Name: synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00
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A pesquisa foi apoiada pela Fundação Nacional de Ciência sob o número de bolsas 2009522. A análise da RMN de masarimicina foi apoiada pelo prêmio do programa de instrumentação de pesquisa da National Science Foundation sob o número de bolsas 1919644. Quaisquer opiniões, achados e conclusões ou recomendações expressas neste material são dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da Fundação Nacional de Ciência.

1. Métodos gerais
NOTA: Todos os compostos foram comprados de fornecedores padrão e utilizados sem maiores purificações.
<ol><li>Realize cromatografia de camada fina (TLC) em uma placa de alumínio pré-revestida com gel de sílica XG F254. Detecte manchas sob uma lâmpada UV, por imersão na mancha de p-anisaldeído, ou expondo-se ao vapor I2 .</li>
	<li>Registo de ressonância magnética nuclear (NMR) em um espectrômetro de 400 MHz. NOTA: 1...

Masarimicina é um único inibidor bacteriostático micromolar de B. subtilis35 e S. pneumoniae37 . Em B. subtilis, a masarimicina tem sido demonstrada para inibir o GlcNAcase LytG35, enquanto o alvo molecular preciso na parede celular de S. pneumoniae não foi identificado37. A síntese de masarimicina usando a síntese orgânica clássica ou o procedimento de micro-ondas fornece o inibidor em bom r...

