Name: synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth at JoVE.com

המחקר נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענק מספר 2009522. ניתוח NMR של מסרימיצין נתמך על ידי פרס תוכנית מכשור המחקר הגדולה של הקרן הלאומית למדע תחת מענק מספר 1919644. כל הדעות, הממצאים והמסקנות, או ההמלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את דעותיה של הקרן הלאומית למדע.

1. שיטות כלליות
הערה: כל התרכובות נרכשו מספקים סטנדרטיים ושימשו ללא טיהור נוסף.
<ol><li>בצע כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) על לוח אלומיניום מצופה מראש בג'ל סיליקה XG F254. זהה כתמים מתחת למנורת UV, על ידי טבילה בכתם p-anisaldehyde, או על ידי חשיפה לאדים I2.</li>
	<li>הקלט את כל ספקט?...

Masarimycin הוא מעכב בקטריוסטטי מיקרומולרי יחיד של B. subtilis35 ו S. דלקת ריאות37 צמיחה. ב - B. subtilis, מסארימיצין הוכח כמעכב את GlcNAcase LytG35, בעוד שהמטרה המולקולרית המדויקת בדופן התא של S. pneumoniae לא זוהתה37. סינתזה של masarimycin באמצעות סינתזה אורגנ?...

פפטידוגליקן (PG) הוא פולימר דמוי רשת התוחם את צורת ומבנה התא הן בחיידק גראם חיובי והן בחיידק גראם-שלילי 1,2. הטרופולימר זה הוא מטריצה של סוכרים אמיניים המקושרים על ידי פפטידים קצרים 3,4,5,6 עם עמוד שדרה המורכב משאריות N-אצטילגלוקוסאמין (GlcNAc) ו-N-אצטילמוראמית (MurNAc) המקושרות β(1,4) הקשורות לסירוגין (איור 1)1. מחובר ל-C-3 לקטיל מואטי של MurNAc הוא פפטיד הגבעול. חילוף החומרים של PG כולל מערכת מתואמת היטב של אנזימים ביוסינטטיים ומשפילים כדי לשלב חומר חדש בדופן התא 7,8. השפלה של PG מתבצעת על ידי אנזימים המכונים באופן קולקטיבי אוטוליזינים9 ומסווגים עוד יותר על סמך הספציפיות של הקשר שנבקע. אוטוליסינים משתתפים בתהליכים תאיים רבים, כולל גדילת תאים, חלוקת תאים, תנועתיות, התבגרות PG, כימוטקסיס, הפרשת חלבונים, יכולת גנטית, התמיינות ופתוגניות10,11. חשיפת הפונקציות הביולוגיות הספציפיות של אוטוליזינים בודדים יכולה להיות מרתיעה, בין השאר בשל יתירות תפקודית. עם זאת, מחקרים ביופיזיים אחרונים 8,12,13 ומחקרים חישוביים12 סיפקו תובנות חדשות על תפקידם בחילוף החומרים של PG. בנוסף, הדו"חות האחרונים סיפקו תובנה נוספת לגבי סינתזה14 ו-15,16,17 שלבים בתיווך ממברנה בחילוף החומרים של PG. הבנה מעמיקה של הקשר בין מסלולים מתכלים וסינתטיים של חילוף החומרים של PG עשויה להוליד מטרות אנטיביוטיות שלא נוצלו בעבר.
אמנם חלה התקדמות משמעותית במתודולוגיה לחקר הגליקוביולוגיה באאוקריוטים, אבל הגליקוביולוגיה החיידקית, ובמיוחד, חילוף החומרים של PG לא התקדם בקצב דומה. הגישות הכימיות הנוכחיות לחקר חילוף החומרים של PG כוללות אנטיביוטיקה מסומנת פלואורסצנטית18, בדיקות פלואורסצנטיות19,20, ותיווג מטבולי 21,22,23,24. גישות חדשות אלה מספקות דרכים חדשות לחקור את חילוף החומרים של דופן תאי החיידקים. בעוד שחלק מהאסטרטגיות הללו מסוגלות לתייג PG in vivo, הן יכולות להיות ספציפיות למין19, או לעבוד רק בזנים שחסרים להם אוטוליזיןמסוים 25. אסטרטגיות תיוג PG רבות מיועדות לשימוש עם דפנות תא מבודדות26 או עם מסלולי ביוסינתזה של PG משוחזרים במבחנה 20,27,28. השימוש באנטיביוטיקה עם תווית פלואורסצנטית מוגבל כיום לצעדים ביו-סינטטיים ולטרנספטידציה18.
הידע הנוכחי על אוטוליזינים חיידקיים ותפקידם בחילוף החומרים של דופן התא מגיע מניתוח ביוכימי גנטי ובמבחנה 11,29,30,31,32. בעוד שגישות אלה סיפקו שפע של מידע על סוג חשוב זה של אנזימים, פענוח תפקידם הביולוגי יכול להיות מאתגר. לדוגמה, בשל יתירות תפקודית33, מחיקה של אוטוליזין ברוב המקרים אינה גורמת לעצירת צמיחת החיידקים. זאת למרות תפקידם המרומז בצמיחת התאיםובחלוקתם 7,12. סיבוך נוסף הוא שמחיקה גנטית של אוטוליזין חיידקי יכולה להוליד מטא-פנוטיפים34. מטא-פנוטיפים נובעים מיחסי הגומלין המורכבים בין המסלול המושפע מהמחיקה הגנטית לבין מסלולים מקושרים אחרים. לדוגמה, מטא-פנוטיפ יכול להיווצר באמצעות השפעה ישירה כגון היעדר אנזים, או השפעה עקיפה כגון הפרעה של הרגולטורים.
נכון לעכשיו, ישנם רק כמה מעכבים של גליקוזידאז אוטוליזינים כגון N-אצטילגלוקוסאמינידס (GlcNAcase) ו- N-acetylmuramidases, אשר יכולים לשמש כבדיקות כימיות כדי לחקור את הפירוק של PG. כדי להתמודד עם זה, הדימיד מסארימיצין (שנקרא בעבר fgkc) זוהה ואופיין35 כמעכב בקטריוסטטי של צמיחת Bacillus subtilis המכוון ל-GlcNAcase LytG32 (איור 1). LytG הוא GlcNAcase36 בעל משחק אקסו-אקטיבי, חבר באשכול 2 במשפחת ההידרולאזים הגליקוזיליים 73 (GH73). זהו ה-GlcNAcase הפעיל העיקרי במהלך צמיחה וגטטיבית32. למיטב ידיעתנו, מסארימיצין הוא המעכב הראשון של GlcNAcase הפועל על ידי PG ומעכב את צמיחת התאים. מחקרים נוספים על מסרימיצין עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס מצאו כי מסרימיצין ככל הנראה מעכב את חילוף החומרים של דופן התא באורגניזם זה37. כאן, ההכנה של masarimycin מדווח לשימוש כבדיקה ביולוגיה כימית כדי לחקור פיזיולוגיה באורגניזמים גראם חיוביים B. subtilis, ו S. pneumoniae. דוגמאות לניתוח מורפולוגי של טיפול בריכוז מעכב תת-מינימלי עם מסרימיצין, כמו גם בדיקת סינרגיה/אנטגוניזם מוצגות. מבחני סינרגיה ואנטגוניזם באמצעות אנטיביוטיקה עם דרכי פעולה מוגדרות היטב יכולים להיות דרך שימושית לחקור קשרים בין תהליכים תאיים 38,39,40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Iodobenzoic acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I7675-25G</td>
