer</td>
			<td>Advion</td>
			<td>expression</td>
			<td>Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vac</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>Vacufuge plus</td>
			<td>vacuum aided by centrifugal force and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>258148-2.5L</td>
			<td>corrosive, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td>strong acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-365-19</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine, resublimed crystals</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41955</td>
			<td>environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mestre Mnova</td>
			<td>MestreLab Research</td>
			<td></td>
			<td>software for processing NMR spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>439193-4L</td>
			<td>flammable, toxic, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td>microscopy stain for staining cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>B21176X</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton broth</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>DF0757-17-6</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>22-310397</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Synthesis Labstation</td>
			<td>MILESTONE</td>
			<td>START SYNTH</td>
			<td>device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tubes</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z562769-5EA</td>
			<td>5mm NMR tubes 600 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Resonance (NMR)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Ascend 400</td>
			<td>large superconducting magnet (400MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optochin</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>AAB21627MC</td>
			<td>ethylhydrocupreine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petrie plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229695</td>
			<td>for preparing agar plates for bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for morphology studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puriFlash</td>
			<td>interchim</td>
			<td>XS520plus</td>
			<td>flash chromatography purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resazurin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R7017-1G</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Hei-VAP Value &#34;The Collegiate&#34;</td>
			<td>solvent evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td>irritant, white powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>S271-1</td>
			<td>crystalline, colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>7985592-500G</td>
			<td>anhydrous, granular, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitney DG250 Workstation</td>
			<td>Microbiology International</td>
			<td>DG250</td>
			<td>anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Lite (blue) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for acquiring micrographs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth

Peptidoglycan (PG) i bakteriernes cellevæg er en unik makromolekylær struktur, der giver form og beskyttelse mod det omgivende miljø. Centralt for at forstå cellevækst og -deling er viden om, hvordan PG-nedbrydning påvirker biosyntese og cellevægssamling. For nylig er den metaboliske mærkning af PG gennem introduktion af modificerede sukkerarter eller aminosyrer blevet rapporteret. Mens kemisk forhør af biosyntetiske trin med små molekylehæmmere er mulig, er kemiske biologiske værktøjer til at studere PG-nedbrydning af autolysiner underudviklede. Bakterielle autolysiner er en bred klasse af enzymer, der er involveret i den tæt koordinerede nedbrydning af PG. Her præsenteres en detaljeret protokol til fremstilling af en lille molekylesonde, masarimycin, som er en hæmmer af N-acetylglucosaminidase LytG i Bacillus subtilis og cellevægsmetabolisme i Streptococcus pneumoniae. Fremstilling af inhibitoren via mikrobølgeassisteret og klassisk organisk syntese tilvejebringes. Dens anvendelighed som et redskab til at studere gram-positiv fysiologi i biologiske assays præsenteres.

Masarimycin er et lille molekyle bakteriostatisk hæmmer af B. subtilis og S. pneumoniae og har vist sig at hæmme den exo-virkende GlcNAcase LytG i B. subtilis35,37 og målrette cellevæggen i S. pneumoniae37. Masarimycin kan fremstilles effektivt enten ved den klassiske eller mikrobølgeassisterede organiske syntese med udbytter i intervallet 55%-70%. Mikrobølgeassisteret syntese har fordelen ved en s...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth at JoVE.com

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

En detaljeret protokol præsenteres til fremstilling af det bakteriostatiske diamid masarimycin, en lille molekylesonde, der hæmmer væksten af Bacillus subtilis og Streptococcus pneumoniae ved at målrette cellevægnedbrydning. Dens anvendelse som en kemisk sonde er påvist i synergi / antagonisme assays og morfologiske undersøgelser med B. subtilis og S. pneumoniae.

