Name: synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth at JoVE.com

Forskningen ble støttet av National Science Foundation under tilskuddsnummer 2009522. NMR-analyse av masarimycin ble støttet av National Science Foundations store forskningsinstrumenteringsprogrampris under tilskuddsnummer 1919644. Eventuelle meninger, funn og konklusjoner, eller anbefalinger uttrykt i dette materialet, er forfatternes og gjenspeiler ikke nødvendigvis synspunktene til National Science Foundation.

1. Generelle metoder
MERK: Alle forbindelser ble kjøpt fra standardleverandører og brukt uten ytterligere rensing.
<ol><li>Utfør tynnlags kromatografi (TLC) på en aluminiumsplate forhåndsbelagt med silikagel XG F254. Oppdag flekker under en UV-lampe, ved nedsenking i p-anisaldehydflekk, eller ved å utsette for I2 damp.</li>
	<li>Registrer alle NMR-spektra (nuclear magnetic resonance) på et spektrometer på 400 MHz. MERK: 1H- NMR og <s...

Masarimycin er en enkelt mikromolar bakteriostatisk hemmer av B. subtilis35 og S. lungebetennelse37 vekst. I B. subtilis har masarimycin vist seg å hemme GlcNAcase LytG35, mens det nøyaktige molekylære målet i celleveggen til S. lungebetennelse ikke er identifisert37. Syntese av masarimycin ved hjelp av enten den klassiske organiske syntesen eller mikrobølgeprosedyren gir inhibitoren i godt utby...

