Name: synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth at JoVE.com

Araştırma, Ulusal Bilim Vakfı tarafından 2009522 hibe numarası altında desteklenmiştir. Masarimisin'in NMR analizi, Ulusal Bilim Vakfı büyük araştırma enstrümantasyon programı ödülü tarafından 1919644 hibe numarası altında desteklenmiştir. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç veya öneri yazarlara aittir ve mutlaka Ulusal Bilim Vakfı'nın görüşlerini yansıtmaz.

1. Genel yöntemler
NOT: Tüm bileşikler standart tedarikçilerden satın alınmış ve daha fazla saflaştırma yapılmadan kullanılmıştır.
<ol><li>Silika jel XG F254 ile önceden kaplanmış bir alüminyum plaka üzerinde ince tabaka kromatografisi (TLC) gerçekleştirin. UV lambasının altındaki lekeleri, p-anisaldehit lekesine daldırarak veya I2 buharına maruz bırakarak tespit edin.</li>
	<li>Tüm nükleer manyetik rezonans (NMR) spektrumlar...

Masarimisin, B. subtilis35 ve S. pneumoniae37 büyümesinin tek bir mikromolar bakteriyostatik inhibitörüdür. B. subtilis'te , masarimycin'in GlcNAcase LytG35'i inhibe ettiği gösterilirken, S. pneumoniae'nin hücre duvarındaki kesin moleküler hedef tanımlanmamıştır37. Klasik organik sentez veya mikrodalga prosedürü kullanılarak masarimisin sentezi, inhibitörün iyi verim ve yüksek saf...