Peptidoglycan (PG) é um polímero em forma de malha que delineia a forma e a estrutura das células em ambas as bactérias Gram-positivas eGram-negativas 1,2. Este heteropolímero é uma matriz de açúcares aminosatrados intercides por peptídeos curtos 3,4,5,6 com uma espinha dorsal composta de resíduos de β N-acetilglucosamina alternada (GlcNAc) e ácido n-acetilmuramic (MurNAc) (Figura 1)1. Anexado ao c-3 lactyl moiety de MurNAc é o peptídeo de haste. O metabolismo de PG envolve um sistema bem coordenado de enzimas biossintéticas e degradativas para incorporar novo material na paredecelular 7,8. A degradação de PG é realizada por enzimas coletivamente referidas como autolysinas9 e ainda classificadas com base na especificidade do vínculo rachado. As autolysinas participam de muitos processos celulares, incluindo crescimento celular, divisão celular, motilidade, maturação de PG, quimiotáxi, secreção de proteínas, competência genética, diferenciação e patogenicidade10,11. Desvendar as funções biológicas específicas das autolysinas individuais pode ser assustador, devido, em parte, à redundância funcional. No entanto, os recentes estudos biofísicos 8,12,13 e computacionais12 forneceram novas informações sobre seus papéis no metabolismo PG. Além disso, relatórios recentes forneceram mais informações sobre a síntese14 e 15,16,17 passos mediados por membrana no metabolismo pg. Uma compreensão completa da relação entre vias degradativas e sintéticas do metabolismo PG poderia dar origem a alvos antibióticos inexplorados anteriormente.
Embora tenha havido avanços significativos na metodologia para estudar a glicobiologia em eucariotes, a glicobiologia bacteriana e, em particular, o metabolismo PG não avançou a uma taxa semelhante. As abordagens químicas atuais para estudar o metabolismo PG incluem antibióticos fluorescentesrotulados 18, sondas fluorescentes19,20 e rotulagem metabólica 21,22,23,24. Essas novas abordagens estão fornecendo novas maneiras de interrogar o metabolismo da parede celular bacteriana. Embora algumas dessas estratégias sejam capazes de rotular PG in vivo, elas podem ser específicas de espécies19, ou apenas trabalhar em cepas sem uma autolysinaparticular 25. Muitas estratégias de rotulagem PG destinam-se ao uso com paredes celulares isoladas26 ou com vias de biossíntese PG in vitro reconstituídas 20,27,28. Atualmente, o uso de antibióticos fluorescentes é limitado a etapas biossintéticas e transpeptidação18.
O conhecimento atual das autolysinas bacterianas e seu papel no metabolismo da parede celular vem da análise bioquímica genética e in vitro 11,29,30,31,32. Embora essas abordagens tenham fornecido uma riqueza de informações sobre esta importante classe de enzimas, decifrar seu papel biológico pode ser desafiador. Por exemplo, devido à redundância funcional33, a exclusão de uma autolise na maioria dos casos não resulta em interrupção do crescimento bacteriano. Isso apesar de seu papel implícito no crescimento celular e na divisão 7,12. Outra complicação é que a exclusão genética de autolysinas bacterianas pode dar origem a meta-fenótipos34. Os meta-fenótipos surgem da complexa interação entre a via afetada pela exclusão genética e outras vias interconectadas. Por exemplo, um meta-fenótipo pode surgir através de um efeito direto, como a falta de uma enzima, ou um efeito indireto, como uma interrupção dos reguladores.
Atualmente, existem apenas alguns inibidores de glicosidase autolysinas como N-acetylglucosaminidases (GlcNAcase) e N-acetylmuramidases, que podem ser usados como sondas químicas para estudar a degradação de PG. Para lidar com isso, a diamide masarimicina (anteriormente denominada fgkc) foi identificada e caracterizada35 como um inibidor bacteriostático do crescimento de subtilis bacilo que tem como alvo o GlcNAcase LytG32 (Figura 1). LytG é um exo-ator glcNAcase36, um membro do cluster 2 dentro da família de hidrolase glicosyl 73 (GH73). É o maior GlcNAcase ativo durante o crescimento vegetativo32. Pelo que sabemos, a masarimicina é o primeiro inibidor de um GLCNAcase de ação pg que inibe o crescimento celular. Estudos adicionais de masarimicina com Streptococcus pneumoniae descobriram que a masarimicina provavelmente inibe o metabolismo da parede celular neste organismo37. Aqui, a preparação da masarimicina é relatada para uso como uma sonda de biologia química para estudar fisiologia nos organismos Gram-positivos B. subtilis, e S. pneumoniae. Exemplos de análise morfológica do tratamento de concentração inibitória submínica com masarimicina, bem como um ensaio de sinergia/antagonismo são apresentados. Ensaios de sinergia e antagonismo usando antibióticos com modos de ação bem definidos podem ser uma maneira útil de explorar conexões entre processos celulares 38,39,40.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Iodobenzoic acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I7675-25G</td>
			<td>corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>109827-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum backed silica plates</td>
			<td>Sorbtech</td>
			<td>4434126</td>
			<td>silica gel XG F254 on aluminum backed plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform-d</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>151823-50G</td>
			<td>solvent for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Mass Spectrometer</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>Advion CMS</td>
			<td>compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>07-200-90</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-547</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexanecarboxaldehyde</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L INC.</td>
			<td>24451</td>
			<td>flammable, irritant, colorless to pink liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl isocyanide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>133302-5G</td>
			<td>irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexylamine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>240648-100ML</td>
			<td>corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>537446-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flash silica cartridge (12g)</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>PF-50SIHP-F0012</td>
			<td>pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>fixing agent for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H8651-25G</td>
			<td>buffer for microscopy fixing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, mixture of isomers</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>178918-4L</td>
			<td>environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance compact mass spectrometer</td>
			<td>Advion</td>
			<td>expression</td>
			<td>Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vac</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>Vacufuge plus</td>
			<td>vacuum aided by centrifugal force and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>258148-2.5L</td>
			<td>corrosive, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td>strong acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-365-19</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine, resublimed crystals</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41955</td>
			<td>environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mestre Mnova</td>
			<td>MestreLab Research</td>
			<td></td>
			<td>software for processing NMR spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>439193-4L</td>
			<td>flammable, toxic, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td>microscopy stain for staining cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>B21176X</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton broth</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>DF0757-17-6</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>22-310397</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Synthesis Labstation</td>
			<td>MILESTONE</td>
			<td>START SYNTH</td>
			<td>device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tubes</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z562769-5EA</td>
			<td>5mm NMR tubes 600 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Resonance (NMR)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Ascend 400</td>
			<td>large superconducting magnet (400MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optochin</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>AAB21627MC</td>
			<td>ethylhydrocupreine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petrie plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229695</td>
			<td>for preparing agar plates for bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for morphology studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puriFlash</td>
			<td>interchim</td>
			<td>XS520plus</td>
			<td>flash chromatography purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resazurin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R7017-1G</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Hei-VAP Value &#34;The Collegiate&#34;</td>
			<td>solvent evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td>irritant, white powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>S271-1</td>
			<td>crystalline, colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>7985592-500G</td>
			<td>anhydrous, granular, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitney DG250 Workstation</td>
			<td>Microbiology International</td>
			<td>DG250</td>
			<td>anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Lite (blue) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for acquiring micrographs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth

Peptidoglycan (PG) na parede celular das bactérias é uma estrutura macromolecular única que confere forma e proteção do ambiente circundante. Central para entender o crescimento e a divisão celular é o conhecimento de como a degradação do PG influencia a biossíntese e a montagem da parede celular. Recentemente, foi relatada a rotulagem metabólica de PG através da introdução de açúcares modificados ou aminoácidos. Embora o interrogatório químico de passos biossintéticos com inibidores de pequenas moléculas seja possível, ferramentas de biologia química para estudar a degradação de PG por autolysinas são subdesenvolvidas. As autolysinas bacterianas são uma ampla classe de enzimas que estão envolvidas na degradação fortemente coordenada de PG. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para o preparo de uma pequena sonda de moléculas, a masarimicina, que é um inibidor de N-acetilglucosaminidase LytG em bacillus subtilis, e metabolismo de parede celular em Streptococcus pneumoniae. A preparação do inibidor por meio de síntese orgânica assistida por micro-ondas e clássica é fornecida. Sua aplicabilidade como ferramenta para estudar fisiologia gram-positiva em ensaios biológicos é apresentada.

Masarimicina é uma pequena molécula inibidora bacteriostática de B. subtilis e S. pneumoniae e tem sido mostrado para inibir o exo-ato glcNAcase LytG em B. subtilis35,37 e atingir a parede celular em S. pneumoniae37. A masarimicina pode ser preparada eficientemente pela síntese orgânica clássica ou assistida por micro-ondas com rendimentos na faixa de 55%-70%. A síntese assistida por micro-ondas t...

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Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

Um protocolo detalhado é apresentado para preparar a diamida bacteriostática masarimycina, uma pequena sonda de moléculas que inibe o crescimento de Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae mirando a degradação da parede celular. Sua aplicação como sonda química é demonstrada em ensaios de sinergia/antagonismo e estudos morfológicos com B. subtilis e S. pneumoniae.

Síntese de Masarimicina, um inibidor de pequenas moléculas do crescimento bacteriano gram-positivo