Peptidoglykan (PG) er en maskelignende polymer som avgrenser celleform og struktur i både Gram-positive og Gram-negative bakterier 1,2. Denne heteropolymeren er en matrise av aminosukker kryssbundet av korte peptider 3,4,5,6 med en ryggrad som består av β-(1,4)-koblet vekslende N-acetylglukosamin (GlcNAc) og N-acetymuramsyre (MurNAc) rester (figur 1)1. Festet til C-3 laktylmoiety av MurNAc er stammen peptid. Metabolismen av PG innebærer et tett koordinert system av biosyntetiske og nedbrytende enzymer for å innlemme nytt materiale i celleveggen 7,8. Nedbrytning av PG utføres av enzymer samlet referert til som autolysiner9 og videre klassifisert basert på spesifisiteten av bindingen cleaved. Autolysiner deltar i mange cellulære prosesser, inkludert cellevekst, celledeling, motilitet, PG-modning, chemotaxis, proteinsekresjon, genetisk kompetanse, differensiering og patogenisitet10,11. Å avdekke de spesifikke biologiske funksjonene til individuelle autolysiner kan være skremmende, delvis på grunn av funksjonell redundans. Imidlertid har nyere biofysiske 8,12,13 og beregningsstudier12 gitt ny innsikt i deres roller i PG-metabolisme. I tillegg har nyere rapporter gitt ytterligere innsikt i syntesen14 og membranmediert 15,16,17 trinn i PG metabolisme. En grundig forståelse av sammenhengen mellom nedbrytende og syntetiske veier for PG-metabolisme kan føre til tidligere uutnyttede antibiotikamål.
Mens det har vært betydelige fremskritt i metodikk for å studere glykobiologi i eukaryoter, bakteriell glykobiologi og spesielt PG metabolisme har ikke avansert i en lignende hastighet. Nåværende kjemiske tilnærminger for å studere PG-metabolisme inkluderer fluorescerende merket antibiotika18, fluorescerende sonder19,20 og metabolsk merking 21,22,23,24. Disse nye tilnærmingene gir nye måter å forhøre bakteriell celleveggmetabolisme på. Mens noen av disse strategiene er i stand til å merke PG in vivo, kan de være artsspesifikke19, eller bare fungere i stammer som mangler en bestemt autolysin25. Mange PG-merkingsstrategier er beregnet for bruk med isolerte cellevegger26 eller med in vitro rekonstituerte PG biosynteseveier 20,27,28. Bruken av fluorescerende merkede antibiotika er for tiden begrenset til biosyntetiske trinn og transpeptidasjon18.
Den nåværende kunnskapen om bakterielle autolysiner og deres rolle i celleveggmetabolismen kommer fra genetisk og in vitro biokjemisk analyse 11,29,30,31,32. Selv om disse tilnærmingene har gitt et vell av informasjon om denne viktige klassen av enzymer, kan det være utfordrende å dechiffrere deres biologiske rolle. For eksempel, på grunn av funksjonell redundans33, fører sletting av en autolysin i de fleste tilfeller ikke til å stoppe bakterievekst. Dette til tross for deres underforståtte rolle i cellevekst og divisjon 7,12. En annen komplikasjon er at genetisk sletting av bakterielle autolysiner kan gi opphav til meta-fenotyper34. Meta-fenotyper oppstår fra det komplekse samspillet mellom banen som påvirkes av genetisk sletting og andre sammenkoblede veier. For eksempel kan en meta-fenotype oppstå via en direkte effekt som mangel på et enzym, eller en indirekte effekt som forstyrrelse av regulatorer.
For tiden er det bare noen få hemmere av glykosidase autolysiner som N-acetylglucosaminidases (GlcNAcase) og N-acetylmuramidaser, som kan brukes som kjemiske sonder for å studere nedbrytning av PG. For å løse dette har diamid masarimycin (tidligere kalt fgkc) blitt identifisert og karakterisert35 som en bakteriostatisk hemmer av Bacillus subtilis vekst som retter seg mot GlcNAcase LytG32 (figur 1). LytG er en ekso-fungerende GlcNAcase36, medlem av klynge 2 innen glykosylhydroksylfamilie 73 (GH73). Det er den store aktive GlcNAcase under vegetativ vekst32. Så vidt vi vet er masarimycin den første hemmeren av en PG-fungerende GlcNAcase som hemmer cellulær vekst. Ytterligere studier av masarimycin med Streptococcus pneumoniae fant at masarimycin sannsynligvis hemmer celleveggmetabolismen i denne organismen37. Her rapporteres utarbeidelsen av masarimycin for bruk som en kjemisk biologisonde for å studere fysiologi i Gram-positive organismer B. subtilis og S. lungebetennelse. Eksempler på morfologisk analyse av sub-minimum hemmende konsentrasjonsbehandling med masarimycin, samt en synergi/ antagonismeanalyse presenteres. Synergi- og antagonismeanalyser som bruker antibiotika med veldefinerte virkningsformer, kan være en nyttig måte å utforske sammenhenger mellom cellulære prosesser 38,39,40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Iodobenzoic acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I7675-25G</td>
			<td>corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>109827-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum backed silica plates</td>
			<td>Sorbtech</td>
			<td>4434126</td>
			<td>silica gel XG F254 on aluminum backed plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform-d</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>151823-50G</td>
			<td>solvent for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Mass Spectrometer</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>Advion CMS</td>
			<td>compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>07-200-90</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-547</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexanecarboxaldehyde</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L INC.</td>
			<td>24451</td>
			<td>flammable, irritant, colorless to pink liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl isocyanide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>133302-5G</td>
			<td>irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexylamine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>240648-100ML</td>
			<td>corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>537446-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flash silica cartridge (12g)</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>PF-50SIHP-F0012</td>
			<td>pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>fixing agent for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H8651-25G</td>
			<td>buffer for microscopy fixing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, mixture of isomers</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>178918-4L</td>
			<td>environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance compact mass spectrometer</td>
			<td>Advion</td>
			<td>expression</td>
			<td>Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vac</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>Vacufuge plus</td>
			<td>vacuum aided by centrifugal force and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>258148-2.5L</td>
			<td>corrosive, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td>strong acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-365-19</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine, resublimed crystals</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41955</td>
			<td>environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mestre Mnova</td>
			<td>MestreLab Research</td>
			<td></td>
			<td>software for processing NMR spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>439193-4L</td>
			<td>flammable, toxic, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td>microscopy stain for staining cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>B21176X</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton broth</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>DF0757-17-6</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>22-310397</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Synthesis Labstation</td>
			<td>MILESTONE</td>
			<td>START SYNTH</td>
			<td>device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tubes</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z562769-5EA</td>
			<td>5mm NMR tubes 600 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Resonance (NMR)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Ascend 400</td>
			<td>large superconducting magnet (400MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optochin</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>AAB21627MC</td>
			<td>ethylhydrocupreine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petrie plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229695</td>
			<td>for preparing agar plates for bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for morphology studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puriFlash</td>
			<td>interchim</td>
			<td>XS520plus</td>
			<td>flash chromatography purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resazurin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R7017-1G</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Hei-VAP Value &#34;The Collegiate&#34;</td>
			<td>solvent evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td>irritant, white powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>S271-1</td>
			<td>crystalline, colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>7985592-500G</td>
			<td>anhydrous, granular, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitney DG250 Workstation</td>
			<td>Microbiology International</td>
			<td>DG250</td>
			<td>anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Lite (blue) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for acquiring micrographs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth

Peptidoglykan (PG) i bakterieveggen er en unik makromolekylær struktur som gir form og beskyttelse mot omgivelsene. Sentralt i forståelsen av cellevekst og -deling er kunnskapen om hvordan PG-nedbrytning påvirker biosyntese og celleveggmontering. Nylig har metabolsk merking av PG gjennom innføring av modifiserte sukkerarter eller aminosyrer blitt rapportert. Mens kjemisk avhør av biosyntetiske trinn med små molekylhemmere er mulig, er kjemiske biologiverktøy for å studere PG-nedbrytning av autolysiner underutviklet. Bakterielle autolysiner er en bred klasse enzymer som er involvert i tett koordinert nedbrytning av PG. Her presenteres en detaljert protokoll for å forberede en liten molekylsonde, masarimycin, som er en hemmer av N-acetylglucosaminidase LytG i Bacillus subtilis, og celleveggmetabolisme i Streptococcus pneumoniae. Tilberedning av inhibitoren via mikrobølgeassistert og klassisk organisk syntese er gitt. Dens anvendbarhet som et verktøy for å studere Gram-positiv fysiologi i biologiske analyser presenteres.

Masarimycin er en liten molekylbakteriostatisk hemmer av B. subtilis og S. pneumoniae og har vist seg å hemme den ekso-fungerende GlcNAcase LytG i B. subtilis35,37 og målrette celleveggen i S. pneumoniae37. Masarimycin kan effektivt tilberedes enten av den klassiske eller mikrobølgeassisterte organiske syntesen med utbytter i området 55%-70%. Mikrobølgeassistert syntese har fordelen av en betydelig ...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth at JoVE.com

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

En detaljert protokoll presenteres for å forberede bakteriostatisk diamid masarimycin, en liten molekylsonde som hemmer veksten av Bacillus subtilis og Streptococcus pneumoniae ved å målrette celleveggforringelse. Dens anvendelse som en kjemisk sonde er demonstrert i synergi / antagonismeanalyser og morfologiske studier med B. subtilis og S. lungebetennelse.