Peptidoglikan (PG), hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakterilerde hücre şeklini ve yapısını tanımlayan ağ benzeri bir polimerdir 1,2. Bu heteropolimer, β-(1,4)-bağlı alternatif N-asetilglukozamin (GlcNAc) ve N-asetilmuramik asit (MurNAc) kalıntılarından oluşan bir omurgaya sahip kısa peptitler 3,4,5,6 ile çapraz bağlanmış bir amino şeker matrisidir (Şekil 1)1. MurNAc'nin C-3 laktil moiety'sine bağlı kök peptididir. PG'nin metabolizması, hücre duvarına yeni materyal dahil etmek için sıkı bir şekilde koordine edilmiş bir biyosentetik ve degradatif enzim sistemini içerir 7,8. PG'nin parçalanması, topluca otolizinler9 olarak adlandırılan enzimler tarafından gerçekleştirilir ve ayrıca bölünen bağın özgüllüğüne göre sınıflandırılır. Otolizinler hücre büyümesi, hücre bölünmesi, hareketlilik, PG olgunlaşması, kemotaksis, protein sekresyonu, genetik yeterlilik, farklılaşma ve patojenite gibi birçok hücresel sürece katılır10,11. Bireysel otolizinlerin spesifik biyolojik fonksiyonlarını çözmek, kısmen fonksiyonel fazlalık nedeniyle göz korkutucu olabilir. Bununla birlikte, son biyofiziksel 8,12,13 ve hesaplamalı çalışmalar 12, PG metabolizmasındaki rolleri hakkında yeni bilgiler sağlamıştır. Ek olarak, son raporlar PG metabolizmasındaki sentez14 ve membran aracılı15,16,17 adım hakkında daha fazla bilgi sağlamıştır. PG metabolizmasının degradatif ve sentetik yolları arasındaki ilişkinin tam olarak anlaşılması, daha önce kullanılmayan antibiyotik hedeflerine yol açabilir.
Ökaryotlarda glikobiyolojiyi incelemek için metodolojide önemli ilerlemeler kaydedilmesine rağmen, bakteriyel glikobiyoloji ve özellikle PG metabolizması benzer bir oranda ilerlememiştir. PG metabolizmasını incelemek için mevcut kimyasal yaklaşımlar arasında floresan olarak etiketlenmiş antibiyotikler18, floresan problar19,20 ve metabolik etiketleme 21,22,23,24 bulunmaktadır. Bu yeni yaklaşımlar, bakteriyel hücre duvarı metabolizmasını sorgulamak için yeni yollar sunmaktadır. Bu stratejilerden bazıları PG'yi in vivo olarak etiketleyebilse de, türe özgü19 olabilir veya yalnızca belirli bir otolizin25'ten yoksun suşlarda çalışabilir. Birçok PG etiketleme stratejisi, izole hücre duvarları 26 veya in vitro yeniden yapılandırılmış PG biyosentez yolları20,27,28 ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Floresan etiketli antibiyotiklerin kullanımı şu anda biyosentetik adımlar ve transpeptitasyon18 ile sınırlıdır.
Bakteriyel otolizinler ve hücre duvarı metabolizmasındaki rolleri hakkındaki güncel bilgiler genetik ve in vitro biyokimyasal analizlerden gelmektedir 11,29,30,31,32. Bu yaklaşımlar bu önemli enzim sınıfı hakkında zengin bir bilgi sağlamış olsa da, biyolojik rollerini deşifre etmek zor olabilir. Örneğin, fonksiyonel artıklık33 nedeniyle, çoğu durumda bir otolizinin silinmesi bakteriyel büyümenin durmasına neden olmaz. Bu, hücre büyümesi ve bölünme 7,12'deki zımni rollerine rağmen. Diğer bir komplikasyon ise, bakteriyel otolizinlerin genetik olarak silinmesinin meta-fenotiplere yol açabilmesidir34. Meta-fenotipler, genetik delesyondan etkilenen yol ile diğer birbirine bağlı yollar arasındaki karmaşık etkileşimden kaynaklanır. Örneğin, bir meta-fenotip, bir enzimin eksikliği gibi doğrudan bir etki veya düzenleyicilerin bozulması gibi dolaylı bir etki yoluyla ortaya çıkabilir.
Şu anda, PG'nin parçalanmasını incelemek için kimyasal problar olarak kullanılabilen N-asetilglukozaminidazlar (GlcNAcase) ve N-asetilmuramidazlar gibi glikozidaz otolizinlerinin sadece birkaç inhibitörü vardır. Bunu ele almak için, diamid masarimycin (daha önce fgkc olarak adlandırılan), GlcNAcase LytG32'yi hedef alan Bacillus subtilis büyümesinin bakteriyostatik bir inhibitörü olarak35 tanımlanmış ve karakterize edilmiştir (Şekil 1). LytG, glikozil hidrolaz ailesi 73 (GH73) içindeki küme 2'nin bir üyesi olan ekzo-etkili bir GlcNAcase36'dır. Vejetatif büyüme sırasında ana aktif GlcNAcase'dir32. Bildiğimiz kadarıyla, masarimycin, hücresel büyümeyi inhibe eden PG etkili bir GlcNAcase'in ilk inhibitörüdür. Streptococcus pneumoniae ile masarimycin üzerine yapılan ek çalışmalar, masarimycin'in muhtemelen bu organizmada hücre duvarı metabolizmasını inhibe ettiğini bulmuştur37. Burada, masarimycin'in hazırlanmasının, Gram-pozitif organizmalar B. subtilis ve S. pneumoniae'de fizyolojiyi incelemek için kimyasal bir biyoloji probu olarak kullanılması için rapor edilmiştir. Masarimisin ile minal-minimum inhibitör konsantrasyon tedavisinin morfolojik analizinin yanı sıra bir sinerji / antagonizma testi örnekleri sunulmuştur. İyi tanımlanmış etki modlarına sahip antibiyotiklerin kullanıldığı sinerji ve antagonizma testleri, hücresel süreçler arasındaki bağlantıları araştırmak için yararlı bir yol olabilir38,39,40.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Iodobenzoic acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>I7675-25G</td>
			<td>corrosive, irritant, light yellow to orange-brown powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>109827-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>34851-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum backed silica plates</td>
			<td>Sorbtech</td>
			<td>4434126</td>
			<td>silica gel XG F254 on aluminum backed plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform-d</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>151823-50G</td>
			<td>solvent for NMR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compact Mass Spectrometer</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>Advion CMS</td>
			<td>compact mass spectrometer equiped with APCI source and atmospheric solids analysis probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterile</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>07-200-90</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover slips</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-547</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexanecarboxaldehyde</td>
