Name: synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00
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연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 보조금 번호 2009522에 의해 지원되었습니다. 마사리마이신에 대한 NMR 분석은 국립 과학 재단의 주요 연구 계측 프로그램 어워드에 의해 보조금 번호 1919644에 의해 지원되었다. 이 자료에 표현 된 의견, 결과 및 결론 또는 권장 사항은 저자의 의견이며 반드시 국립 과학 재단의 견해를 반영하지는 않습니다.

1. 일반적인 방법
참고: 모든 화합물은 표준 공급업체로부터 구입하여 추가 정제 없이 사용했습니다.
<ol><li>실리카 겔 XG F254로 예비코팅된 알루미늄 플레이트에 박층 크로마토그래피(TLC)를 수행하십시오. UV 램프 아래, p-anisaldehyde 얼룩에 침지하거나 I2 증기에 노출시켜 반점을 감지합니다.</li>
	<li>모든 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼을 400MHz 분광계에 ?...

마사리마이신은 B. subtilis35 및 S. pneumoniae37 성장의 단일 마이크로몰 정균 억제제이다. B. subtilis에서, 마사리마이신은 GlcNAcase LytG 35를 억제하는 것으로 나타났지만, S. pneumoniae의 세포벽에서 정확한 분자 표적은 확인되지 않았다37. 고전적인 유기 합성 또는 마이크로파 절차를 사용하여 마사리 마이신의 합성...