			<td>corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>109827-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum backed silica plates</td>
			<td>Sorbtech</td>
			<td>4434126</td>
			<td>silica gel XG F254 on aluminum backed plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform-d</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>151823-50G</td>
			<td>solvent for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Mass Spectrometer</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>Advion CMS</td>
			<td>compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>07-200-90</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-547</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexanecarboxaldehyde</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L INC.</td>
			<td>24451</td>
			<td>flammable, irritant, colorless to pink liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl isocyanide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>133302-5G</td>
			<td>irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexylamine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>240648-100ML</td>
			<td>corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>537446-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flash silica cartridge (12g)</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>PF-50SIHP-F0012</td>
			<td>pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>fixing agent for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H8651-25G</td>
			<td>buffer for microscopy fixing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, mixture of isomers</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>178918-4L</td>
			<td>environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance compact mass spectrometer</td>
			<td>Advion</td>
			<td>expression</td>
			<td>Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vac</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>Vacufuge plus</td>
			<td>vacuum aided by centrifugal force and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>258148-2.5L</td>
			<td>corrosive, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td>strong acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-365-19</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine, resublimed crystals</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41955</td>
			<td>environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mestre Mnova</td>
			<td>MestreLab Research</td>
			<td></td>
			<td>software for processing NMR spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>439193-4L</td>
			<td>flammable, toxic, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td>microscopy stain for staining cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>B21176X</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton broth</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>DF0757-17-6</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>22-310397</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Synthesis Labstation</td>
			<td>MILESTONE</td>
			<td>START SYNTH</td>
			<td>device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tubes</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z562769-5EA</td>
			<td>5mm NMR tubes 600 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Resonance (NMR)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Ascend 400</td>
			<td>large superconducting magnet (400MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optochin</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>AAB21627MC</td>
			<td>ethylhydrocupreine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petrie plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229695</td>
			<td>for preparing agar plates for bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for morphology studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puriFlash</td>
			<td>interchim</td>
			<td>XS520plus</td>
			<td>flash chromatography purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resazurin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R7017-1G</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Hei-VAP Value &#34;The Collegiate&#34;</td>
			<td>solvent evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td>irritant, white powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>S271-1</td>
			<td>crystalline, colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>7985592-500G</td>
			<td>anhydrous, granular, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitney DG250 Workstation</td>
			<td>Microbiology International</td>
			<td>DG250</td>
			<td>anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Lite (blue) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for acquiring micrographs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth

פפטידוגליקן (PG) בדופן התא של החיידקים הוא מבנה מקרומולקולרי ייחודי המקנה צורה, והגנה מפני הסביבה. מרכיב מרכזי בהבנת הצמיחה והחלוקה של התאים הוא הידע על האופן שבו פירוק PG משפיע על הביוסינתזה ועל הרכבת דופן התא. לאחרונה דווח על תיוג מטבולי של PG באמצעות הכנסת סוכרים מותאמים או חומצות אמינו. בעוד שחקירה כימית של צעדים ביו-סינטטיים עם מעכבי מולקולות קטנות אפשרית, כלים לביולוגיה כימית לחקר השפלת PG על ידי אוטוליזינים אינם מפותחים מספיק. אוטוליזינים חיידקיים הם סוג רחב של אנזימים המעורבים בפירוק מתואם היטב של PG. כאן מוצג פרוטוקול מפורט להכנת גשושית מולקולה קטנה, masarimycin, שהיא מעכבת של N-אצטיל-גלוקוסאמינידאז LytG ב-Bacillus subtilis, ומטבוליזם של דופן התא בסטרפטוקוקוס דלקת ריאות. הכנת המעכב באמצעות סינתזה אורגנית בסיוע מיקרוגל וקלאסית מסופקת. תחולתו ככלי לחקר פיזיולוגיה גראם-חיובית במבחנים ביולוגיים מוצגת.

Masarimycin הוא מעכב בקטריוסטטי של מולקולה קטנה של B. subtilis ו- S. pneumoniae והוכח כמעכב את GlcNAcase LytG הפועל כאקסו ב- B. subtilis35,37 ומכוון את דופן התא ב- S. pneumoniae37. ניתן להכין את Masarimycin ביעילות על ידי סינתזה אורגנית קלאסית או בסיוע מיקרוגל עם תשואות ...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth at JoVE.com

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

מוצג פרוטוקול מפורט להכנת הבקטריוסטטי דיאמיד מסארימיצין, בדיקה של מולקולה קטנה המעכבת את צמיחתם של Bacillus subtilis ודלקת ריאות סטרפטוקוקוס על ידי התמקדות בהתדרדרות דופן התא. היישום שלה כבדיקה כימית מודגם במבחני סינרגיה/אנטגוניזם ובמחקרים מורפולוגיים עם B. subtilis ו-S. pneumoniae.