			<td>CHEM-IMPEX INT&#39;L INC.</td>
			<td>24451</td>
			<td>flammable, irritant, colorless to pink liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexyl isocyanide</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>133302-5G</td>
			<td>irritant, colorless liquid, extremly unpleasant odor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexylamine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>240648-100ML</td>
			<td>corrosive, flammable, irritant, colorless liquid unless contaminated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl acetate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>537446-4L</td>
			<td>flammable, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>flash silica cartridge (12g)</td>
			<td>Advion-Interchim</td>
			<td>PF-50SIHP-F0012</td>
			<td>pack of flash silica columns (12g) for purification of masarimycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formaldehyde</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F8775-25ML</td>
			<td>fixing agent for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H8651-25G</td>
			<td>buffer for microscopy fixing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexane, mixture of isomers</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>178918-4L</td>
			<td>environmentally damaging, flammable, irritant, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High performance compact mass spectrometer</td>
			<td>Advion</td>
			<td>expression</td>
			<td>Atmospheric Solids Analysis Probe (ASAP), low resolution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Vac</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>Vacufuge plus</td>
			<td>vacuum aided by centrifugal force and temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>258148-2.5L</td>
			<td>corrosive, irritant, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydrochloric acid</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>320331-2.5L</td>
			<td>strong acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>immersion oil</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>12-365-19</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodine, resublimed crystals</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>41955</td>
			<td>environmentally damaging, irritant, health hazard, dark grey/purple crystals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mestre Mnova</td>
			<td>MestreLab Research</td>
			<td></td>
			<td>software for processing NMR spectra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>439193-4L</td>
			<td>flammable, toxic, health hazard, colorless liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methylene blue</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9140-25G</td>
			<td>microscopy stain for staining cell walls</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton agar plates + 5% sheep blood</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>B21176X</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>meuller-hinton broth</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>DF0757-17-6</td>
			<td>growth media for Streptococcus pneumoniae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>22-310397</td>
			<td>for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Synthesis Labstation</td>
			<td>MILESTONE</td>
			<td>START SYNTH</td>
			<td>device that requires the ventilation of a fume hood, equipped with synthesis carousel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tubes</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z562769-5EA</td>
			<td>5mm NMR tubes 600 MHz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclear Magnetic Resonance (NMR)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Ascend 400</td>
			<td>large superconducting magnet (400MHz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>optochin</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>AAB21627MC</td>
			<td>ethylhydrocupreine hydrochloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petrie plates</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229695</td>
			<td>for preparing agar plates for bacterial growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for morphology studies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>puriFlash</td>
			<td>interchim</td>
			<td>XS520plus</td>
			<td>flash chromatography purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resazurin</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>R7017-1G</td>
			<td>for synergy/antagonism assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Evaporator</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Hei-VAP Value &#34;The Collegiate&#34;</td>
			<td>solvent evaporator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S6014-500G</td>
			<td>irritant, white powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>S271-1</td>
			<td>crystalline, colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>S5886-500G</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>7985592-500G</td>
			<td>anhydrous, granular, white</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whitney DG250 Workstation</td>
			<td>Microbiology International</td>
			<td>DG250</td>
			<td>anaerobic workstation. Anaerobic gas mixture used: 5% hydrogen, 10% carbon dioxide, balance nitrogen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>fisher chemical</td>
			<td>BP1422-500</td>
			<td>for growth of B.subtilis and preparation of LB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Lite (blue) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>for acquiring micrographs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

