Name: synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth at JoVE.com

Forskningen stöddes av National Science Foundation under anslagsnummer 2009522. NMR-analys av masarimycin stöddes av National Science Foundations stora forskningsinstrumentprogramtilldelning under bidragsnummer 1919644. Alla åsikter, resultat och slutsatser eller rekommendationer som uttrycks i detta material är författarnas och återspeglar inte nödvändigtvis National Science Foundations åsikter.

1. Allmänna metoder
OBS: Alla föreningar köptes från standardleverantörer och användes utan ytterligare rening.
<ol><li>Utför tunnskiktskromatografi (TLC) på en aluminiumplatta förbelagd med kiselgel XG F254. Upptäck fläckar under en UV-lampa, genom nedsänkning i p-anisaldehydfläck eller genom att utsätta för I2-ånga.</li>
	<li>Registrera alla kärnmagnetiska resonansspektra (NMR) på en 400 MHz spektrometer. OBS: 1H-NMR och ...

Masarimycin är en enda mikromolär bakteriostatisk hämmare av B. subtilis35 och S. pneumoniae37 tillväxt. I B. subtilis har masarimycin visat sig hämma GlcNAcase LytG35, medan det exakta molekylära målet i cellväggen hos S. pneumoniae inte har identifierats37. Syntes av masarimycin med användning av antingen den klassiska organiska syntesen eller mikrovågsproceduren ger hämmaren i gott utby...

