Name: synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00
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La investigación fue apoyada por la Fundación Nacional de Ciencias bajo la subvención número 2009522. El análisis de RMN de masaromicina fue apoyado por el premio del programa de instrumentación de investigación principal de la Fundación Nacional de Ciencias bajo el número de subvención 1919644. Cualquier opinión, hallazgo y conclusión, o recomendación expresada en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la National Science Foundation.

1. Métodos generales
NOTA: Todos los compuestos se compraron a proveedores estándar y se utilizaron sin purificación adicional.
<ol><li>Realizar cromatografía de capa fina (TLC) sobre una placa de aluminio precubierta con gel de sílice XG F254. Detectar manchas debajo de una lámpara UV, por inmersión en tinción de p-anisaldehído, o por exposición al vapor I2 .</li>
	<li>Registre todos los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) en un es...

La masarimicina es un único inhibidor bacteriostático micromolar del crecimiento de B. subtilis35 y S. pneumoniae37 . En B. subtilis, se ha demostrado que la masarimicina inhibe la GlcNAcase LytG35, mientras que no se ha identificado la diana molecular precisa en la pared celular de S. pneumoniae 37. La síntesis de masarimicina utilizando la síntesis orgánica clásica o el procedimiento de micro...

Peptidoglicano (PG) es un polímero similar a una malla que delinea la forma y estructura celular en bacterias Gram-positivas y Gram-negativas 1,2. Este heteropolímero es una matriz de aminoazúcares reticulados por péptidos cortos 3,4,5,6 con una columna vertebral compuesta por residuos de ácido N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido N-acetilmurámico (MurNAc) alternados β-(1,4) (Figura 1)1. Unido a la fracción C-3 lactyl de MurNAc está el péptido del tallo. El metabolismo de pg implica un sistema estrechamente coordinado de enzimas biosintéticas y degradativas para incorporar nuevo material en la pared celular 7,8. La degradación de PG se lleva a cabo por enzimas denominadas colectivamente autolisinas9 y clasificadas en función de la especificidad del enlace escindido. Las autolisinas participan en muchos procesos celulares, incluyendo el crecimiento celular, la división celular, la motilidad, la maduración pg, la quimiotaxis, la secreción de proteínas, la competencia genética, la diferenciación y la patogenicidad10,11. Desentrañar las funciones biológicas específicas de las autolisinas individuales puede ser desalentador, debido en parte a la redundancia funcional. Sin embargo, los estudios biofísicos recientes 8,12,13 ycomputacionales 12 han proporcionado una nueva visión de sus roles en el metabolismo de PG. Además, informes recientes han proporcionado más información sobre la síntesis14 ylos 15,16,17 pasos mediados por membrana en el metabolismo de PG. Una comprensión profunda de la relación entre las vías degradativas y sintéticas del metabolismo de PG podría dar lugar a objetivos antibióticos previamente no explotados.
Si bien ha habido avances significativos en la metodología para estudiar la glicobiología en eucariotas, la glicobiología bacteriana y, en particular, el metabolismo de PG no ha avanzado a un ritmo similar. Los enfoques químicos actuales para estudiar el metabolismo de PG incluyen antibióticos marcados fluorescentemente18, sondas fluorescentes19,20 y etiquetado metabólico 21,22,23,24. Estos nuevos enfoques están proporcionando nuevas formas de interrogar el metabolismo de la pared celular bacteriana. Si bien algunas de estas estrategias son capaces de etiquetar PG in vivo, pueden ser específicas de la especie19, o solo funcionan en cepas que carecen de una autolisinaparticular 25. Muchas estrategias de etiquetado de PG están diseñadas para su uso con paredes celulares aisladas26 o con vías de biosíntesis de PG reconstituidas in vitro 20,27,28. El uso de antibióticos marcados fluorescentemente se limita actualmente a pasos biosintéticos y transpeptidación18.
El conocimiento actual de las autolisinas bacterianas y su papel en el metabolismo de la pared celular proviene del análisis bioquímico genético e in vitro 11,29,30,31,32. Si bien estos enfoques han proporcionado una gran cantidad de información sobre esta importante clase de enzimas, descifrar su papel biológico puede ser un desafío. Por ejemplo, debido a la redundancia funcional33, la eliminación de una autolisina en la mayoría de los casos no resulta en la detención del crecimiento bacteriano. Esto es a pesar de su papel implícito en el crecimiento celular y la división 7,12. Otra complicación es que la deleción genética de autolisinas bacterianas puede dar lugar a metafenotipos34. Los metafenotipos surgen de la compleja interacción entre la vía afectada por la deleción genética y otras vías interconectadas. Por ejemplo, un metafenotipo puede surgir a través de un efecto directo, como la falta de una enzima, o un efecto indirecto, como una interrupción de los reguladores.
