Name: synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth at JoVE.com

Onderzoek werd ondersteund door de National Science Foundation onder subsidienummer 2009522. NMR-analyse van masarimycine werd ondersteund door de National Science Foundation major research instrumentation program award onder subsidienummer 1919644. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden geuit, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van de National Science Foundation.

1. Algemene methoden
OPMERKING: Alle verbindingen werden gekocht bij standaardleveranciers en gebruikt zonder verdere zuivering.
<ol><li>Voer dunnelaagchromatografie (TLC) uit op een aluminiumplaat die is voorgecoat met silicagel XG F254. Detecteer vlekken onder een UV-lamp, door onderdompeling in p-anisaldehydevlek of door blootstelling aan I2-damp.</li>
	<li>Registreer alle nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectra op een 400 MHz spectrometer. O...

Masarimycine is een enkele micromolaire bacteriostatische remmer van B. subtilis35 en S. pneumoniae37 groei. Bij B. subtilis is aangetoond dat masarimycine de GlcNAcase LytG35 remt, terwijl het precieze moleculaire doelwit in de celwand van S. pneumoniae niet is geïdentificeerd37. Synthese van masarimycine met behulp van de klassieke organische synthese of microgolfprocedure biedt de remmer een goed...

Peptidoglycaan (PG) is een mesh-achtig polymeer dat celvorm en -structuur afbakent in zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën 1,2. Dit heteropolymeer is een matrix van aminosuikers die door korte peptiden 3,4,5,6 worden verknoopt met een ruggengraat die bestaat uit β-(1,4)-gebonden afwisselende N-acetylglucosamine (GlcNAc) en N-acetylmuramic acid (MurNAc) residuen (Figuur 1)1. Aan het C-3 lactylgedeelte van MurNAc is het stengelpeptide bevestigd. Het metabolisme van PG omvat een strak gecoördineerd systeem van biosynthetische en degradatieve enzymen om nieuw materiaal in de celwand op te nemen 7,8. Afbraak van PG wordt uitgevoerd door enzymen die gezamenlijk autolysines9 worden genoemd en verder worden geclassificeerd op basis van de specificiteit van de gesplitste binding. Autolysinen nemen deel aan vele cellulaire processen, waaronder celgroei, celdeling, beweeglijkheid, PG-rijping, chemotaxis, eiwitsecretie, genetische competentie, differentiatie en pathogeniciteit10,11. Het ontrafelen van de specifieke biologische functies van individuele autolysines kan ontmoedigend zijn, deels als gevolg van functionele redundantie. Recente biofysische 8,12,13 en computationele studies12 hebben echter nieuw inzicht gegeven in hun rol in het PG-metabolisme. Daarnaast hebben recente rapporten meer inzicht gegeven in de synthese14 en membraangemedieerde 15,16,17 stappen in PG-metabolisme. Een grondig begrip van de relatie tussen degradatieve en synthetische routes van PG-metabolisme zou aanleiding kunnen geven tot eerder onaangeboorde antibioticadoelen.
Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt in de methodologie om glycobiologie in eukaryoten te bestuderen, is bacteriële glycobiologie en in het bijzonder PG-metabolisme niet in een vergelijkbaar tempo gevorderd. Huidige chemische benaderingen om pg-metabolisme te bestuderen omvatten fluorescerend gelabelde antibiotica18, fluorescerende sondes19,20 en metabole etikettering 21,22,23,24. Deze nieuwe benaderingen bieden nieuwe manieren om het bacteriële celwandmetabolisme te ondervragen. Hoewel sommige van deze strategieën in staat zijn om PG in vivo te labelen, kunnen ze soortspecifiek19 zijn, of alleen werken bij stammen zonder een bepaalde autolysine25. Veel PG-etiketteringsstrategieën zijn bedoeld voor gebruik met geïsoleerde celwanden26 of met in vitro gereconstitueerde PG-biosyntheseroutes 20,27,28. Het gebruik van fluorescerend gelabelde antibiotica is momenteel beperkt tot biosynthetische stappen en transpeptidatie18.
De huidige kennis van bacteriële autolysines en hun rol in het celwandmetabolisme komt uit genetische en in vitro biochemische analyse 11,29,30,31,32. Hoewel deze benaderingen een schat aan informatie hebben opgeleverd over deze belangrijke klasse van enzymen, kan het ontcijferen van hun biologische rol een uitdaging zijn. Bijvoorbeeld, als gevolg van functionele redundantie33, deletie van een autolysine resulteert in de meeste gevallen niet in het stoppen van de bacteriegroei. Dit ondanks hun impliciete rol in celgroei en deling 7,12. Een andere complicatie is dat genetische deletie van bacteriële autolysines aanleiding kan geven tot metafenotypen34. Metafenotypen komen voort uit het complexe samenspel tussen de route die wordt beïnvloed door de genetische deletie en andere onderling verbonden paden. Zo kan een metafenotype ontstaan via een direct effect zoals het ontbreken van een enzym, of een indirect effect zoals een verstoring van regulatoren.