סינתזה של מסארימיצין, מעכב מולקולה קטנה של צמיחת חיידקים גראם חיובית

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

מסארימיצין הוא אחד המעכבים הבודדים של אוטוליזין חיידקי שעוצר את צמיחת תאי החיידקים. ניתן להשתמש בו כדי לחקור את ההבדלים בין אי-פעילות כימית וגנטית של אוטוליזינים, ומספק גישה אורתוגונלית לגנטיקה לחקר הפיזיולוגיה של החיידקים. סינתזה של מסרימיצין עשויה להיראות מרתיעה.עקוב מקרוב אחר השלבים המוצגים. כאשר יש ספק אם שלב תגובה עבד, אשר על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה ואת השינויים בערכי RF. כדי להתחיל, להכין תמיסה טוחנת 0.1 של ציקלוהקסילאמין, ציקלוהקסיל קרבוקסלדהיד, חומצה אורתו-יודובנזואית, וציקלוהקסיל איזוציאניד במתנול.לאחר מכן, הוסיפו מוט ערבוב מגנטי, ערבבו חמישה מיליליטרים של ציקלוהקסילאמין וחמישה מיליליטרים של ציקלוהקסיל קרבוקסלדהיד בבקבוקון עגול עם תחתית עגולה והניחו את הבקבוקון באמבט חול על מערבל כיריים למשך 30 דקות בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס. עקוב אחר הטמפרטורה באמצעות מדחום הממוקם כסנטימטר אחד מתחת לפני החול. לאחר 30 דקות, מוסיפים חמישה מיליליטרים של ציקלוהקסיל איזוציאניד לתמיסה ומערבבים במשך 20 דקות נוספות ב-50 מעלות צלזיוס.לאחר מכן, מוסיפים חמישה מיליליטרים של חומצה אורתו-יודובנזואית לתערובת התגובה וממשיכים לערבב ב-55 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד חמש שעות. לאחר שלוש שעות של ערבוב, עקוב אחר התקדמות התגובה מעת לעת על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה, או TLC, במרווחים של כשעה. שקול את התגובה הושלמה כאשר רק נקודה אחת עם גורם שמירה השווה ל- 0.3 נראית על לוח ה- TLC.הסר את הממס במאייד סיבובי בלחץ מופחת. לאחר שכל המתנול מתאדה, ממיסים את המוצר הגולמי המיובש ב-30 מיליליטרים של אתיל אצטט ומעבירים אותו למשפך מפריד. יש לחלץ אתיל אצטט ברצף עם חומצה הידרוכלורית טוחנת אחת, מים, תמיסת נתרן ביקרבונט רוויה, מים שוב ותמיסת נתרן כלורי רוויה, תוך השלכת השכבות הימיות בכל מיצוי.לאחר מכן, הסר את שכבת האתיל אצטט מהמשפך המפריד ואסוף אותה בבקבוקון ארלנמאייר. מוסיפים מרית מלאה בנתרן גופרתי נטול מים נטול מים כדי להסיר את שאריות המים מאתיל אצטט. סנן את תמיסת האתיל אצטט המיובשת דרך נייר סינון מספר אחת כדי להסיר את הנתרן גופרתי.לאחר מכן, לשטוף את נייר המסנן עם כמות קטנה של אתיל אצטט. תמיסת האתיל אצטט המסוננת התאיידה ליובש על מאייד סיבובי בלחץ מופחת כדי לקבל מסרימיצין כשמן לאחר הסרת כל האתיל אצטט. ממיסים את שמן המסרימיצין במילילטר אחד עד שני מיליליטרים של תמיסת הקסאן 9:1 לאיזופרופנול ומערבבים על צלחת ערבוב מגנטית עד שהתרכובת כולה מומסת.כדי לטהר את המסרימיצין המומס, בצע כרומטוגרפיית פלאש עם עמודת הבזק סיליקה של 12 גרם, בפאזה רגילה. שיווי משקל את עמודת הפלאש עם 10 נפחי עמודה של פאזה ניידת כאשר המכשירים מוגדרים בקצב זרימה של 15 מיליליטר לדקה. לאחר השלמת שיווי המשקל, ציירו את המסרימיצין המומס באמצעות מזרק של חמישה מיליליטר.חבר את המזרק ישירות לראש עמודת הפלאש המשוזנת והזריק את התמיסה לעמודה. חבר מחדש את העמודה הטעונה למערכת כרומטוגרפיית ההבזק והתחל את ההבראה המקדמית. Elute masarimycin מהעמודה באמצעות אלוטיון הדרגתי לריכוז פאזה נייד סופי של 10:90 הקסאן לאיזופרופנול על פני 12 נפחי עמודה.