Name: synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00
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Die Forschung wurde von der National Science Foundation unter der Fördernummer 2009522 unterstützt. Die NMR-Analyse von Masarimycin wurde durch den National Science Foundation Major Research Instrumentation Program Award unter der Fördernummer 1919644 unterstützt. Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material zum Ausdruck gebracht werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider.

1. Allgemeine Methoden
HINWEIS: Alle Compounds wurden von Standardlieferanten bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet.
<ol><li>Führen Sie eine Dünnschichtchromatographie (TLC) auf einer mit Kieselgel XG F254 vorbeschichteten Aluminiumplatte durch. Erkennen Sie Flecken unter einer UV-Lampe, durch Eintauchen in p-Anisaldehydflecken oder durch Aussetzen von I2-Dampf. </li>
	<li>Zeichnen Sie alle Kernspinresonanzspektren (NMR) auf einem 400-MHz-Spektro...

Masarimycin ist ein einzelner mikromolarer bakteriostatischer Inhibitor des Wachstums von B. subtilis 35 und S. pneumoniae37. In B. subtilis wurde gezeigt, dass Masarimycin das GlcNAcase LytG35 hemmt, während das genaue molekulare Ziel in der Zellwand von S. pneumoniae nicht identifiziertwurde 37. Die Synthese von Masarimycin entweder mit dem klassischen organischen Synthese- oder Mikrowellenverfahr...