Syntese av Masarimycin, en liten molekylhemmer av Gram-positiv bakterievekst

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Masarimycin er en av de få hemmere av bakterielle autolysiner som stopper bakteriell cellevekst. Det kan brukes til å undersøke forskjellene mellom kjemisk og genetisk inaktivering av autolysiner, og gir en ortogonal tilnærming til genetikk for å studere bakteriell fysiologi. Syntese av masarimycin kan virke skremmende.Følg trinnene som vises nøye. Når du er i tvil om et reaksjonstrinn fungerte, bekreft ved tynnlagskromatografi og endringene i RF-verdier. Til å begynne med, lag en 0,1-molar løsning av cyclohexylamin, cyclohexylkarboksaldehyd, ortho-iodobenzoinsyre og cyclohexyl isocyanid i metanol.Tilsett magnetisk rørestang, bland deretter fem milliliter cyclohexylamin og fem milliliter cyclohexyl karboksaldehyd i en avkortet rundbunnsflaske og legg kolben i et sandbad på en varm platerører i 30 minutter ved 40 grader Celsius. Overvåk temperaturen ved hjelp av et termometer plassert omtrent en centimeter under sandoverflaten. Etter 30 minutter, tilsett fem milliliter cyklohexyl isocyanid til løsningen og rør i ytterligere 20 minutter ved 50 grader Celsius.Tilsett deretter fem milliliter ortopedsyre til reaksjonsblandingen og fortsett å røre ved 55 grader Celsius i tre til fem timer. Etter tre timers omrøring, overvåk fremdriften av reaksjonen periodisk ved tynnlagskromatografi, eller TLC, med omtrent en times intervaller. Vurder reaksjonen som fullført når bare ett sted med en oppbevaringsfaktor lik 0,3 er synlig på TLC-platen.Fjern oppløsningsvæsken i roterende fordamper under redusert trykk. Når all metanol er fordampet, oppløs det tørkede råproduktet i 30 milliliter etylacetat og overfør det til en separatortrakt. Trekk ut etylacetat sekvensielt med en-molar saltsyre, vann, mettet natriumbikarbonatoppløsning, vann igjen og mettet natriumkloridoppløsning, og kast de vandige lagene ved hver ekstraksjon.Fjern deretter etylacetatlaget fra separatorytrakten og samle det i en Erlenmeyer-kolbe. Tilsett en slikkepott full av vannfri natriumsulfat for å fjerne gjenværende vann fra etylacetat. Filtrer den tørkede etylacetatoppløsningen gjennom et nummer én-filterpapir for å fjerne natriumsulfatet.Vask deretter filterpapiret med en liten mengde etylacetat. Den filtrerte etylacetatoppløsningen ble fordampet til tørrhet på en roterende fordamper under redusert trykk for å oppnå masarimycin som olje når alt etylacetatet er fjernet. Løs opp masarimycinoljen i en til to milliliter av en 9:1 heksan til isopropanoloppløsning og rør på en magnetisk røreplate til hele forbindelsen er oppløst.For å rense oppløst masarimycin, utfør flashkromatografi med en 12 gram, normalfaset silikablitsøyle. Likevekt blitskolonnen med 10 kolonnevolumer av mobilfase med instrumentene satt til en strømningshastighet på 15 milliliter per minutt. Etter at likevekten er fullført, tegn den oppløste masarimycinen ved hjelp av en fem milliliter sprøyte.Koble sprøyten direkte til toppen av den likevektede blitskolonnen og injiser løsningen i kolonnen. Koble den innlastede kolonnen til blitskromatografisystemet på nytt, og start graderingsutvelgelsen. Elute masarimycin fra kolonnen ved hjelp av gradient elution til en endelig mobil fase konsentrasjon på 10:90 heksan til isopropanol over 12 kolonnevolumer.Overvåk elution av masarimycin via absorpsjon ved 230 og 254 nanometer. For morfologistudien, vokse bacillus subtilis 11774 på LB agar plater ved 37 grader Celsius. I alle påfølgende eksperimenter, bruk andre-passasje celler vokst i fem milliliter LB buljong til den optiske tettheten på 600 nanometer når 1.Deretter, ved hjelp av en pipette, legg masarimycin til kulturrørene merket behandlet til en endelig konsentrasjon på 3,8 mikromoles. For kulturrør merket kontroll, legg til et tilsvarende volum DMSO. Plasser prøvene i en inkubator ved 37 grader Celsius i 90 minutter med risting ved 150 RPM.Etter 90 minutter, kjemisk fikse kulturer i en 1:10 blanding av kulturmedier og fikse buffer på fire grader Celsius over natten. Neste dag, bruk en pipette for å påføre 10 til 20 mikroliter av de kjemisk faste prøvene til glassmikroskopsklier og la dem lufttørke. Deretter varmefikserer du de lufttørkede prøvene ved å varme opp glasssklier ved hjelp av en Bunsen-brenner.Etter varmefiksing, flekk prøvene med 100 mikroliter 0,1% metylenblå. Etter en 10 minutters inkubasjon med flekken, vask bort overflødig fargestoff med destillert vann. Varm deretter forsiktig de fargede lysbildene til 60 grader Celsius i en ovn i 15 til 20 minutter for å bringe cellene til et felles fokusplan.Forsegle de fargede prøvene ved å plassere et mikroskopdeksel som glir over de fargede cellene. Deretter forsegler du kantene ved hjelp av mikroskopskliesement. Plasser det forseglede mikroskopet på mikroskopstadiet og sett bildet i fokus ved 100X forstørrelse ved hjelp av lysfeltmikroskopi.Plasser en dråpe nedsenkningsolje på mikroskopet og ta med synsfeltet for å fokusere ved hjelp av 1000X forstørrelse. Anskaffe mikrografer ved hjelp av et kamera festet til mikroskopet og tilhørende programvare. Hent bilder ved hjelp av programvarens innstillinger for automatisk hvitbalanse og blenderåpning.Flash kromatografi muliggjør rask rensing av masarimycin med høy renhet. Evaluering av synergi eller antagonisme med ATPase-hemmer optochin i S.pneumoniae presenteres her. Den laveste konsentrasjonen av forbindelsen for å hemme bakterievekst, indikert med den blå fargen, regnes som den minste hemmende konsentrasjonsverdien i nærvær av et ko-stoff.I motsetning indikerer brønner med rosa farge bakteriell vekst. Fenotypiske analyser ved bruk av masarimycin ved 0,75 ganger de minste hemmende konsentrasjonene viste en pølselignende fenotype for B.subtilis og en klumpende fenotype for S.pneumoniae. Vær oppmerksom på temperaturen på reaksjonen.Forsikre deg om at reaksjonen er fullført ved å overvåke med TLC. Denne metoden kan brukes sammen med fluorescerende merkede antibiotika for å undersøke endringer i celleveggen ved mikroskopi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifisering av lite molekyl bindende proteiner i en Native Cellular Miljø via Live-celle Photoaffinity Merking

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metode for å identifisere lavmolekylære inhibitorer av protein-protein samhandling mellom HCN1 og TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifisering av bakteriell histidin kinase Autofosforylering Ved hjelp av en Nitrocellulose bindingsanalyse

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Forbedret Sample Multiplexing av vev ved hjelp Kombinert Precursor Isotop Merking og isobariske Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En vestlig Blotting protokollen for lite antall blodkreft stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinase inhibitor screening i selv-monterte Human protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

A semi-High-gjennomstrømning tilpasning av NADH-koblet ATPase analysen for screening små molekyl hemmere

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-mediert enzymatisk syntese og immobilisering av polymerisert protein for enkeltmolekylet kraftspektroskopi

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse av transkripsjonsaktive alleler av enkeltmolekyl fisk

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-affinitetsrensing kombinert med RNA-sekvensering i Gram-positive bakterier

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...