עקוב אחר התרוממות של מסארימיצין באמצעות ספיגה ב 230 ו 254 ננומטר. עבור מחקר המורפולוגיה, לגדל bacillus subtilis 11774 על לוחות אגר LB ב 37 מעלות צלזיוס. בכל הניסויים הבאים, השתמשו בתאי מעבר שני שגדלו בחמישה מיליליטרים של ציר LB עד שהצפיפות האופטית של 600 ננומטר תגיע ל-1.לאחר מכן, באמצעות פיפטה, מוסיפים מסארימיצין לצינורות התרבית המסומנים בריכוז סופי של 3.8 מיקרומולים. עבור צינורות תרבית המסומנים בשליטה, הוסף נפח שווה ערך של DMSO. מניחים את הדגימות באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות עם רעידות ב-150 סל"ד.לאחר 90 דקות, מקבעים כימית את התרביות בתערובת של 1:10 של מדיית תרביות ותיקון חיץ בארבע מעלות צלזיוס במהלך הלילה. למחרת, השתמשו בפיפטה כדי למרוח 10 עד 20 מיקרוליטרים של הדגימות הקבועות כימית על מגלשות מיקרוסקופ זכוכית ולאפשר להן להתייבש באוויר. לאחר מכן, תקן בחום את דגימות האוויר המיובשות על ידי חימום מגלשות הזכוכית באמצעות מבער Bunsen.לאחר תיקון חום, הכתימו את הדגימות ב-100 מיקרוליטרים של 0.1% מתילן כחול. לאחר דגירה של 10 דקות עם הכתם, שטפו את הצבע העודף במים מזוקקים. לאחר מכן, מחממים בעדינות את המגלשות המוכתמות ל-60 מעלות צלזיוס בתנור למשך 15 עד 20 דקות כדי להביא את התאים למישור מוקד משותף.אטמו את הדגימות המוכתמות על ידי הנחת כיסוי מיקרוסקופ החלקה על התאים המוכתמים. לאחר מכן, אטמו את הקצוות באמצעות מלט החלקה במיקרוסקופ. הניחו את שקופית המיקרוסקופ האטומה על במת המיקרוסקופ והביאו את התמונה לפוקוס בהגדלה של פי 100 באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.הניחו טיפה של שמן טבילה על שקופית המיקרוסקופ והביאו את שדה הראייה למיקוד באמצעות הגדלה של 1000X. רכשו מיקרוגרפים באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ ולתוכנה הנלווית אליו. השג תמונות באמצעות הגדרות האיזון הלבן האוטומטי ומפתח הצמצם של התוכנה.כרומטוגרפיית פלאש מאפשרת טיהור מהיר של מסארימיצין עם טוהר גבוה. הערכה של סינרגיה או אנטגוניזם עם מעכב ATPase אופטוצ'ין ב- S.pneumoniae מוצגת כאן. הריכוז הנמוך ביותר של התרכובת לעיכוב צמיחת חיידקים, המסומן על ידי הצבע הכחול, נחשב לערך הריכוז המעכב המינימלי בנוכחות תרופה משותפת.לעומת זאת, בארות עם צבע ורוד מצביעות על צמיחת חיידקים. מבחנים פנוטיפיים שהשתמשו במסארימיצין בריכוזים מעכבים מינימליים של פי 0.75 הדגימו פנוטיפ דמוי נקניק עבור B.subtilis ופנוטיפ מגושם עבור S.pneumoniae. שימו לב לטמפרטורה של התגובה.ודא שהתגובה הושלמה על ידי ניטור באמצעות TLC. ניתן להשתמש בשיטה זו בשילוב עם אנטיביוטיקה עם תווית פלואורסצנטית כדי לחקור שינויים בדופן התא על ידי מיקרוסקופיה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

זיהוי של חלבונים קושרי מולקולה קטנים בסביבה נייד Native ידי תיוג Live- תא Photoaffinity

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

לדוגמא ריבוב של רקמות משופרת שימוש משולב מבשר איזוטופים תיוג ו Isobaric תיוג (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

מערבון סופג פרוטוקול עבור מספר קטן של תאי גזע Hematopoietic

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...