Actualmente, solo hay unos pocos inhibidores de las autolisinasas glucosidasas como las N-acetilglucosaminidasas (GlcNAcase) y las N-acetilmuramidasas, que se pueden utilizar como sondas químicas para estudiar la degradación de PG. Para abordar esto, la diamida masarimicina (anteriormente denominada como fgkc) ha sido identificada y caracterizada35 como un inhibidor bacteriostático del crecimiento de Bacillus subtilis que se dirige a la GlcNAcase LytG32 (Figura 1). LytG es una GlcNAcase36 de exoacción, un miembro del grupo 2 dentro de la familia de la glicosilhidralasa 73 (GH73). Es el principal activo de GlcNAcase durante el crecimiento vegetativo32. Hasta donde sabemos, la masarimicina es el primer inhibidor de una GlcNAcase que actúa en PG y que inhibe el crecimiento celular. Estudios adicionales de masarimicina con Streptococcus pneumoniae encontraron que la masarimicina probablemente inhibe el metabolismo de la pared celular en este organismo37. Aquí, la preparación de masarimicina se informa para su uso como una sonda de biología química para estudiar la fisiología en los organismos Gram-positivos B. subtilis y S. pneumoniae. Se presentan ejemplos de análisis morfológico del tratamiento de concentración inhibitoria submámica con masarimicina, así como un ensayo de sinergia/antagonismo. Los ensayos de sinergia y antagonismo utilizando antibióticos con modos de acción bien definidos pueden ser una forma útil de explorar las conexiones entre los procesos celulares 38,39,40.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Iodobenzoic acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I7675-25G</td>
			<td>corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>109827-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum backed silica plates</td>
			<td>Sorbtech</td>
			<td>4434126</td>
			<td>silica gel XG F254 on aluminum backed plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform-d</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>151823-50G</td>
			<td>solvent for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Mass Spectrometer</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>Advion CMS</td>
			<td>compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>07-200-90</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-547</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexanecarboxaldehyde</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L INC.</td>
			<td>24451</td>
			<td>flammable, irritant, colorless to pink liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl isocyanide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>133302-5G</td>
			<td>irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexylamine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>240648-100ML</td>
			<td>corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>537446-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flash silica cartridge (12g)</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>PF-50SIHP-F0012</td>
			<td>pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>fixing agent for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H8651-25G</td>
			<td>buffer for microscopy fixing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, mixture of isomers</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>178918-4L</td>
			<td>environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance compact mass spectrometer</td>
			<td>Advion</td>
			<td>expression</td>
			<td>Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vac</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>Vacufuge plus</td>
			<td>vacuum aided by centrifugal force and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>258148-2.5L</td>
			<td>corrosive, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td>strong acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-365-19</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine, resublimed crystals</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41955</td>
			<td>environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mestre Mnova</td>
			<td>MestreLab Research</td>
			<td></td>
			<td>software for processing NMR spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>439193-4L</td>
			<td>flammable, toxic, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td>microscopy stain for staining cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>B21176X</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton broth</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>DF0757-17-6</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>22-310397</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Synthesis Labstation</td>
			<td>MILESTONE</td>
			<td>START SYNTH</td>
			<td>device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tubes</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z562769-5EA</td>
			<td>5mm NMR tubes 600 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Resonance (NMR)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Ascend 400</td>
			<td>large superconducting magnet (400MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optochin</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>AAB21627MC</td>
			<td>ethylhydrocupreine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petrie plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229695</td>
			<td>for preparing agar plates for bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for morphology studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puriFlash</td>
			<td>interchim</td>
			<td>XS520plus</td>
			<td>flash chromatography purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resazurin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R7017-1G</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Hei-VAP Value &#34;The Collegiate&#34;</td>
			<td>solvent evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td>irritant, white powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>S271-1</td>
			<td>crystalline, colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>7985592-500G</td>
			<td>anhydrous, granular, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitney DG250 Workstation</td>
			<td>Microbiology International</td>
			<td>DG250</td>
			<td>anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Lite (blue) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for acquiring micrographs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth

El peptidoglicano (PG) en la pared celular de las bacterias es una estructura macromolecular única que confiere forma y protección del entorno circundante. Un elemento central para comprender el crecimiento y la división celular es el conocimiento de cómo la degradación de PG influye en la biosíntesis y el ensamblaje de la pared celular. Recientemente, se ha reportado el etiquetado metabólico de PG a través de la introducción de azúcares o aminoácidos modificados. Si bien es posible el interrogatorio químico de pasos biosintéticos con inhibidores de moléculas pequeñas, las herramientas de biología química para estudiar la degradación de PG por autolisinas están subdesarrolladas. Las autolisinas bacterianas son una amplia clase de enzimas que están involucradas en la degradación estrechamente coordinada de PG. Aquí, se presenta un protocolo detallado para preparar una sonda de molécula pequeña, masarimicina, que es un inhibidor de la N-acetilglucosaminidasa LytG en Bacillus subtilis, y el metabolismo de la pared celular en Streptococcus pneumoniae. Se proporciona la preparación del inhibidor a través de la síntesis orgánica clásica y asistida por microondas. Se presenta su aplicabilidad como herramienta para estudiar la fisiología Gram-positiva en ensayos biológicos.

La masarimicina es un inhibidor bacteriostático de molécula pequeña de B. subtilis y S. pneumoniae y se ha demostrado que inhibe la GlcNAcase LytG de acción exo-acción en B. subtilis35,37 y se dirige a la pared celular en S. pneumoniae37. La masarimicina se puede preparar de manera eficiente mediante la síntesis orgánica clásica o asistida por microondas con rendimientos en el rango del 55% al 70...

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Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

Se presenta un protocolo detallado para preparar la masarimicina de diamida bacteriostática, una sonda de molécula pequeña que inhibe el crecimiento de Bacillus subtilis y Streptococcus pneumoniae al dirigirse a la degradación de la pared celular. Su aplicación como sonda química está demostrada en ensayos de sinergia/antagonismo y estudios morfológicos con B. subtilis y S. pneumoniae.

Síntesis de masarimicina, un inhibidor de molécula pequeña del crecimiento bacteriano grampositivo