Peptidoglycan (PG) ist ein netzartiges Polymer, das die Zellform und -struktur sowohl in grampositiven als auch in gramnegativen Bakterien 1,2 beschreibt. Dieses Heteropolymer ist eine Matrix von Aminozuckern, vernetzt durch kurze Peptide 3,4,5,6 mit einem Rückgrat, das aus β-(1,4)-verknüpften alternierenden N-Acetylglucosamin- (GlcNAc) und N-Acetylmuraminsäure (MurNAc)-Resten besteht (Abbildung 1)1. An den C-3-Lactylanteil von MurNAc ist das Stammpeptid gebunden. Der Metabolismus von PG beinhaltet ein eng koordiniertes System von biosynthetischen und abbaubaren Enzymen, um neues Material in die Zellwand einzubauen 7,8. Der Abbau von PG erfolgt durch Enzyme, die zusammen als Autolysine9 bezeichnet und basierend auf der Spezifität der gespaltenen Bindung weiter klassifiziert werden. Autolysine nehmen an vielen zellulären Prozessen teil, einschließlich Zellwachstum, Zellteilung, Motilität, PG-Reifung, Chemotaxis, Proteinsekretion, genetischer Kompetenz, Differenzierung und Pathogenität10,11. Die Entschlüsselung der spezifischen biologischen Funktionen einzelner Autolysine kann entmutigend sein, was zum Teil auf funktionelle Redundanz zurückzuführen ist. Jüngste biophysikalische 8,12,13 und Computerstudien 12 haben jedoch neue Einblicke in ihre Rolle im PG-Stoffwechsel geliefert. Darüber hinaus haben jüngste Berichte weitere Einblicke in die Synthese14 und membranvermittelten 15,16,17 Schritte im PG-Metabolismus gegeben. Ein gründliches Verständnis der Beziehung zwischen abbauenden und synthetischen Signalwegen des PG-Stoffwechsels könnte zu bisher unerschlossenen Antibiotikazielen führen.
Während es signifikante Fortschritte in der Methodik zur Untersuchung der Glykobiologie bei Eukaryoten gegeben hat, ist die bakterielle Glykobiologie und insbesondere der PG-Stoffwechsel nicht mit einer ähnlichen Geschwindigkeit fortgeschritten. Aktuelle chemische Ansätze zur Untersuchung des PG-Stoffwechsels umfassen fluoreszenzmarkierte Antibiotika18, fluoreszierende Sonden 19,20 und metabolische Markierung 21,22,23,24. Diese neuen Ansätze bieten neue Möglichkeiten, den bakteriellen Zellwandstoffwechsel zu hinterfragen. Während einige dieser Strategien in der Lage sind, PG in vivo zu markieren, können sie artspezifisch19 sein oder nur in Stämmen funktionieren, denen ein bestimmtes Autolysin25 fehlt. Viele PG-Markierungsstrategien sind für die Verwendung mit isoliertenZellwänden 26 oder mit in vitro rekonstituierten PG-Biosynthesewegen20,27,28 vorgesehen. Der Einsatz fluoreszierend markierter Antibiotika beschränkt sich derzeit auf biosynthetische Schritte und Transpeptidation18.
Das aktuelle Wissen über bakterielle Autolysine und ihre Rolle im Zellwandstoffwechsel stammt aus genetischen und in vitro biochemischen Analysen 11,29,30,31,32. Während diese Ansätze eine Fülle von Informationen über diese wichtige Klasse von Enzymen geliefert haben, kann die Entschlüsselung ihrer biologischen Rolle eine Herausforderung sein. Zum Beispiel führt die Deletion eines Autolysins aufgrund der funktionellen Redundanz33 in den meisten Fällen nicht dazu, dass das Bakterienwachstum gestoppt wird. Dies ist trotz ihrer impliziten Rolle beim Zellwachstum und der Zellteilung 7,12. Eine weitere Komplikation ist, dass die genetische Deletion von bakteriellen Autolysinen zu Meta-Phänotypen34 führen kann. Meta-Phänotypen entstehen aus dem komplexen Zusammenspiel zwischen dem von der genetischen Deletion betroffenen Signalweg und anderen miteinander verbundenen Wegen. Zum Beispiel kann ein Meta-Phänotyp über einen direkten Effekt wie das Fehlen eines Enzyms oder einen indirekten Effekt wie eine Störung der Regulatoren entstehen.
Derzeit gibt es nur wenige Inhibitoren von Glykosidasenautolysinen wie N-Acetylglucosaminidasen (GlcNAcase) und N-Acetylmuramidasen, die als chemische Sonden verwendet werden können, um den Abbau von PG zu untersuchen. Um dies zu beheben, wurde das Diamid-Masarimycin (früher als fgkc bezeichnet)identifiziert und 35 als bakteriostatischer Inhibitor des Bacillus subtilis-Wachstums charakterisiert, der auf das GlcNAcase LytG32 abzielt (Abbildung 1). LytG ist ein exo-wirkendes GlcNAcase36, ein Mitglied von Cluster 2 innerhalb der Glykosylhydrolasefamilie 73 (GH73). Es ist das wichtigste aktive GlcNAcase während des vegetativen Wachstums32. Unseres Wissens ist Masarimycin der erste Inhibitor eines PG-wirkenden GlcNAcase, der das Zellwachstum hemmt. Zusätzliche Studien von Masarimycin mit Streptococcus pneumoniae ergaben, dass Masarimycin wahrscheinlich den Zellwandstoffwechsel in diesem Organismushemmt 37. Hier wird die Herstellung von Masarimycin zur Verwendung als chemisch-biologische Sonde zur Untersuchung der Physiologie in den grampositiven Organismen B. subtilis und S. pneumoniae berichtet. Es werden Beispiele für die morphologische Analyse der Behandlung der inhibitorischen Konzentration unter dem Minimum mit Masarimycin sowie ein Synergie-/Antagonismus-Assay vorgestellt. Synergie- und Antagonismus-Assays mit Antibiotika mit klar definierten Wirkungsweisen können ein nützlicher Weg sein, um Verbindungen zwischen zellulären Prozessen zu erforschen38,39,40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Iodobenzoic acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I7675-25G</td>
			<td>corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>109827-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum backed silica plates</td>
			<td>Sorbtech</td>
			<td>4434126</td>
			<td>silica gel XG F254 on aluminum backed plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform-d</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>151823-50G</td>
			<td>solvent for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Mass Spectrometer</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>Advion CMS</td>
			<td>compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>07-200-90</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-547</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexanecarboxaldehyde</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L INC.</td>
			<td>24451</td>
			<td>flammable, irritant, colorless to pink liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl isocyanide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>133302-5G</td>
			<td>irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexylamine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>240648-100ML</td>
			<td>corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>537446-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flash silica cartridge (12g)</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>PF-50SIHP-F0012</td>
			<td>pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>fixing agent for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H8651-25G</td>
			<td>buffer for microscopy fixing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, mixture of isomers</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>178918-4L</td>
			<td>environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance compact mass spectrometer</td>
			<td>Advion</td>
			<td>expression</td>
			<td>Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vac</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>Vacufuge plus</td>
			<td>vacuum aided by centrifugal force and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>258148-2.5L</td>
			<td>corrosive, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td>strong acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-365-19</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine, resublimed crystals</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41955</td>
			<td>environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mestre Mnova</td>
			<td>MestreLab Research</td>
			<td></td>
			<td>software for processing NMR spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>439193-4L</td>
			<td>flammable, toxic, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td>microscopy stain for staining cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>B21176X</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton broth</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>DF0757-17-6</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>22-310397</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Synthesis Labstation</td>
			<td>MILESTONE</td>
			<td>START SYNTH</td>
			<td>device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tubes</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z562769-5EA</td>
			<td>5mm NMR tubes 600 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Resonance (NMR)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Ascend 400</td>
			<td>large superconducting magnet (400MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optochin</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>AAB21627MC</td>
			<td>ethylhydrocupreine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petrie plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229695</td>
			<td>for preparing agar plates for bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for morphology studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puriFlash</td>
			<td>interchim</td>
			<td>XS520plus</td>
			<td>flash chromatography purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resazurin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R7017-1G</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Hei-VAP Value &#34;The Collegiate&#34;</td>
			<td>solvent evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td>irritant, white powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>S271-1</td>
			<td>crystalline, colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>7985592-500G</td>
			<td>anhydrous, granular, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitney DG250 Workstation</td>
			<td>Microbiology International</td>
			<td>DG250</td>
			<td>anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Lite (blue) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for acquiring micrographs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth

Peptidoglycan (PG) in der Zellwand von Bakterien ist eine einzigartige makromolekulare Struktur, die Form und Schutz vor der Umgebung verleiht. Zentral für das Verständnis des Zellwachstums und der Zellteilung ist das Wissen, wie der PG-Abbau die Biosynthese und den Zellwandaufbau beeinflusst. Kürzlich wurde über die metabolische Markierung von PG durch die Einführung von modifizierten Zuckern oder Aminosäuren berichtet. Während eine chemische Abfrage von Biosyntheseschritten mit niedermolekularen Inhibitoren möglich ist, sind chemisch-biologische Werkzeuge zur Untersuchung des PG-Abbaus durch Autolysine unterentwickelt. Bakterielle Autolysine sind eine breite Klasse von Enzymen, die am eng koordinierten Abbau von PG beteiligt sind. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung einer niedermolekularen Sonde, Masarimycin, einem Inhibitor von N-Acetylglucosaminidase LytG in Bacillus subtilis, und des Zellwandstoffwechsels in Streptococcus pneumoniae vorgestellt. Die Herstellung des Inhibitors über mikrowellengestützte und klassische organische Synthese ist vorgesehen. Seine Anwendbarkeit als Werkzeug zur Untersuchung der grampositiven Physiologie in biologischen Assays wird vorgestellt.

Masarimycin ist ein niedermolekularer bakteriostatischer Inhibitor von B. subtilis und S. pneumoniae und hemmt nachweislich das exo-wirkende GlcNAcase LytG in B. subtilis 35,37 und zielt in S. pneumoniae 37 auf die Zellwand ab. Masarimycin kann entweder durch die klassische oder mikrowellengestützte organische Synthese mit Ausbeuten im Bereich von 55% -70% effizient hergestellt werden. Die mikrowellenge...

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Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

Es wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung des bakteriostatischen Diamid Masarimycin vorgestellt, einer niedermolekularen Sonde, die das Wachstum von Bacillus subtilis und Streptococcus pneumoniae hemmt, indem sie auf den Abbau der Zellwand abzielt. Seine Anwendung als chemische Sonde wird in Synergie-/Antagonismus-Assays und morphologischen Studien mit B. subtilis und S. pneumoniae nachgewiesen.

Synthese von Masarimycin, einem niedermolekularen Inhibitor des grampositiven Bakterienwachstums