Peptidoglykan (PG) är en nätliknande polymer som avgränsar cellform och struktur i både grampositiva och gramnegativa bakterier 1,2. Denna heteropolymer är en matris av aminosocker som är tvärbunden av korta peptider 3,4,5,6 med en ryggrad bestående av β-(1,4)-länkade alternerande N-acetylglukosamin (GlcNAc) och N-acetylmuraminsyra (MurNAc) rester (Figur 1)1. Fäst vid C-3-laktyldelen av MurNAc är stampeptiden. Metabolismen av PG involverar ett tätt samordnat system av biosyntetiska och nedbrytande enzymer för att införliva nytt material i cellväggen 7,8. Nedbrytning av PG utförs av enzymer som kollektivt kallas autolysiner9 och klassificeras vidare baserat på specificiteten hos den kluvna bindningen. Autolysiner deltar i många cellulära processer inklusive celltillväxt, celldelning, rörlighet, PG-mognad, kemotaxis, proteinsekretion, genetisk kompetens, differentiering och patogenicitet 10,11. Att riva upp de specifika biologiska funktionerna hos enskilda autolysiner kan vara skrämmande, delvis på grund av funktionell redundans. Nyligen genomförda biofysiska 8,12,13 och beräkningsstudier12 har dock gett ny inblick i deras roller i PG-metabolismen. Dessutom har de senaste rapporterna gett ytterligare inblick i syntesen14 och membranmedierade 15,16,17 steg i PG-metabolismen. En grundlig förståelse av förhållandet mellan nedbrytande och syntetiska vägar för PG-metabolism kan ge upphov till tidigare outnyttjade antibiotikamål.
Även om det har skett betydande framsteg i metodiken för att studera glykobiologi i eukaryoter, har bakteriell glykobiologi och i synnerhet PG-metabolism inte avancerat i samma takt. Nuvarande kemiska metoder för att studera PG-metabolism inkluderar fluorescerande märkta antibiotika18, fluorescerande sonder19,20 och metabolisk märkning 21,22,23,24. Dessa nya tillvägagångssätt ger nya sätt att förhöra bakteriell cellväggsmetabolism. Medan vissa av dessa strategier kan märka PG in vivo, kan de vara artspecifika19, eller bara fungera i stammar som saknar ett visst autolysin25. Många PG-märkningsstrategier är avsedda att användas med isolerade cellväggar26 eller med in vitro-rekonstituerade PG-biosyntesvägar 20,27,28. Användningen av fluorescerande märkta antibiotika är för närvarande begränsad till biosyntetiska steg och transpeptidering18.
Den nuvarande kunskapen om bakteriella autolysiner och deras roll i cellväggsmetabolismen kommer från genetisk och in vitro biokemisk analys 11,29,30,31,32. Även om dessa tillvägagångssätt har gett en mängd information om denna viktiga klass av enzymer, kan det vara utmanande att dechiffrera deras biologiska roll. Till exempel, på grund av funktionell redundans33, leder radering av ett autolysin i de flesta fall inte till att bakterietillväxten stoppas. Detta trots deras underförstådda roll i celltillväxt och division 7,12. En annan komplikation är att genetisk deletion av bakteriella autolysiner kan ge upphov till metafenotyper34. Metafenotyper uppstår från det komplexa samspelet mellan den väg som påverkas av den genetiska deletionen och andra sammankopplade vägar. Till exempel kan en metafenotyp uppstå via en direkt effekt som bristen på ett enzym eller en indirekt effekt såsom en störning av regulatorer.
För närvarande finns det bara ett fåtal hämmare av glykosidasautolysiner såsom N-acetylglukosaminidaser (GlcNAcase) och N-acetylmuramidaser, som kan användas som kemiska sonder för att studera nedbrytningen av PG. För att ta itu med detta har diamidmasarimycin (tidigare kallat fgkc) identifierats och karakteriserats35 som en bakteriostatisk hämmare av Bacillus subtilis tillväxt som riktar sig mot GlcNAcase LytG32 (Figur 1). LytG är en exoverkande GlcNAcase36, en medlem av kluster 2 inom glykosylhydrolasfamilj 73 (GH73). Det är den viktigaste aktiva GlcNAcase under vegetativ tillväxt32. Såvitt vi vet är masarimycin den första hämmaren av ett PG-verkande GlcNAcase som hämmar cellulär tillväxt. Ytterligare studier av masarimycin med Streptococcus pneumoniae fann att masarimycin sannolikt hämmar cellväggsmetabolismen i denna organism37. Här rapporteras beredningen av masarimycin för användning som en kemisk biologisond för att studera fysiologi i de grampositiva organismerna B. subtilis och S. pneumoniae. Exempel på morfologisk analys av subminimum hämmande koncentrationsbehandling med masarimycin, samt en synergi/antagonismanalys presenteras. Synergi- och antagonismanalyser med antibiotika med väldefinierade verkningssätt kan vara ett användbart sätt att utforska kopplingar mellan cellulära processer 38,39,40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Iodobenzoic acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I7675-25G</td>
			<td>corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>109827-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum backed silica plates</td>
			<td>Sorbtech</td>
			<td>4434126</td>
			<td>silica gel XG F254 on aluminum backed plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform-d</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>151823-50G</td>
			<td>solvent for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Mass Spectrometer</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>Advion CMS</td>
			<td>compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>07-200-90</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-547</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexanecarboxaldehyde</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L INC.</td>
			<td>24451</td>
			<td>flammable, irritant, colorless to pink liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl isocyanide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>133302-5G</td>
			<td>irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexylamine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>240648-100ML</td>
			<td>corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>537446-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flash silica cartridge (12g)</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>PF-50SIHP-F0012</td>
			<td>pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>fixing agent for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H8651-25G</td>
			<td>buffer for microscopy fixing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, mixture of isomers</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>178918-4L</td>
			<td>environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance compact mass spectrometer</td>
			<td>Advion</td>
			<td>expression</td>
			<td>Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vac</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>Vacufuge plus</td>
			<td>vacuum aided by centrifugal force and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>258148-2.5L</td>
			<td>corrosive, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td>strong acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-365-19</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine, resublimed crystals</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41955</td>
			<td>environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mestre Mnova</td>
			<td>MestreLab Research</td>
			<td></td>
			<td>software for processing NMR spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>439193-4L</td>
			<td>flammable, toxic, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td>microscopy stain for staining cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>B21176X</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton broth</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>DF0757-17-6</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>22-310397</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Synthesis Labstation</td>
			<td>MILESTONE</td>
			<td>START SYNTH</td>
			<td>device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tubes</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z562769-5EA</td>
			<td>5mm NMR tubes 600 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Resonance (NMR)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Ascend 400</td>
			<td>large superconducting magnet (400MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optochin</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>AAB21627MC</td>
			<td>ethylhydrocupreine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petrie plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229695</td>
			<td>for preparing agar plates for bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for morphology studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puriFlash</td>
			<td>interchim</td>
			<td>XS520plus</td>
			<td>flash chromatography purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resazurin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R7017-1G</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Hei-VAP Value &#34;The Collegiate&#34;</td>
			<td>solvent evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td>irritant, white powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>S271-1</td>
			<td>crystalline, colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>7985592-500G</td>
			<td>anhydrous, granular, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitney DG250 Workstation</td>
			<td>Microbiology International</td>
			<td>DG250</td>
			<td>anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Lite (blue) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for acquiring micrographs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth

Peptidoglykan (PG) i bakteriens cellvägg är en unik makromolekylär struktur som ger form och skydd mot den omgivande miljön. Centralt för att förstå celltillväxt och delning är kunskapen om hur PG-nedbrytning påverkar biosyntes och cellväggsmontering. Nyligen har den metaboliska märkningen av PG genom införandet av modifierade sockerarter eller aminosyror rapporterats. Medan kemisk förhör av biosyntetiska steg med småmolekylära hämmare är möjliga, är kemiska biologiska verktyg för att studera PG-nedbrytning av autolysiner underutvecklade. Bakteriella autolysiner är en bred klass av enzymer som är involverade i den tätt samordnade nedbrytningen av PG. Här presenteras ett detaljerat protokoll för framställning av en liten molekylsond, masarimycin, som är en hämmare av N-acetylglukosaminidas LytG i Bacillus subtilis och cellväggsmetabolism i Streptococcus pneumoniae. Framställning av hämmaren via mikrovågsassisterad och klassisk organisk syntes tillhandahålls. Dess tillämplighet som ett verktyg för att studera grampositiv fysiologi i biologiska analyser presenteras.

Masarimycin är en liten molekyl bakteriostatisk hämmare av B. subtilis och S. pneumoniae och har visat sig hämma den exoverkande GlcNAcase LytG i B. subtilis35,37 och rikta cellväggen i S. pneumoniae37. Masarimycin kan effektivt framställas antingen genom den klassiska eller mikrovågsassisterade organiska syntesen med utbyten i intervallet 55% -70%. Mikrovågsassisterad syntes har fördelen av en s...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth at JoVE.com

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

Ett detaljerat protokoll presenteras för beredning av den bakteriostatiska diamidmasarimycin, en liten molekylsond som hämmar tillväxten av Bacillus subtilis och Streptococcus pneumoniae genom att rikta in sig på nedbrytning av cellväggen. Dess tillämpning som en kemisk sond demonstreras i synergi/antagonismanalyser och morfologiska studier med B. subtilis och S. pneumoniae.