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

A masarimicina é um dos poucos inibidores de autolysinas bacterianas que interrompe o crescimento celular bacteriano. Pode ser usado para investigar as diferenças entre a inativação química e genética de autolysinas, e fornece uma abordagem ortogonal da genética para estudar a fisiologia bacteriana. A síntese de masarimicina pode parecer assustadora.Siga de perto os passos mostrados. Na dúvida se um passo de reação funcionou, confirme por cromatografia de camada fina e pelas alterações nos valores de RF. Para começar, prepare uma solução 0.1-molar de ciclohexylamina, carboxaldeído cyclohexyl, ácido orto-iodobenzóico, e isocianida de ciclohexyl no metanol.Adicione a barra de agitação magnética, em seguida, misture cinco mililitros de ciclohexilamina e cinco mililitros de carboxaldeído de ciclohexyl em um frasco de fundo redondo tampado e coloque o frasco em um banho de areia em um agitador de placa quente por 30 minutos a 40 graus Celsius. Monitore a temperatura usando um termômetro colocado aproximadamente um centímetro abaixo da superfície da areia. Após 30 minutos, adicione cinco mililitros de isocianto ciclohexil à solução e mexa por mais 20 minutos a 50 graus Celsius.Em seguida, adicione cinco mililitros de ácido orto-iodobenzóico à mistura de reação e continue mexendo a 55 graus Celsius por três a cinco horas. Após três horas de agitação, monitore o progresso da reação periodicamente por cromatografia de camada fina, ou TLC, em intervalos de aproximadamente uma hora. Considere a reação completa quando apenas uma mancha com um fator de retenção igual a 0,3 é visível na placa TLC.Remova o solvente no evaporador rotativo sob pressão reduzida. Uma vez que todo o metanol é evaporado, dissolva o produto bruto seco em 30 mililitros de acetato de etila e transfira-o para um funil separador. Extrair acetato de etila sequencialmente com ácido clorídrico de um molar, água, solução de bicarbonato de sódio saturado, água novamente e solução de cloreto de sódio saturado, descartando as camadas aquosas em cada extração.Em seguida, remova a camada de acetato etílico do funil separador e colete-a em um frasco de Erlenmeyer. Adicione uma espátula cheia de sulfato de sódio anidro para remover água residual do acetato etílico. Filtre a solução de acetato etílico seco através de um papel filtro número um para remover o sulfato de sódio.Em seguida, lave o papel do filtro com uma pequena quantidade de acetato etílico. A solução filtrada de acetato etílico foi evaporada para ressecamento em um evaporador rotativo sob pressão reduzida para obter masarimicina como óleo uma vez que todo o acetato etílico é removido. Dissolva o óleo de masarimicina em um a dois mililitros de um hexano 9:1 para solução isopropanol e mexa em uma placa de agitação magnética até que todo o composto seja dissolvido.Para purificar a masarimicina dissolvida, realize cromatografia flash com uma coluna flash de 12 gramas, de fase normal, sílica. Equilibre a coluna flash com volumes de 10 colunas de fase móvel com os instrumentos definidos a uma vazão de 15 mililitros por minuto. Após a conclusão do equilíbrio, desenhe a masarimicina dissolvida usando uma seringa de cinco mililitros.Conecte a seringa diretamente à parte superior da coluna flash equilibrada e injete a solução na coluna. Reconecte a coluna carregada ao sistema de cromatografia flash e inicie a elução gradiente. Masarimicina eluto da coluna usando elução gradiente para uma concentração final de fase móvel de 10:90 hexano para isopropanol em mais de 12 volumes de coluna.Monitore a eluição da masarimicina via absorção em 230 e 254 nanômetros. Para o estudo da morfologia, grow bacillus subtilis 11774 em placas de ágar LB a 37 graus Celsius. Em todos os experimentos subsequentes, use células de segunda passagem cultivadas em cinco mililitros de caldo LB até que a densidade óptica em 600 nanômetros atinja 1.Em seguida, usando uma pipeta, adicione masarimicina aos tubos de cultura rotulados tratados com uma concentração final de 3,8 micromoles. Para tubos de cultura rotulados controle, adicione um volume equivalente de DMSO. Coloque as amostras em uma incubadora a 37 graus Celsius por 90 minutos com agitação a 150 RPM.Após 90 minutos, conserte quimicamente as culturas em uma mistura de 1:10 de mídia cultural e fixação de buffer a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, use uma pipeta para aplicar de 10 a 20 microlitros das amostras quimicamente fixadas em lâminas de microscópio de vidro e permitir que elas sequem. Em seguida, fixar as amostras secas de ar aquecendo as lâminas de vidro usando um queimador Bunsen.Após a fixação do calor, colorigue as amostras com 100 microlitadores de azul de metileno de 0,1%. Após uma incubação de 10 minutos com a mancha, lave o excesso de corante com água destilada. Em seguida, aqueça suavemente os slides manchados a 60 graus Celsius em um forno por 15 a 20 minutos para levar as células a um plano focal comum.Sele as amostras manchadas colocando uma tampa de microscópio sobre as células manchadas. Em seguida, sele as bordas usando cimento slide de microscópio. Coloque o slide do microscópio selado no estágio do microscópio e coloque a imagem em foco com a ampliação de 100X usando microscopia de campo brilhante.Coloque uma gota de óleo de imersão no slide do microscópio e traga o campo de visão para se concentrar usando a ampliação de 1000X. Adquira micrografias usando uma câmera ligada ao microscópio e seu software associado. Adquira imagens usando as configurações de equilíbrio e abertura automática do software.A cromatografia flash permite a purificação rápida da masarimicina com alta pureza. A avaliação da sinergia ou antagonismo com o inibidor atpase optochin em S.pneumoniae é apresentada aqui. A menor concentração do composto para inibir o crescimento bacteriano, indicada pela cor azul, é considerada o valor mínimo de concentração inibitória na presença de uma co-droga.Em contraste, poços com cor rosa indicam crescimento bacteriano. Ensaios fenotípicos usando masarimicina a 0,75 vezes as concentrações inibitórias mínimas demonstraram um fenótipo semelhante a salsicha para B.subtilis e um fenótipo de s.pneumoniae. Preste atenção à temperatura da reação.Certifique-se de que a reação esteja completa monitorando com tlc. Este método pode ser usado em conjunto com antibióticos fluorescentes rotulados para investigar alterações na parede celular por microscopia.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

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We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

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