Momenteel zijn er slechts een paar remmers van glycosidase autolysinen zoals N-acetylglucosaminidasen (GlcNAcase) en N-acetylmuramidases, die kunnen worden gebruikt als chemische sondes om de afbraak van PG te bestuderen. Om dit aan te pakken, is de diamide masarimycine (voorheen aangeduid als fgkc) geïdentificeerd en gekarakteriseerd35 als een bacteriostatische remmer van Bacillus subtilis groei die zich richt op de GlcNAcase LytG32 (figuur 1). LytG is een exo-werkende GlcNAcase36, een lid van cluster 2 binnen glycosylhydrolasefamilie 73 (GH73). Het is de belangrijkste actieve GlcNA-zaak tijdens vegetatieve groei32. Voor zover wij weten, masarimycine is de eerste remmer van een PG-werkende GlcNAcase die de cellulaire groei remt. Aanvullende studies van masarimycine met Streptococcus pneumoniae vonden dat masarimycine waarschijnlijk het celwandmetabolisme in dit organisme remt37. Hier wordt de bereiding van masarimycine gerapporteerd voor gebruik als een chemische biologiesonde om de fysiologie te bestuderen in de Gram-positieve organismen B. subtilis en S. pneumoniae. Voorbeelden van morfologische analyse van subminimale remmende concentratiebehandeling met masarimycine, evenals een synergie / antagonisme-assay worden gepresenteerd. Synergie- en antagonismetests met behulp van antibiotica met goed gedefinieerde werkingsmechanismen kunnen een nuttige manier zijn om verbanden tussen cellulaire processen te onderzoeken 38,39,40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Iodobenzoic acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I7675-25G</td>
			<td>corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>109827-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum backed silica plates</td>
			<td>Sorbtech</td>
			<td>4434126</td>
			<td>silica gel XG F254 on aluminum backed plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform-d</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>151823-50G</td>
			<td>solvent for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Mass Spectrometer</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>Advion CMS</td>
			<td>compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>07-200-90</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-547</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexanecarboxaldehyde</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L INC.</td>
			<td>24451</td>
			<td>flammable, irritant, colorless to pink liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl isocyanide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>133302-5G</td>
			<td>irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexylamine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>240648-100ML</td>
			<td>corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>537446-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flash silica cartridge (12g)</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>PF-50SIHP-F0012</td>
			<td>pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>fixing agent for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H8651-25G</td>
			<td>buffer for microscopy fixing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, mixture of isomers</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>178918-4L</td>
			<td>environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance compact mass spectrometer</td>
			<td>Advion</td>
			<td>expression</td>
			<td>Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vac</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>Vacufuge plus</td>
			<td>vacuum aided by centrifugal force and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>258148-2.5L</td>
			<td>corrosive, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td>strong acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-365-19</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine, resublimed crystals</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41955</td>
			<td>environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mestre Mnova</td>
			<td>MestreLab Research</td>
			<td></td>
			<td>software for processing NMR spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>439193-4L</td>
			<td>flammable, toxic, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td>microscopy stain for staining cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>B21176X</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton broth</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>DF0757-17-6</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>22-310397</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Synthesis Labstation</td>
			<td>MILESTONE</td>
			<td>START SYNTH</td>
			<td>device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tubes</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z562769-5EA</td>
			<td>5mm NMR tubes 600 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Resonance (NMR)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Ascend 400</td>
			<td>large superconducting magnet (400MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optochin</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>AAB21627MC</td>
			<td>ethylhydrocupreine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petrie plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229695</td>
			<td>for preparing agar plates for bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for morphology studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puriFlash</td>
			<td>interchim</td>
			<td>XS520plus</td>
			<td>flash chromatography purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resazurin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R7017-1G</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Hei-VAP Value &#34;The Collegiate&#34;</td>
			<td>solvent evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td>irritant, white powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>S271-1</td>
			<td>crystalline, colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>7985592-500G</td>
			<td>anhydrous, granular, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitney DG250 Workstation</td>
			<td>Microbiology International</td>
			<td>DG250</td>
			<td>anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Lite (blue) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for acquiring micrographs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth

Peptidoglycan (PG) in de celwand van bacteriën is een unieke macromoleculaire structuur die vorm en bescherming tegen de omgeving verleent. Centraal in het begrijpen van celgroei en -deling staat de kennis van hoe PG-degradatie de biosynthese en celwandassemblage beïnvloedt. Onlangs is de metabole etikettering van PG door de introductie van gemodificeerde suikers of aminozuren gemeld. Hoewel chemische ondervraging van biosynthetische stappen met kleine molecuulremmers mogelijk is, zijn chemische biologie-instrumenten om PG-afbraak door autolysinen te bestuderen onderontwikkeld. Bacteriële autolysines zijn een brede klasse van enzymen die betrokken zijn bij de strak gecoördineerde afbraak van PG. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het voorbereiden van een sonde met kleine moleculen, masarimycine, een remmer van N-acetylglucosaminidase LytG in Bacillus subtilis, en celwandmetabolisme in Streptococcus pneumoniae. Bereiding van de remmer via microgolf-geassisteerde en klassieke organische synthese wordt verstrekt. De toepasbaarheid ervan als een hulpmiddel om Gram-positieve fysiologie in biologische assays te bestuderen, wordt gepresenteerd.

Masarimycine is een bacteriostatische remmer met klein molecuul van B. subtilis en S. pneumoniae en er is aangetoond dat het de exo-werkende GlcNAcase LytG in B. subtilis35,37 remt en zich richt op de celwand in S. pneumoniae37. Masarimycine kan efficiënt worden bereid door de klassieke of microgolfondersteunde organische synthese met opbrengsten in het bereik van 55% -70%. Microgolf-geassisteerde synth...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth at JoVE.com

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor het bereiden van de bacteriostatische diamide masarimycine, een kleine molecuul sonde die de groei van Bacillus subtilis en Streptococcus pneumoniae remt door zich te richten op de afbraak van de celwand. De toepassing ervan als chemische sonde wordt aangetoond in synergie/antagonisme assays en morfologische studies met B. subtilis en S. pneumoniae.

Synthese van masarimycine, een kleine molecuulremmer van grampositieve bacteriegroei