펩티도글리칸(PG)은 그람 양성균과 그람 음성 박테리아 1,2 모두에서 세포 모양과 구조를 묘사하는 메쉬형 폴리머이다. 이러한 헤테로폴리머는 짧은 펩티드3,4,5,6에 의해 가교결합된 아미노 당류의 매트릭스이며, β-(1,4)-연결된 교대 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및 N-아세틸무람산(MurNAc) 잔기로 구성된 백본을 갖는다(도 1)1. MurNAc의 C-3 락틸 모이어티에 부착된 것은 줄기 펩티드이다. PG의 신진 대사는 세포벽 7,8에 새로운 물질을 통합하기 위해 생합성 및 분해 효소의 밀접하게 조정 된 시스템을 포함한다. PG의 분해는 자율분해신9로 총칭되는 효소에 의해 수행되고, 절단된 결합의 특이성에 기초하여 추가로 분류된다. 오토리신은 세포 성장, 세포 분열, 운동성, PG 성숙, 화학주성, 단백질 분비, 유전 능력, 분화 및 병원성10,11을 포함한 많은 세포 과정에 참여한다. 개별 autolysins의 특정 생물학적 기능을 푸는 것은 부분적으로 기능적 중복성으로 인해 어려울 수 있습니다. 그러나, 최근의 생물물리학적 8,12,13 및 전산 연구(12)는 PG 대사에서의 그들의 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공하였다. 또한, 최근의 보고들은 PG 대사에서 합성14 및 막 매개 15,16,17 단계에 대한 추가적인 통찰을 제공하였다. PG 신진 대사의 분해 경로와 합성 경로 사이의 관계에 대한 철저한 이해는 이전에 미개척 된 항생제 표적을 야기 할 수 있습니다.
진핵생물에서 당생물학을 연구하기 위한 방법론의 상당한 발전이 있었지만, 박테리아 당생물학 및 특히 PG 대사는 유사한 속도로 진행되지 않았다. PG 대사를 연구하기 위한 현재의 화학적 접근법에는 형광 표지된 항생제18, 형광 프로브19,20 및 대사 표지21,22,23,24가 포함된다. 이러한 새로운 접근법은 박테리아 세포벽 신진 대사를 조사하는 새로운 방법을 제공하고 있습니다. 이들 전략 중 일부는 생체내에서 PG를 표지할 수 있지만, 이들은 종-특이적19일 수 있거나, 또는 특정 자가분해신(25)이 결여된 균주에서만 작용할 수 있다. 많은 PG 표지 전략은 단리된 세포벽(26) 또는 시험관내 재구성된 PG 생합성 경로(20,27,28)와 함께 사용하기 위한 것이다. 형광 표지된 항생제의 사용은 현재 생합성 단계 및 형질소화(transpeptidation)18로 제한된다.
박테리아 autolysins에 대한 현재의 지식과 세포벽 대사에서의 그들의 역할은 유전 및 시험관 내 생화학 분석 11,29,30,31,32에서 비롯됩니다. 이러한 접근법은이 중요한 종류의 효소에 대한 풍부한 정보를 제공했지만 생물학적 역할을 해독하는 것은 어려울 수 있습니다. 예를 들어, 기능적 중복성(33)으로 인해, 대부분의 경우 자가분해신의 결실은 박테리아 성장을 정지시키는 결과를 초래하지 않는다. 이것은 세포 성장 및 분열에서 그들의 묵시적 역할에도 불구하고 7,12. 또 다른 합병증은 박테리아 autolysin의 유전 적 결실이 메타 표현형34를 일으킬 수 있다는 것입니다. 메타 표현형은 유전 적 결실에 의해 영향을받는 경로와 다른 상호 연결된 경로 사이의 복잡한 상호 작용에서 발생합니다. 예를 들어, 메타 표현형은 효소의 부족과 같은 직접적인 효과 또는 조절자의 파괴와 같은 간접적 인 효과를 통해 발생할 수 있습니다.
현재, PG의 분해를 연구하기 위한 화학 프로브로 사용될 수 있는 N-아세틸글루코사미니다제(GlcNAcase) 및 N-아세틸무라미다제와 같은 글리코시다제 autolysins의 억제제는 단지 몇 가지 밖에 없다. 이를 해결하기 위해, 디아미드 마사리마이신 (이전에 fgkc로 불림)은 GlcNAcase LytG32를 표적으로 하는 바실러스 서브틸리스 성장의 정균 억제제로서 확인되고 특성화되었다 (도 1). LytG는 엑소-작용 GlcNAcase36이며, 글리코실 가수분해효소 패밀리 73 (GH73) 내의 클러스터 2의 구성원이다. 그것은 식물 성장 동안 주요 활성 GlcNAcase입니다32. 우리의 지식에 따르면, 마사리 마이신은 세포 성장을 억제하는 PG 작용 GlcNAcase의 첫 번째 억제제입니다. 스트렙토코커스 폐렴을 이용한 마사리마이신에 대한 추가 연구에 따르면 마사리마이신은 이 유기체에서 세포벽 대사를 억제할 가능성이 높다는 것을 발견했다37. 여기서, 마사리마이신의 제제는 그람 양성 유기체 B. subtilis 및 S. pneumoniae에서 생리학을 연구하기 위한 화학 생물학 프로브로서 사용하기 위한 것으로 보고되어 있다. 마사리마이신을 사용한 서브 최소 억제 농도 처리의 형태학적 분석의 예, 뿐만 아니라 상승작용/길항작용 분석이 제시된다. 잘 정의된 작용 모드를 갖는 항생제를 사용하는 시너지 및 길항작용 분석은 세포 과정38,39,40 사이의 연관성을 탐구하는 유용한 방법이 될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Iodobenzoic acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I7675-25G</td>
			<td>corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>109827-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum backed silica plates</td>
			<td>Sorbtech</td>
			<td>4434126</td>
			<td>silica gel XG F254 on aluminum backed plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform-d</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>151823-50G</td>
			<td>solvent for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Mass Spectrometer</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>Advion CMS</td>
			<td>compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>07-200-90</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-547</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexanecarboxaldehyde</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L INC.</td>
			<td>24451</td>
			<td>flammable, irritant, colorless to pink liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl isocyanide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>133302-5G</td>
			<td>irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexylamine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>240648-100ML</td>