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

La masarimicina es uno de los pocos inhibidores de las autolisinas bacterianas que detiene el crecimiento de las células bacterianas. Se puede utilizar para investigar las diferencias entre la inactivación química y genética de las autolisinas, y proporciona un enfoque ortogonal de la genética para estudiar la fisiología bacteriana. La síntesis de masarimicina puede parecer desalentadora.Siga de cerca los pasos que se muestran. En caso de duda si un paso de reacción funcionó, confirme mediante cromatografía de capa delgada y los cambios en los valores de RF. Para comenzar, prepare una solución 0.1-molar de ciclohexilamina, ciclohexil carboxaldehído, ácido ortoyodobenzoico y ciclohexil isocianuro en metanol.Agregue la barra de agitación magnética, luego, mezcle cinco mililitros de ciclohexilamina y cinco mililitros de ciclohexil carboxaldehído en un matraz de fondo redondo tapado y coloque el matraz en un baño de arena en un agitador de placa caliente durante 30 minutos a 40 grados centígrados. Controle la temperatura con un termómetro colocado aproximadamente un centímetro por debajo de la superficie de arena. Después de 30 minutos, agregue cinco mililitros de ciclohexil isocianuro a la solución y revuelva durante 20 minutos adicionales a 50 grados centígrados.Luego, agregue cinco mililitros de ácido ortoyodobenzoico a la mezcla de reacción y continúe revolviendo a 55 grados Celsius durante tres a cinco horas. Después de tres horas de agitación, monitoree el progreso de la reacción periódicamente mediante cromatografía de capa delgada, o TLC, a intervalos de aproximadamente una hora. Considere la reacción completa cuando solo un punto con un factor de retención igual a 0.3 es visible en la placa TLC.Retire el disolvente en el evaporador rotatorio a presión reducida. Una vez que todo el metanol se evapore, disuelva el producto crudo seco en 30 mililitros de acetato de etilo y transfiéralo a un embudo separador. Extraiga acetato de etilo secuencialmente con ácido clorhídrico monomolar, agua, solución saturada de bicarbonato de sodio, agua nuevamente y solución de cloruro de sodio saturado, descartando las capas acuosas en cada extracción.Luego, retire la capa de acetato de etilo del embudo separador y recójala en un matraz Erlenmeyer. Agregue una espátula llena de sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua residual del acetato de etilo. Filtre la solución seca de acetato de etilo a través de un papel de filtro número uno para eliminar el sulfato de sodio.Luego, lave el papel de filtro con una pequeña cantidad de acetato de etilo. La solución filtrada de acetato de etilo se evaporó a sequedad en un evaporador rotatorio a presión reducida para obtener masaromicina como aceite una vez que se retira todo el acetato de etilo. Disuelva el aceite de masarimicina en uno o dos mililitros de una solución de hexano a isopropanol 9: 1 y revuelva en una placa de agitación magnética hasta que todo el compuesto se disuelva.Para purificar la masarimicina disuelta, realice una cromatografía flash con una columna flash de sílice de fase normal de 12 gramos. Equilibre la columna flash con 10 volúmenes de columna de fase móvil con los instrumentos ajustados a un caudal de 15 mililitros por minuto. Una vez completado el equilibrio, extraiga la masarimicina disuelta con una jeringa de cinco mililitros.Conecte la jeringa directamente a la parte superior de la columna de flash equilibrado e inyecte la solución en la columna. Vuelva a conectar la columna cargada al sistema de cromatografía flash e inicie la elución del gradiente. Elute masarimycin desde la columna usando elución de gradiente hasta una concentración final de fase móvil de 10:90 hexano a isopropanol en 12 volúmenes de columna.Controlar la elución de masarimicina a través de la absorción a 230 y 254 nanómetros. Para el estudio de morfología, cultive bacillus subtilis 11774 en placas de agar LB a 37 grados Centígrados. En todos los experimentos posteriores, use células de segundo paso cultivadas en cinco mililitros de caldo LB hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 1.A continuación, utilizando una pipeta, añadir masarimicina a los tubos de cultivo marcados tratados con una concentración final de 3,8 micromoles. Para los tubos de cultivo etiquetados como control, agregue un volumen equivalente de DMSO. Coloque las muestras en una incubadora a 37 grados centígrados durante 90 minutos con agitación a 150 RPM.Después de 90 minutos, fije químicamente los cultivos en una mezcla 1:10 de medios de cultivo y fije el amortiguador a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, use una pipeta para aplicar de 10 a 20 microlitros de las muestras fijadas químicamente a los portaobjetos de microscopio de vidrio y deje que se sequen al aire. Luego, fije con calor las muestras secas al aire calentando los portaobjetos de vidrio con un quemador Bunsen.Después de la fijación térmica, manche las muestras con 100 microlitros de azul de metileno al 0,1%. Después de una incubación de 10 minutos con la mancha, lave el exceso de tinte con agua destilada. Luego, caliente suavemente los toboganes teñidos a 60 grados Celsius en un horno durante 15 a 20 minutos para llevar las células a un plano focal común.Selle las muestras teñidas colocando un resbalón de la cubierta del microscopio sobre las células teñidas. Luego, selle los bordes con cemento de portaobjetos de microscopio. Coloque el portaobjetos sellado del microscopio en el escenario del microscopio y enfoque la imagen con un aumento de 100X mediante microscopía de campo brillante.Coloque una gota de aceite de inmersión en el portaobjetos del microscopio y enfoque el campo de visión con un aumento de 1000X. Adquirir micrografías utilizando una cámara conectada al microscopio y su software asociado. Adquiera imágenes utilizando la configuración automática de balance de blancos y apertura del software.La cromatografía flash permite una rápida purificación de masarimicina con alta pureza. Aquí se presenta la evaluación de la sinergia o antagonismo con el inhibidor de la ATPasa optoquina en S.pneumoniae. La concentración más baja del compuesto para inhibir el crecimiento bacteriano, indicada por el color azul, se considera el valor mínimo de concentración inhibitoria en presencia de un co-fármaco.En contraste, los pozos con color rosa indican crecimiento bacteriano. Los ensayos fenotípicos que utilizaron masarimicina a 0,75 veces las concentraciones inhibitorias mínimas demostraron un fenotipo similar a la salchicha para B.subtilis y un fenotipo aglutinante para S.pneumoniae. Preste atención a la temperatura de la reacción.Asegúrese de que la reacción se complete mediante el monitoreo con TLC. Este método se puede utilizar junto con antibióticos marcados con fluorescencia para investigar los cambios en la pared celular mediante microscopía.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificación de las pequeñas proteínas de unión a la molécula-celular en un entorno nativo de Células vivas marcado por fotoafinidad

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Investigación

Bioquímica

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Método para la identificación de inhibidores de moléculas pequeñas de la interacción proteína-proteína entre HCN1 y TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

La cuantificación de la histidina quinasa bacteriana autofosforilación mediante un ensayo de nitrocelulosa Encuadernación

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Muestra mejorada Multiplexing de tejidos usando combinada Precursor isotópico etiquetado y isobárico Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Un Western Blot protocolo para una pequeña cantidad de células madre hematopoyéticas

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Detección de inhibidores de la quinasa en microarrays de proteínas humanas autoensamblados

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Una adaptación de semi-alto rendimiento del ensayo ATPase acoplado a NADH para la detección de inhibidores de moléculas pequeñas

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Síntesis enzimática mediada por OaAEP1 e inmovilización de proteína polimerizada para espectroscopia de fuerza de una sola molécula

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única

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MS2-Afinidad Purificación Junto Con La Secuenciación De ARN En Bacterias Gram-Positivas

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...