Syntes av masarimycin, en liten molekylhämmare av grampositiv bakterietillväxt

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Masarimycin är en av de få hämmare av bakteriella autolysiner som stoppar bakteriecelltillväxten. Det kan användas för att undersöka skillnaderna mellan kemisk och genetisk inaktivering av autolysiner och ger ett ortogonalt tillvägagångssätt för genetik för att studera bakteriell fysiologi. Syntes av masarimycin kan verka skrämmande.Följ noga stegen som visas. Om du är osäker på om ett reaktionssteg fungerade, bekräfta med tunnskiktskromatografi och förändringarna i RF-värden. Börja med att förbereda en 0,1-molär lösning av cyklohexylamin, cyklohexylkarboxaldehyd, ortojodbensoesyra och cyklohexylesocyanid i metanol.Tillsätt magnetisk omrörningsstång, blanda sedan fem milliliter cyklohexylamin och fem milliliter cyklohexylkarboxaldehyd i en täckt rundbottenkolv och placera kolven i ett sandbad på en kokplatta omrörare i 30 minuter vid 40 grader Celsius. Övervaka temperaturen med en termometer placerad ungefär en centimeter under sandytan. Efter 30 minuter tillsätt fem milliliter cyklohexylezocylid till lösningen och rör om i ytterligare 20 minuter vid 50 grader Celsius.Tillsätt sedan fem milliliter orto-jodobensoesyra till reaktionsblandningen och fortsätt omrörningen vid 55 grader Celsius i tre till fem timmar. Efter tre timmars omrörning, övervaka reaktionens framsteg regelbundet genom tunnskiktskromatografi eller TLC med ungefär en timmes mellanrum. Tänk på reaktionen fullständig när endast en fläck med en retentionsfaktor lika med 0,3 är synlig på TLC-plattan.Ta bort lösningsmedlet i roterande förångare under reducerat tryck. När all metanol har avdunstats, lös upp den torkade råprodukten i 30 ml etylacetat och överför den till en separatorstratt. Extrahera etylacetat sekventiellt med en molär saltsyra, vatten, mättad natriumbikarbonatlösning, vatten igen och mättad natriumkloridlösning, kassera de vattenhaltiga skikten vid varje extraktion.Ta sedan bort etylacetatskiktet från separatorstratten och samla det i en Erlenmeyerkolv. Tillsätt en spatel full av vattenfritt natriumsulfat för att avlägsna kvarvarande vatten från etylacetat. Filtrera den torkade etylacetatlösningen genom ett filterpapper nummer ett för att avlägsna natriumsulfatet.Tvätta sedan filterpapperet med en liten mängd etylacetat. Den filtrerade etylacetatlösningen indunstades till torrhet på en roterande förångare under reducerat tryck för att erhålla masarimycin som olja när allt etylacetat har avlägsnats. Lös upp masarimycinoljan i en till två milliliter av en 9:1 hexan till isopropanollösning och rör om på en magnetisk omrörningsplatta tills hela föreningen är upplöst.För att rena det upplösta masarimycinet, utför blixtkromatografi med en 12 gram, normalfas, kiseldioxidblixtkolonn. Balansera blixtkolonnen med 10 kolonnvolymer av mobilfas med instrumenten inställda på en flödeshastighet på 15 ml per minut. När jämvikten är klar, dra det upplösta masarimycinet med en fem milliliter spruta.Anslut sprutan direkt till toppen av den jämviktade blixtkolonnen och injicera lösningen i kolonnen. Anslut den laddade kolonnen till blixtkromatografisystemet igen och initiera gradientelueringen. Elut masarimycin från kolonnen med gradienteluering till en slutlig mobil faskoncentration på 10:90 hexan till isopropanol över 12 kolonnvolymer.Övervaka elueringen av masarimycin via absorption vid 230 och 254 nanometer. För morfologistudien, odla bacillus subtilis 11774 på LB agarplattor vid 37 grader Celsius. I alla efterföljande experiment, använd andra passageceller odlade i fem milliliter LB-buljong tills den optiska densiteten vid 600 nanometer når 1.Därefter tillsätt masarimycin till odlingsrören märkta behandlade med en pipett med en slutlig koncentration av 3,8 mikromol. För odlingsrör märkta kontroll, lägg till en motsvarande volym DMSO. Placera proverna i en inkubator vid 37 grader Celsius i 90 minuter med skakning vid 150 RPM.Efter 90 minuter fixerar du kulturerna kemiskt i en 1:10-blandning av odlingsmedier och fixerar bufferten vid fyra grader Celsius över natten. Följande dag, använd en pipett för att applicera 10 till 20 mikroliter av de kemiskt fixerade proverna på glasmikroskopglas och låt dem lufttorka. Värm sedan de lufttorkade proverna genom att värma glasglasen med en Bunsen-brännare.Efter värmefixering, fläck proverna med 100 mikroliter av 0,1% metylenblå. Tvätta bort överflödigt färgämne med destillerat vatten efter en 10 minuters inkubation med fläcken. Värm sedan försiktigt de färgade bilderna till 60 grader Celsius i en ugn i 15 till 20 minuter för att föra cellerna till ett gemensamt fokalplan.Försegla de färgade proverna genom att placera ett mikroskopskydd över de färgade cellerna. Försegla sedan kanterna med mikroskopglidcement. Placera den förseglade mikroskopbilden på mikroskopsteget och sätt bilden i fokus vid 100X förstoring med hjälp av ljusfältsmikroskopi.Placera en droppe nedsänkningsolja på mikroskopbilden och sätt synfältet i fokus med 1000X förstoring. Skaffa mikrografer med hjälp av en kamera som är ansluten till mikroskopet och dess tillhörande programvara. Hämta bilder med programvarans automatiska vitbalans- och bländarinställningar.Blixtkromatografi möjliggör snabb rening av masarimycin med hög renhet. Utvärdering av synergi eller antagonism med ATPashämmaren optochin i S.pneumoniae presenteras här. Den lägsta koncentrationen av föreningen för att hämma bakterietillväxt, indikerad av den blå färgen, anses vara det minsta hämmande koncentrationsvärdet i närvaro av ett samläkemedel.Däremot indikerar brunnar med rosa färg bakterietillväxt. Fenotypiska analyser med masarimycin vid 0,75 gånger de minsta hämmande koncentrationerna visade en korvliknande fenotyp för B.subtilis och en klumpande fenotyp för S.pneumoniae. Var uppmärksam på reaktionens temperatur.Se till att reaktionen är klar genom övervakning med TLC. Denna metod kan användas tillsammans med fluorescerande märkta antibiotika för att undersöka förändringar i cellväggen genom mikroskopi.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifiering av liten molekyl-bindande proteiner i en Native Cellular miljö med Live-cell fotoaffinitetsmärkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Metod för att identifiera små molekylhämmare av protein-proteininteraktion Mellan HCN1 och TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifiering av Bacterial Histidin Kinase-autofosforylering med hjälp av en Nitrocellulosabindningsanalys

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Förbättrad Prov Multiplexing av vävnader med användning Kombinerade Prekursor isotopmärkning och Isobaric Tagging (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

En Western Blotting protokoll för litet numrerar av hematopoetiska stamceller

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kinashämmare screening i självmonterade humana Proteinmikromatriser

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

En semi-High-genomströmning anpassning av NADH-kopplad ATPas-analys för screening av småmolekylära hämmare

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-medierad enzymatisk syntes och immobilisering av polymeriserat protein för enmolekylkraftsspektroskopi

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-affinitetsrening i kombination med RNA-sekvensering i grampositiva bakterier

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...