synthesis of masarimycin, a small molecule inhibitor of gram-positive bacterial growth

Bakterilerin hücre duvarındaki peptidoglikan (PG), şekil veren ve çevredeki ortamdan koruma sağlayan benzersiz bir makromoleküler yapıdır. Hücre büyümesini ve bölünmesini anlamanın merkezinde, PG bozunmasının biyosentezi ve hücre duvarı montajını nasıl etkilediği bilgisi vardır. Son zamanlarda, PG'nin modifiye şekerlerin veya amino asitlerin eklenmesiyle metabolik etiketlenmesi bildirilmiştir. Küçük molekül inhibitörleri ile biyosentetik adımların kimyasal sorgulanması mümkün olsa da, otolizinler tarafından PG bozunmasını incelemek için kimyasal biyoloji araçları az gelişmiştir. Bakteriyel otolizinler, PG'nin sıkı bir şekilde koordine edilmiş bozunmasında rol oynayan geniş bir enzim sınıfıdır. Burada, Bacillus subtilis'te N-asetilglukozamidaz LytG'nin bir inhibitörü olan küçük moleküllü bir prob olan masarimycin'in ve Streptococcus pneumoniae'de hücre duvarı metabolizmasının hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. İnhibitörün mikrodalga yardımlı ve klasik organik sentez yoluyla hazırlanması sağlanır. Biyolojik tahlillerde Gram-pozitif fizyolojiyi incelemek için bir araç olarak uygulanabilirliği sunulmaktadır.

Masarimisin, B. subtilis ve S. pneumoniae'nin küçük moleküllü bakteriyostatik inhibitörüdür ve B. subtilis35,37'de ekzo-etkili GlcNAcase LytG'yi inhibe ettiği ve S. pneumoniae37'de hücre duvarını hedef aldığı gösterilmiştir. Masarimisin, klasik veya mikrodalga destekli organik sentez ile% 55 -% 70 aralığında verimlerle verimli bir şekilde hazırlanabilir. Mikrodalga destekli sentez,...