			<td>corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>537446-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flash silica cartridge (12g)</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>PF-50SIHP-F0012</td>
			<td>pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>fixing agent for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H8651-25G</td>
			<td>buffer for microscopy fixing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, mixture of isomers</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>178918-4L</td>
			<td>environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance compact mass spectrometer</td>
			<td>Advion</td>
			<td>expression</td>
			<td>Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vac</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>Vacufuge plus</td>
			<td>vacuum aided by centrifugal force and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>258148-2.5L</td>
			<td>corrosive, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td>strong acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-365-19</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine, resublimed crystals</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41955</td>
			<td>environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mestre Mnova</td>
			<td>MestreLab Research</td>
			<td></td>
			<td>software for processing NMR spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>439193-4L</td>
			<td>flammable, toxic, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td>microscopy stain for staining cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>B21176X</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton broth</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>DF0757-17-6</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>22-310397</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Synthesis Labstation</td>
			<td>MILESTONE</td>
			<td>START SYNTH</td>
			<td>device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tubes</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z562769-5EA</td>
			<td>5mm NMR tubes 600 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Resonance (NMR)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Ascend 400</td>
			<td>large superconducting magnet (400MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optochin</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>AAB21627MC</td>
			<td>ethylhydrocupreine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petrie plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229695</td>
			<td>for preparing agar plates for bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for morphology studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puriFlash</td>
			<td>interchim</td>
			<td>XS520plus</td>
			<td>flash chromatography purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resazurin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R7017-1G</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Hei-VAP Value &#34;The Collegiate&#34;</td>
			<td>solvent evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td>irritant, white powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>S271-1</td>
			<td>crystalline, colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>7985592-500G</td>
			<td>anhydrous, granular, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitney DG250 Workstation</td>
			<td>Microbiology International</td>
			<td>DG250</td>
			<td>anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Lite (blue) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for acquiring micrographs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth

박테리아의 세포벽에있는 펩티도글리칸 (PG)은 모양과 주변 환경으로부터의 보호를 부여하는 독특한 거대 분자 구조입니다. 세포 성장과 분열을 이해하는 핵심은 PG 분해가 생합성 및 세포벽 조립에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 지식입니다. 최근에, 변형된 당 또는 아미노산의 도입을 통한 PG의 대사 표지가 보고되고 있다. 소분자 억제제를 사용한 생합성 단계의 화학적 심문이 가능하지만, autolysins에 의한 PG 분해를 연구하기위한 화학 생물학 도구는 저개발되어 있습니다. 박테리아 autolysins는 PG의 긴밀하게 배위된 분해에 관여하는 효소의 광범위한 부류이다. 여기에서, 바실러스 서브틸리스 에서 N-아세틸글루코사미니다제 LytG의 억제제인 소분자 프로브인 마사리마이신, 및 폐렴구균에서 세포벽 대사를 제조하기 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 마이크로파 보조 및 고전적 유기 합성을 통한 억제제의 제조가 제공된다. 생물학적 분석에서 그람 양성 생리학을 연구하는 도구로서의 적용 가능성이 제시됩니다.

마사리마이신은 B. subtilis 및 S. pneumoniae의 소분자 정균 억제제이며, B. subtilis35,37에서 엑소액 작용 GlcNAcase LytG를 억제하고 S. pneumoniae 37에서 세포벽을 표적으로 하는 것으로 나타났다. Masarimycin은 55 % -70 % 범위의 수율로 고전적 또는 전자 레인지 보조 유기 합성에 의해 효율적으로 제조 될 수 있습니다. 마이크?...

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Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

세포벽 분해를 표적화함으로써 바실러스 서브틸 리스 및 스트렙토코커스 폐렴 의 성장을 억제하는 소분자 프로브인 정균성 디아미드 마사리마이신을 제조하기 위한 상세한 프로토콜이 제시된다. 화학 프로브로서의 그것의 적용은 B. subtilis 및 S. pneumoniae를 사용한 시너지 효과 / 길항작용 분석 및 형태 학적 연구에서 입증됩니다.