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Masarimycin ist einer der wenigen Inhibitoren bakterieller Autolysine, der das Wachstum bakterieller Zellen stoppt. Es kann verwendet werden, um die Unterschiede zwischen chemischer und genetischer Inaktivierung von Autolysinen zu untersuchen, und bietet einen orthogonalen Ansatz für die Genetik, um die bakterielle Physiologie zu untersuchen. Die Synthese von Masarimycin mag entmutigend erscheinen.Befolgen Sie genau die gezeigten Schritte. Im Zweifelsfall, ob ein Reaktionsschritt funktioniert hat, bestätigen Sie dies durch Dünnschichtchromatographie und die Änderungen der HF-Werte. Bereiten Sie zunächst eine 0,1-molare Lösung von Cyclohexylamin, Cyclohexylcarbadehyd, Ortho-Jodbenzoesäure und Cyclohexylisocyanid in Methanol vor.Fügen Sie einen magnetischen Rührstab hinzu, mischen Sie dann fünf Milliliter Cyclohexylamin und fünf Milliliter Cyclohexylcarboxaldehyd in einem verschlossenen Rundkolben und legen Sie den Kolben für 30 Minuten bei 40 Grad Celsius in ein Sandbad auf einen Rührer. Überwachen Sie die Temperatur mit einem Thermometer, das etwa einen Zentimeter unter der Sandoberfläche platziert ist. Nach 30 Minuten fünf Milliliter Cyclohexylisocyanid in die Lösung geben und weitere 20 Minuten bei 50 Grad Celsius umrühren.Dann fügen Sie fünf Milliliter Ortho-Jodbenzoesäure zu der Reaktionsmischung hinzu und rühren Sie drei bis fünf Stunden lang bei 55 Grad Celsius weiter. Überwachen Sie nach drei Stunden Rühren den Fortschritt der Reaktion regelmäßig durch Dünnschichtchromatographie oder TLC in Abständen von etwa einer Stunde. Betrachten Sie die Reaktion als abgeschlossen, wenn nur eine Stelle mit einem Retentionsfaktor von 0,3 auf der TLC-Platte sichtbar ist.Entfernen Sie das Lösungsmittel im rotatorischen Verdampfer unter reduziertem Druck. Sobald das gesamte Methanol verdampft ist, lösen Sie das getrocknete Rohprodukt in 30 Milliliter Ethylacetat auf und geben Sie es in einen separaten Trichter. Ethylacetat sequentiell mit einmoliger Salzsäure, Wasser, gesättigter Natriumbicarbonatlösung, wieder Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung extrahieren, wobei die wässrigen Schichten bei jeder Extraktion verworfen werden.Entfernen Sie dann die Ethylacetatschicht aus dem Separatorientrichter und sammeln Sie sie in einem Erlenmeyerkolben. Fügen Sie einen Spatel voller wasserfreiem Natriumsulfat hinzu, um Restwasser aus Ethylacetat zu entfernen. Filtern Sie die getrocknete Ethylacetatlösung durch ein Filterpapier Nummer eins, um das Natriumsulfat zu entfernen.Dann waschen Sie das Filterpapier mit einer kleinen Menge Ethylacetat. Die filtrierte Ethylacetatlösung wurde auf einem rotatorischen Verdampfer unter reduziertem Druck auf Trockenheit verdampft, um Masarimycin als Öl zu erhalten, sobald das gesamte Ethylacetat entfernt wurde. Das Masarimycinöl wird in ein bis zwei Millilitern einer 9:1-Hexan-Isopropanol-Lösung aufgelöst und auf einer magnetischen Rührplatte umgerührt, bis sich die gesamte Verbindung gelöst hat.Um das gelöste Masarimycin zu reinigen, führen Sie eine Flash-Chromatographie mit einer 12-Gramm-Normalphasen-Kieselsäure-Flash-Kolonne durch. Gleichen Sie die Blitzsäule mit 10 Säulenvolumina der mobilen Phase aus, wobei die Instrumente auf eine Durchflussrate von 15 Millilitern pro Minute eingestellt sind. Nachdem das Gleichgewicht abgeschlossen ist, zeichnen Sie das gelöste Masarimycin mit einer Fünf-Milliliter-Spritze.Verbinden Sie die Spritze direkt mit der Oberseite der Gleichgewichtsblitzsäule und injizieren Sie die Lösung in die Säule. Schließen Sie die belastete Säule wieder an das Blitzchromatographiesystem an und initiieren Sie die Gradientenelution. Eluierte Masarimycin aus der Säule mittels Gradientenelution zu einer Endkonzentration der mobilen Phase von 10:90 Hexan zu Isopropanol über 12 Säulenvolumen.