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Masarimycine is een van de weinige remmers van bacteriële autolysines die de groei van bacteriële cellen stopt. Het kan worden gebruikt om de verschillen tussen chemische en genetische inactivatie van autolysines te onderzoeken en biedt een orthogonale benadering van genetica om bacteriële fysiologie te bestuderen. Synthese van masarimycine kan ontmoedigend lijken.Volg nauwgezet de getoonde stappen. Bij twijfel of een reactiestap heeft gewerkt, bevestig dan door dunnelaagchromatografie en de veranderingen in RF-waarden. Bereid om te beginnen een 0,1-molaire oplossing van cyclohexylamine, cyclohexylcarboxaldehyde, ortho-joodbenzoëzuur en cyclohexylisocyanide in methanol.Voeg vervolgens de magnetische roerstaaf toe en meng vervolgens vijf milliliter cyclohexylamine en vijf milliliter cyclohexylcarboxaldehyde in een afgedekte kolf met ronde bodem en leg de kolf gedurende 30 minuten op een hete plaatroerder in een hete plaatroerder bij 40 graden Celsius. Controleer de temperatuur met behulp van een thermometer die ongeveer een centimeter onder het zandoppervlak is geplaatst. Voeg na 30 minuten vijf milliliter cyclohexylisocyanide toe aan de oplossing en roer nog eens 20 minuten bij 50 graden Celsius.Voeg vervolgens vijf milliliter ortho-joodbenzoëzuur toe aan het reactiemengsel en blijf drie tot vijf uur roeren bij 55 graden Celsius. Controleer na drie uur roeren periodiek de voortgang van de reactie door dunnelaagchromatografie of TLC met intervallen van ongeveer een uur. Beschouw de reactie als voltooid wanneer slechts één plek met een retentiefactor gelijk aan 0,3 zichtbaar is op de TLC-plaat.Verwijder het oplosmiddel in de roterende verdamper onder verlaagde druk. Zodra alle methanol is verdampt, lost u het gedroogde ruwe product op in 30 milliliter ethylacetaat en brengt u het over in een separatortrechter. Ethylacetaat achtereenvolgens extraheren met zoutzuur met één molair zoutzuur, water, verzadigde natriumbicarbonaatoplossing, water opnieuw en verzadigde natriumchlorideoplossing, waarbij de waterige lagen bij elke extractie worden weggegooid.Verwijder vervolgens de ethylacetaatlaag uit de scheitrechter en verzamel deze in een Erlenmeyer. Voeg een spatel vol watervrij natriumsulfaat toe om restwater uit ethylacetaat te verwijderen. Filtreer de gedroogde ethylacetaatoplossing door een nummer één filterpapier om het natriumsulfaat te verwijderen.Was vervolgens het filtreerpapier met een kleine hoeveelheid ethylacetaat. De gefilterde ethylacetaatoplossing werd verdampt tot droogheid op een roterende verdamper onder verminderde druk om masarimycine als olie te verkrijgen zodra al het ethylacetaat is verwijderd. Los de masarimycine-olie op in één tot twee milliliter van een 9:1 hexaan tot isopropanoloplossing en roer op een magnetische roerplaat totdat de gehele verbinding is opgelost.Om de opgeloste masarimycine te zuiveren, voert u flitschromatografie uit met een 12 gram, normale fase, silica-flitskolom. Breng de flitskolom in evenwicht met 10 kolomvolumes van de mobiele fase met de instrumenten ingesteld op een debiet van 15 milliliter per minuut. Nadat de equilibratie is voltooid, trekt u de opgeloste masarimycine op met een spuit van vijf milliliter.Sluit de spuit rechtstreeks aan op de bovenkant van de gebalanceerde flitskolom en injecteer de oplossing in de kolom. Sluit de geladen kolom opnieuw aan op het flitschromatografiesysteem en start de gradiëntelutie. Eluteer masarimycine uit de kolom met behulp van gradiëntelutie tot een uiteindelijke mobiele faseconcentratie van 10:90 hexaan tot isopropanol over 12 kolomvolumes.Controleer de elutie van masarimycine via absorptie bij 230 en 254 nanometer. Voor de morfologiestudie kweek je bacillus subtilis 11774 op LB-agarplaten bij 37 graden Celsius. Gebruik in alle volgende experimenten tweede-passagecellen gekweekt in vijf milliliter LB-bouillon totdat de optische dichtheid bij 600 nanometer 1 bereikt.Voeg vervolgens met behulp van een pipet masarimycine toe aan de kweekbuizen die zijn gelabeld tot een uiteindelijke concentratie van 3,8 micromol. Voeg voor kweekbuizen met het label controle een equivalent volume DMSO toe. Plaats de monsters in een couveuse bij 37 graden Celsius gedurende 90 minuten met schudden bij 150 RPM.Na 90 minuten fixeert u de culturen chemisch in een 1:10 mengsel van kweekmedia en fixeert u de buffer 's nachts op vier graden Celsius. Gebruik de volgende dag een pipet om 10 tot 20 microliter van de chemisch gefixeerde monsters op glazen microscoopglaasjes aan te brengen en ze aan de lucht te laten drogen. Breng vervolgens de luchtgedroogde monsters op warmte door de glasplaten te verwarmen met een Bunsen-brander.Na warmtefixatie bevlekt u de monsters met 100 microliter 0,1% methyleenblauw. Na een incubatietijd van 10 minuten met de vlek, spoel de overtollige kleurstof weg met gedestilleerd water. Verwarm vervolgens de bevlekte dia's voorzichtig tot 60 graden Celsius in een oven gedurende 15 tot 20 minuten om de cellen naar een gemeenschappelijk brandpuntsvlak te brengen.Verzegel de gekleurde monsters door een microscoopdeksel over de gekleurde cellen te plaatsen. Sluit vervolgens de randen af met microscoopglaascement. Plaats de verzegelde microscoopglaasjes op het microscooppodium en breng het beeld scherp met een vergroting van 100X met behulp van bright-field microscopie.Plaats een druppel onderdompelingsolie op de microscoopglaasjes en breng het gezichtsveld scherp met een vergroting van 1000X. Verkrijg microfoto's met behulp van een camera die aan de microscoop en de bijbehorende software is bevestigd. Verkrijg afbeeldingen met behulp van de automatische witbalans- en diafragma-instellingen van de software.Flashchromatografie zorgt voor een snelle zuivering van masarimycine met een hoge zuiverheid. Evaluatie van synergie of antagonisme met de ATPase-remmer optochin in S.pneumoniae wordt hier gepresenteerd. De laagste concentratie van de verbinding om de bacteriegroei te remmen, aangegeven door de blauwe kleur, wordt beschouwd als de minimale remmende concentratiewaarde in de aanwezigheid van een co-drug.Putten met roze kleur duiden daarentegen op bacteriegroei. Fenotypische assays met masarimycine bij 0,75 maal de minimale remmende concentraties toonden een worstachtig fenotype voor B.subtilis en een klonterend fenotype voor S.pneumoniae. Let op de temperatuur van de reactie.Zorg ervoor dat de reactie compleet is door te controleren met TLC. Deze methode kan worden gebruikt in combinatie met fluorescerend gelabelde antibiotica om veranderingen in de celwand door microscopie te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Methode voor het identificeren van kleinmoleculige remmers van het eiwit-eiwit interactie tussen HCN1 en TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kwantificering van bacteriële histidine kinase autofosforylering Met een Nitrocellulose bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Verbeterde Sample Multiplexing Weefsels gebruik van Gecombineerd Precursor isotopische labeling en Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Een Western Blotting Protocol voor kleine aantallen van hematopoietische stamcellen

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Een semi-High-throughput adaptatie van de NADH-gekoppelde ATPase-assay voor het screenen van kleine molecuul remmers

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Affinity Zuivering in combinatie met RNA Sequencing in Gram-Positieve Bacteriën

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...