그람 양성 박테리아 성장의 소분자 억제제 인 Masarimycin의 합성

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Masarimycin은 박테리아 세포 성장을 멈추게하는 박테리아 autolysin의 몇 안되는 억제제 중 하나입니다. 그것은 자기 분해신의 화학적 및 유전 적 불활성화의 차이점을 조사하는 데 사용될 수 있으며, 박테리아 생리학을 연구하기 위해 유전학에 대한 직교 접근법을 제공합니다. 마사리 마이신의 합성은 어려운 것처럼 보일 수 있습니다.표시된 단계를 자세히 따르십시오. 반응 단계가 효과가 있는지 의심 스러울 때 박층 크로마토그래피와 RF 값의 변화를 확인하십시오. 시작하여, 메탄올 중의 사이클로헥실아민, 사이클로헥실카르복스알데히드, 오르토요오도벤조산, 및 사이클로헥실이소시아나이드의 0.1-몰 용액을 제조하였다.자기 교반 막대를 첨가한 다음, 뚜껑이 덮인 둥근 바닥 플라스크에 다섯 밀리리터의 시클로헥실아민과 다섯 밀리리터의 시클로헥실카르복스알데히드를 섞고, 플라스크를 섭씨 40도에서 30분 동안 핫플레이트 교반기 상의 모래 욕조에 놓는다. 모래 표면 아래 약 한 센티미터 아래에 놓인 온도계를 사용하여 온도를 모니터링하십시오. 30 분 후, 5 밀리리터의 시클로헥실 이소시아나이드를 용액에 첨가하고 섭씨 50도에서 추가로 20 분 동안 저어줍니다.이어서, 오르토요오도벤조산 5밀리리터를 반응 혼합물에 첨가하고, 섭씨 55도에서 3 내지 5시간 동안 교반을 계속한다. 세 시간 동안 교반한 후, 대략 한 시간 간격으로 박층 크로마토그래피 또는 TLC에 의해 주기적으로 반응의 진행을 모니터링한다. 0.3과 동일한 보유 계수를 갖는 하나의 스폿만이 TLC 플레이트 상에 보일 때 반응 완료를 고려한다.용매를 감압 하에서 회전 증발기에서 제거한다. 일단 모든 메탄올이 증발되면, 건조된 조생성물을 30 밀리리터의 에틸 아세테이트에 용해시키고 이를 분리 깔때기로 옮긴다. 에틸 아세테이트를 일몰 염산, 물, 포화 중탄산나트륨 용액, 물 또다시 물 및 포화 염화나트륨 용액으로 순차적으로 추출하고, 각 추출마다 수층을 버린다.이어서, 분리 깔때기로부터 에틸 아세테이트 층을 제거하고 이를 삼각 플라스크에 수집한다. 무수 황산나트륨으로 가득 찬 주걱을 첨가하여 에틸 아세테이트에서 잔류 물을 제거하십시오. 건조된 에틸아세테이트 용액을 다수 여과지를 통해 여과하여 황산나트륨을 제거하였다.그런 다음, 여과지를 소량의 에틸 아세테이트로 세척한다. 여과된 에틸아세테이트 용액을 감압 하에서 회전증발기에서 건조시켜 에틸아세테이트가 모두 제거되면 오일로서 마사리마이신을 얻었다. 이소프로판올 용액에 9:1 헥산의 1 내지 2 밀리리터에 마사리마이신 오일을 용해시키고, 전체 화합물이 용해될 때까지 자석 교반 플레이트 상에서 교반한다.용해된 마사리마이신을 정제하려면 12그램의 정상상 실리카 플래쉬 컬럼으로 플래시 크로마토그래피를 수행하십시오. 플래시 컬럼을 10열 볼륨의 이동상과 분당 15밀리리터의 유속으로 설정된 계측기와 평형을 맞춥니다. 평형화가 완료된 후, 용해된 마사리마이신을 다섯 밀리리터 주사기를 사용하여 그린다.주사기를 평형 플래시 컬럼의 상단에 직접 연결하고 용액을 컬럼에 주입하십시오. 로드된 컬럼을 플래시 크로마토그래피 시스템에 다시 연결하고 구배 용출을 시작합니다. 컬럼으로부터 마사리마이신을 10:90 헥산의 최종 이동상 농도로 구배 용출을 사용하여 12 컬럼 부피에 걸쳐 이소프로판올로 희석하였다.230 및 254 나노 미터에서 흡수를 통해 마사리 마이신의 용출을 모니터링하십시오. 형태학 연구를 위해, 섭씨 37도에서 LB 한천 플레이트에 바실러스 서브틸리스 11774를 성장시킨다. 모든 후속 실험에서 600 나노 미터의 광학 밀도가 1에 도달 할 때까지 LB 국물 다섯 밀리리터에서 자란 두 번째 통로 세포를 사용하십시오.다음으로, 피펫을 사용하여, 표지된 배양 튜브에 마사리마이신을 첨가하여 최종 농도 3.8 마이크로몰로 처리하였다. 표지된 대조군 배양 튜브의 경우, 동등한 부피의 DMSO를 첨가한다. 샘플을 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣고 150RPM에서 90분 동안 진탕시킨다.90분 후, 배양물을 1:10 혼합물의 배양 배지에 화학적으로 고정시키고, 밤새 섭씨 4도에서 완충액을 고정시켰다. 다음날 피펫을 사용하여 화학적으로 고정 된 샘플 10 ~ 20 마이크로 리터를 유리 현미경 슬라이드에 적용하고 공기 건조시킵니다. 이어서, 분젠 버너를 사용하여 유리 슬라이드를 가열하여 공기 건조된 샘플을 열고정시킨다.열 고정 후, 샘플을 0.1 % 메틸렌 블루 100 마이크로 리터로 염색하십시오. 얼룩과 함께 10분간 인큐베이션한 후, 과량의 염료를 증류수로 씻어낸다. 이어서, 염색된 슬라이드를 오븐에서 섭씨 60도까지 15 내지 20분 동안 부드럽게 가열하여 세포를 공통 초점면으로 가져온다.염색된 샘플을 현미경 커버 슬립 위에 올려 염색된 세포를 밀봉한다. 그런 다음 현미경 슬라이드 시멘트를 사용하여 가장자리를 밀봉하십시오. 밀봉 된 현미경 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 밝은 필드 현미경을 사용하여 이미지를 100X 배율로 초점으로 맞 춥니 다.현미경 슬라이드에 침지 오일 한 방울을 놓고 1000X 배율을 사용하여 시야각에 초점을 맞춥니다. 현미경 및 관련 소프트웨어에 부착 된 카메라를 사용하여 현미경 사진을 획득하십시오. 소프트웨어의 자동 화이트 밸런스 및 조리개 설정을 사용하여 이미지를 획득하십시오.플래시 크로마토그래피는 고순도의 마사리마이신을 신속하게 정제할 수 있게 해줍니다. S.pneumoniae에서 ATPase 억제제 옵토친과의 상승 또는 길항작용의 평가가 여기에 제시된다. 청색으로 표시된 박테리아 성장을 억제하는 화합물의 최저 농도는 공동 약물의 존재하에서의 최소 억제 농도 값으로 간주된다.대조적으로, 분홍색의 우물은 박테리아의 성장을 나타냅니다. 최소 억제 농도의 0.75배에서 마사리마이신을 사용한 표현형 검정은 B.subtilis에 대한 소시지 유사 표현형과 S.pneumoniae에 대한 응집형 표현형을 입증하였다. 반응의 온도에주의하십시오.TLC로 모니터링하여 반응이 완료되었는지 확인하십시오. 이 방법은 현미경으로 세포벽의 변화를 조사하기 위해 형광 표지 항생제와 함께 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

연구

생화학

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

방법 및 HCN1 TRIP8b 간의 단백질 - 단백질 상호 작용의 작은 분자 억제제 식별

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

니트로 셀룰로오스 결합 분석을 사용하여 세균 히스티딘 키나제자가 인산화의 정량

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

향상된 샘플 복합 전구체 동위 원소 표지 및 동중 태그를 사용하여 조직의 다중 (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

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Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

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