Syntese af Masarimycin, en lille molekylehæmmer af grampositiv bakterievækst

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Masarimycin er en af de få hæmmere af bakterielle autolysiner, der stopper bakteriecellevækst. Det kan bruges til at undersøge forskellene mellem kemisk og genetisk inaktivering af autolysiner og giver en ortogonal tilgang til genetik for at studere bakteriel fysiologi. Syntese af masarimycin kan virke skræmmende.Følg nøje de viste trin. Hvis du er i tvivl om, hvornår et reaktionstrin fungerede, skal du bekræfte ved tyndtlagskromatografi og ændringerne i RF-værdier. Til at begynde med fremstilles en 0,1-molær opløsning af cyclohexylamin, cyclohexylcarboxaldehyd, ortho-iodobenzoesyre og cyclohexylisocyanid i methanol.Der tilsættes magnetisk omrøringsstang, og kolben blandes derefter fem ml cyclohexylcarboxaldehyd i en lukket rundbundet kolbe, og kolben anbringes i et sandbad på en kogepladeomrører i 30 minutter ved 40 grader Celsius. Overvåg temperaturen ved hjælp af et termometer placeret cirka en centimeter under sandoverfladen. Efter 30 minutter tilsættes fem ml cyclohexylisocyanid til opløsningen og omrøres i yderligere 20 minutter ved 50 grader Celsius.Derefter tilsættes fem milliliter ortho-iodobenzoesyre til reaktionsblandingen og omrøres ved 55 grader Celsius i tre til fem timer. Efter tre timers omrøring overvåges reaktionens fremskridt med jævne mellemrum ved tyndtlagskromatografi eller TLC med ca. en times mellemrum. Betragt reaktionen som fuldført, når kun ét sted med en retentionsfaktor svarende til 0,3 er synligt på TLC-pladen.Fjern opløsningsmidlet i roterende fordamper under reduceret tryk. Når al methanol er fordampet, opløses det tørrede råprodukt i 30 ml ethylacetat og overføres til en separatortragt. Ekstrakt ethylacetat sekventielt med en-molær saltsyre, vand, mættet natriumbicarbonatopløsning, vand igen og mættet natriumchloridopløsning, idet de vandige lag kasseres ved hver ekstraktion.Fjern derefter ethylacetatlaget fra separationstragten og opsaml det i en Erlenmeyer-kolbe. Tilsæt en spatel fuld af vandfrit natriumsulfat for at fjerne resterende vand fra ethylacetat. Filtrer den tørrede ethylacetatopløsning gennem et filterpapir nummer et for at fjerne natriumsulfatet.Vask derefter filterpapiret med en lille mængde ethylacetat. Den filtrerede ethylacetatopløsning blev fordampet til tørhed på en roterende fordamper under reduceret tryk for at opnå masarimycin som olie, når alt ethylacetat er fjernet. Masarimycinolien opløses i en til to ml 9:1 hexan til isopropanolopløsning og omrøres på en magnetisk omrøringsplade, indtil hele forbindelsen er opløst.For at rense den opløste masarimycin skal du udføre flashkromatografi med en 12 gram, normalfase, silicaflashsøjle. Ligevægt flashkolonnen med 10 kolonnevolumener af mobil fase med instrumenterne indstillet til en strømningshastighed på 15 ml pr. Minut. Når ligevægten er afsluttet, trækkes den opløste masarimycin ved hjælp af en sprøjte på fem milliliter.Tilslut sprøjten direkte til toppen af den ligevægtede flashsøjle og injicer opløsningen i søjlen. Tilslut den indlæste kolonne til flashkromatografisystemet igen, og start gradientelueringen. Elute masarimycin fra kolonnen ved hjælp af gradienteluering til en endelig mobil fasekoncentration på 10:90 hexan til isopropanol over 12 kolonnevolumener.Overvåg eluering af masarimycin via absorption ved 230 og 254 nanometer. Til morfologiundersøgelsen vokser bacillus subtilis 11774 på LB agarplader ved 37 grader Celsius. I alle efterfølgende eksperimenter skal du bruge andenpassageceller dyrket i fem milliliter LB bouillon, indtil den optiske densitet ved 600 nanometer når 1.Derefter tilsættes masarimycin til kulturrørene mærket behandlet til en endelig koncentration på 3,8 mikromol ved hjælp af en pipette. For kulturrør mærket kontrol, tilføj et tilsvarende volumen DMSO. Anbring prøverne i en inkubator ved 37 grader Celsius i 90 minutter med omrystning ved 150 o / min.Efter 90 minutter fastgøres kulturerne kemisk i en 1:10 blanding af kulturmedier og fikseres buffer ved fire grader Celsius natten over. Den følgende dag skal du bruge en pipette til at påføre 10 til 20 mikroliter af de kemisk faste prøver på glasmikroskopdias og lade dem lufttørre. Derefter opvarmes de lufttørrede prøver ved at opvarme glasglider ved hjælp af en Bunsen-brænder.Efter varmefastgørelse farves prøverne med 100 mikroliter 0,1% methylenblåt. Efter en 10 minutters inkubation med pletten vaskes det overskydende farvestof væk med destilleret vand. Opvarm derefter forsigtigt de farvede dias til 60 grader Celsius i en ovn i 15 til 20 minutter for at bringe cellerne til et fælles brændplan.Forsegl de farvede prøver ved at placere et mikroskopdæksel glide over de farvede celler. Forsegl derefter kanterne ved hjælp af mikroskop glidecement. Placer det forseglede mikroskopdias på mikroskopstadiet, og bring billedet i fokus ved 100X forstørrelse ved hjælp af lysfeltmikroskopi.Placer en dråbe nedsænkningsolie på mikroskopets dias, og bring synsfeltet i fokus ved hjælp af 1000X forstørrelse. Erhverv mikrografer ved hjælp af et kamera, der er fastgjort til mikroskopet og dets tilhørende software. Hent billeder ved hjælp af softwarens indstillinger for automatisk hvidbalance og blænde.Flashkromatografi muliggør hurtig rensning af masarimycin med høj renhed. Evaluering af synergi eller antagonisme med ATPase-hæmmeren optochin i S.pneumoniae præsenteres her. Den laveste koncentration af forbindelsen til at hæmme bakterievækst, indikeret af den blå farve, betragtes som den mindste hæmmende koncentrationsværdi i nærvær af et co-lægemiddel.I modsætning hertil indikerer brønde med lyserød farve bakterievækst. Fænotypiske assays ved anvendelse af masarimycin ved 0,75 gange de mindste hæmmende koncentrationer viste en pølselignende fænotype for B.subtilis og en klumpende fænotype for S.pneumoniae. Vær opmærksom på reaktionens temperatur.Sørg for, at reaktionen er fuldført ved at overvåge med TLC. Denne metode kan bruges sammen med fluorescerende mærkede antibiotika til at undersøge ændringer i cellevæggen ved mikroskopi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifikation af små molekyler-bindende proteiner i en Native Cellular Environment af live-cell fotoaffinitetsmærkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Fremgangsmåde til at identificere småmolekylære inhibitorer af protein-protein-vekselvirkning mellem HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantificering af Bakteriel Histidin kinase Autophosphorylering Ved hjælp af en Nitrocellulose-bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Forbedret Prøve Multiplexing af væv under anvendelse kombinerede Precursor isotopmærkning og isobar Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En Western Blotting-protokollen for et lille antal hæmatopoietisk stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinasehæmmer screening i selv monterede humane protein mikrosystemer

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-gennemløb tilpasning af NADH-koblede ATPase assay til screening små molekyle hæmmere

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-Medieret enzymatisk syntese og immobilisering af polymeriseret protein til enkeltmolekylet spektroskopi

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Affinitetsrensning kombineret med RNA-sekventering i gram-positive bakterier

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...