Überwachen Sie die Elution von Masarimycin über die Absorption bei 230 und 254 Nanometern. Für die Morphologiestudie züchten Bacillus subtilis 11774 auf LB-Agarplatten bei 37 Grad Celsius. Verwenden Sie in allen nachfolgenden Experimenten Second-Passage-Zellen, die in fünf Millilitern LB-Brühe gezüchtet wurden, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern 1 erreicht.Als nächstes fügen Sie Masarimycin mit einer Pipette zu den Kulturröhrchen hinzu, die mit einer Endkonzentration von 3,8 Mikromol behandelt wurden. Für Kulturröhrchen, die als Steuerung gekennzeichnet sind, fügen Sie ein äquivalentes Volumen von DMSO hinzu. Legen Sie die Proben 90 Minuten lang in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 150 U / min.Nach 90 Minuten die Kulturen chemisch in einer 1:10-Mischung aus Nährmedien fixieren und den Puffer über Nacht bei vier Grad Celsius fixieren. Verwenden Sie am nächsten Tag eine Pipette, um 10 bis 20 Mikroliter der chemisch fixierten Proben auf Glasmikroskopobjektträger aufzutragen und sie an der Luft trocknen zu lassen. Fixieren Sie dann die luftgetrockneten Proben, indem Sie die Glasobjektträger mit einem Bunsenbrenner erhitzen.Nach der Hitzefixierung färben Sie die Proben mit 100 Mikrolitern 0,1% Methylenblau. Nach einer 10-minütigen Inkubation mit dem Fleck den überschüssigen Farbstoff mit destilliertem Wasser wegwaschen. Dann erhitzen Sie die gefärbten Objektträger vorsichtig auf 60 Grad Celsius in einem Ofen für 15 bis 20 Minuten, um die Zellen auf eine gemeinsame Fokusebene zu bringen.Verschließen Sie die gefärbten Proben, indem Sie einen Mikroskop-Deckglas über die gefärbten Zellen legen. Versiegeln Sie dann die Kanten mit Objektträgerzement. Legen Sie den versiegelten Objektträger auf den Mikroskoptisch und bringen Sie das Bild mit einer Hellfeldmikroskopie bei 100-facher Vergrößerung in den Fokus.Legen Sie einen Tropfen Tauchöl auf den Objektträger und bringen Sie das Sichtfeld mit 1000-facher Vergrößerung in den Fokus. Erfassen Sie Mikroaufnahmen mit einer Kamera, die an das Mikroskop und die zugehörige Software angeschlossen ist. Erfassen Sie Bilder mit den automatischen Weißabgleichs- und Blendeneinstellungen der Software.Die Flash-Chromatographie ermöglicht eine schnelle Reinigung von Masarimycin mit hoher Reinheit. Die Bewertung von Synergien oder Antagonismus mit dem ATPase-Inhibitor Optochin in S.pneumoniae wird hier vorgestellt. Die niedrigste Konzentration der Verbindung zur Hemmung des Bakterienwachstums, die durch die blaue Farbe angezeigt wird, gilt als der minimale hemmende Konzentrationswert in Gegenwart eines Co-Arzneimittels.Im Gegensatz dazu weisen Brunnen mit rosa Farbe auf Bakterienwachstum hin. Phänotypische Assays mit Masarimycin im 0,75-fachen der minimalen inhibitorischen Konzentrationen zeigten einen wurstähnlichen Phänotyp für B.subtilis und einen verklumpenden Phänotyp für S.pneumoniae. Achten Sie auf die Temperatur der Reaktion.Stellen Sie sicher, dass die Reaktion vollständig ist, indem Sie sie mit TLC überwachen. Diese Methode kann in Verbindung mit fluoreszenzmarkierten Antibiotika verwendet werden, um Veränderungen der Zellwand mikroskopisch zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Forschung

Biochemie

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen HCN1- und TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Quantifizierung der Bakterien Histidinkinase Autophosphorylierung eine Nitrocellulose-Bindungsassay unter Verwendung

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Verbesserte Sample Multiplexing von Gewebe mit Combined Precursor Isotopenmarkierung und Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Ein Western-Blot-Protokoll für eine kleine Zahl von Hämatopoetischen Stammzellen

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase-Inhibitor-Screening in selbstmontierten humanen Protein-Mikroarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Eine semi-High-Throughput-Anpassung des NADH-gekoppelten ATPase-Assays zum Screening kleiner Molekülinhibitoren

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Affinitätsreinigung gekoppelt mit RNA-Sequenzierung in grampositiven Bakterien

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...