Watch this Scientific Journal Video about Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth at JoVE.com

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

Hücre duvarı bozulmasını hedefleyerek Bacillus subtilis ve Streptococcus pneumoniae'nin büyümesini engelleyen küçük moleküllü bir prob olan bakteriyostatik diamide masarimycin'in hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Kimyasal bir prob olarak uygulanması, sinerji / antagonizma tahlillerinde ve B. subtilis ve S. pneumoniae ile morfolojik çalışmalarda gösterilmiştir.

Gram-pozitif bakteriyel büyümenin küçük moleküllü bir inhibitörü olan masarimisinin sentezi

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Masarimisin, bakteriyel hücre büyümesini durduran bakteriyel otolizinlerin birkaç inhibitöründen biridir. Otolizinlerin kimyasal ve genetik inaktivasyonu arasındaki farkları araştırmak için kullanılabilir ve bakteriyel fizyolojiyi incelemek için genetiğe ortogonal bir yaklaşım sağlar. Masarimisin sentezi göz korkutucu görünebilir.Gösterilen adımları yakından takip edin. Bir reaksiyon adımının işe yarayıp yaramadığı konusunda şüphe duyduğunuzda, ince tabaka kromatografisi ve RF değerlerindeki değişiklikleri onaylayın. Başlamak için, metanol içinde 0.1 molar bir sikloheksilamin, sikloheksil karboksaldehit, orto-iyodobenzoik asit ve sikloheksil izosiyanür çözeltisi hazırlayın.Manyetik karıştırma çubuğu ekleyin, ardından beş mililitre sikloheksilamin ve beş mililitre sikloheksil karboksaldehiti kapaklı yuvarlak tabanlı bir şişede karıştırın ve şişeyi 40 santigrat derecede 30 dakika boyunca sıcak plaka karıştırıcı üzerinde bir kum banyosuna yerleştirin. Kum yüzeyinin yaklaşık bir santimetre altına yerleştirilmiş bir termometre kullanarak sıcaklığı izleyin. 30 dakika sonra, çözeltiye beş mililitre sikloheksil izosiyanür ekleyin ve 50 santigrat derecede 20 dakika daha karıştırın.Daha sonra, reaksiyon karışımına beş mililitre orto-iyodobenzoik asit ekleyin ve üç ila beş saat boyunca 55 santigrat derecede karıştırmaya devam edin. Üç saatlik karıştırmadan sonra, reaksiyonun ilerlemesini periyodik olarak ince tabaka kromatografisi veya TLC ile yaklaşık bir saatlik aralıklarla izleyin. TLC plakasında 0,3'e eşit tutma faktörüne sahip yalnızca bir nokta göründüğünde reaksiyonun tamamlandığını düşünün.Çözücüyü döner evaporatörde düşük basınç altında çıkarın. Tüm metanol buharlaştırıldıktan sonra, kurutulmuş ham ürünü 30 mililitre etil asetat içinde çözün ve bir ayırma hunisine aktarın. Etil asetat tek molar hidroklorik asit, su, doymuş sodyum bikarbonat çözeltisi, tekrar su ve doymuş sodyum klorür çözeltisi ile sırayla ekstrakte edin ve her ekstraksiyonda sulu tabakaları atın.Ardından, etil asetat tabakasını ayırıcı huniden çıkarın ve bir Erlenmeyer şişesinde toplayın. Etil asetattan kalan suyu gidermek için susuz sodyum sülfatla dolu bir spatula ekleyin. Sodyum sülfatı çıkarmak için kurutulmuş etil asetat çözeltisini bir numaralı filtre kağıdından süzün.Ardından, filtre kağıdını az miktarda etil asetat ile yıkayın. Filtrelenmiş etil asetat çözeltisi, tüm etil asetat çıkarıldıktan sonra yağ olarak masarimisin elde etmek için düşük basınç altında döner bir evaporatör üzerinde kuruluğa buharlaştırıldı. Masarimisin yağını bir ila iki mililitre 9: 1 hekzandan izopropanol çözeltisine çözün ve tüm bileşik çözülene kadar manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın.Çözünmüş masarimycin'i saflaştırmak için, 12 gramlık, normal fazlı, silika flaş sütunu ile flaş kromatografisi yapın. Flaş kolonunu 10 sütun hacmi mobil faz ile dengeleyin, cihazlar dakikada 15 mililitre akış hızına ayarlanmıştır. Denge tamamlandıktan sonra, çözünmüş masarimycin'i beş mililitrelik bir şırınga kullanarak çekin.Şırıngayı doğrudan dengelenmiş flaş sütununun üstüne bağlayın ve çözeltiyi sütuna enjekte edin. Yüklenen sütunu flaş kromatografisi sistemine yeniden bağlayın ve gradyan elüsyonunu başlatın. Gradyan elüsyonu kullanarak kolondan masarimycin'i, 12 sütun hacmi üzerinde izopropanole 10:90 hekzan son mobil faz konsantrasyonuna kadar elute.Masarimisin elüsyonunu 230 ve 254 nanometrede absorpsiyon yoluyla izleyin. Morfoloji çalışması için, LB agar plakalarında 37 santigrat derecede bacillus subtilis 11774 büyütün. Sonraki tüm deneylerde, 600 nanometredeki optik yoğunluk 1'e ulaşana kadar beş mililitre LB suyunda yetiştirilen ikinci geçiş hücrelerini kullanın.Daha sonra, bir pipet kullanarak, 3.8 mikromollük bir son konsantrasyona muamele edilmiş etiketli kültür tüplerine masarimycin ekleyin. Kontrol etiketli kültür tüpleri için, eşdeğer bir DMSO hacmi ekleyin. Numuneleri 150 RPM'de çalkalayarak 90 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin.90 dakika sonra, kültürleri 1:10'luk bir kültür ortamı karışımında ve tamponu gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyerek kimyasal olarak sabitleyin. Ertesi gün, kimyasal olarak sabitlenmiş numunelerin 10 ila 20 mikrolitresini cam mikroskop slaytlarına uygulamak ve havayla kurumasını sağlamak için bir pipet kullanın. Ardından, bir Bunsen brülörü kullanarak cam slaytları ısıtarak hava ile kurutulmuş numuneleri ısıtın.Isıl sabitlemeden sonra, numuneleri 100 mikrolitre% 0.1 metilen mavisi ile boyayın. Leke ile 10 dakikalık bir inkübasyondan sonra, fazla boyayı damıtılmış suyla yıkayın. Daha sonra, hücreleri ortak bir odak düzlemine getirmek için lekeli slaytları bir fırında 15 ila 20 dakika boyunca 60 santigrat dereceye kadar hafifçe ısıtın.Lekeli numuneleri, lekeli hücrelerin üzerine mikroskop kapak kayması yerleştirerek kapatın. Ardından, mikroskop slayt çimentosu kullanarak kenarları kapatın. Kapalı mikroskop slaytını mikroskop aşamasına yerleştirin ve parlak alan mikroskobu kullanarak görüntüyü 100X büyütmede odaklayın.Mikroskop slaytına bir damla daldırma yağı yerleştirin ve 1000X büyütme kullanarak görüş alanını odaklamaya getirin. Mikroskopa ve ilgili yazılıma bağlı bir kamera kullanarak mikrograflar edinin. Yazılımın otomatik beyaz dengesini ve diyafram ayarlarını kullanarak görüntüler elde edin.Flaş kromatografisi, masarimisin yüksek saflıkta hızlı saflaştırılmasını sağlar. Burada S.pneumoniae'de ATPaz inhibitörü optochin ile sinerji veya antagonizmanın değerlendirilmesi sunulmuştur. Mavi renkle gösterilen bakteriyel büyümeyi inhibe etmek için bileşiğin en düşük konsantrasyonu, bir yardımcı ilacın varlığında minimum inhibitör konsantrasyon değeri olarak kabul edilir.Buna karşılık, pembe renkli kuyular bakteri büyümesini gösterir. Minimum inhibitör konsantrasyonların 0.75 katında masarimycin kullanılarak yapılan fenotipik analizler, B.subtilis için sosis benzeri bir fenotip ve S.pneumoniae için kümelenen bir fenotip göstermiştir. Reaksiyonun sıcaklığına dikkat edin.TLC ile izleyerek reaksiyonun tamamlandığından emin olun. Bu yöntem, mikroskopi ile hücre duvarındaki değişiklikleri araştırmak için floresan etiketli antibiyotiklerle birlikte kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

bir nitroselüloz Bağlama Deneyi kullanılarak bakteriyel Histidin Kinaz otofosforilasyon miktarının belirlenmesi

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

There is an increasing demand to analyze many biological samples for disease understanding and biomarker discovery. Quantitative proteomics strategies ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Bir Western Protokolü hematopoetik kök hücre küçük sayılar için kurutma

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

Kendi kendine monte Edilen İnsan Protein Mikrodizilerinde Kiaz Inhibitörü Taraması

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Küçük Molekül Inhibitörlerinin Taranması için NADH-Coupled ATPase Tsay'ın Yarı-Yüksek İş-İşLenme Adaptasyonu

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MS2-Benzeşim Saflaştırma gram-pozitif bakterilerde RNA Dizilimi ile birleştiğinde

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...