Name: preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle
Uploaded: 2021-10-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle at JoVE.com

Detta arbete finansierades av National Natural Science Foundation of China (31971663) och Young Elite Scientists Sponsorship Program av CAST (2020QNRC001).

1. Insektsuppfödning
<ol><li>Håll P. versicolora-populationen i en tillväxtkammare vid 27 °C och 70 ± 5 % relativ luftfuktighet med en fotoperiod på 16 timmar ljus/8 timmar mörk. Placera dem i perforerade plastlådor med kaklat vått absorberande papper och mata dem med färska poppelgrenar. Spraya rent vatten på absorberande papper för att bibehålla fukt och byt grenarna varannan dag.</li>
	<li>Isolera vuxna för oviposition efter valpning. Foder dem ömma löv för att få fler äg...

<ol>
	<li>Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+and+ecological+consequences+of+gut+microbial+communities.">Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities.</a> Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).</li><li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite.">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li><li>Tokuda, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber-associated+spirochetes+are+major+agents+of+hemicellulose+degradation+in+the+hindgut+of+wood-feeding+higher+termites.">Fiber-associated spirochetes are major agents of hemicellulose degradation in the hindgut of wood-feeding higher termites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (51), 11996-12004 (2018).</li><li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+microbiome+confer+multigenerational+host+resistance+after+sub-toxic+pesticide+exposure.">Changes in microbiome confer multigenerational host resistance after sub-toxic pesticide exposure.</a> Cell Host &amp; Microbe. 27 (2), 213-224 (2020).</li><li>Shin, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+microbiome+modulates+host+developmental+and+metabolic+homeostasis+via+insulin+signaling.">Drosophila microbiome modulates host developmental and metabolic homeostasis via insulin signaling.</a> Science. 334 (6056), 670-674 (2011).</li><li>Storelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lactobacillus+plantarum+promotes+Drosophila+systemic+growth+by+modulating+hormonal+signals+through+TOR-dependent+nutrient+sensing.">Lactobacillus plantarum promotes Drosophila systemic growth by modulating hormonal signals through TOR-dependent nutrient sensing.</a> Cell Metabolism. 14 (3), 403-414 (2011).</li><li>Salem, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+supplementation+by+gut+symbionts+ensures+metabolic+homeostasis+in+an+insect+host.">Vitamin supplementation by gut symbionts ensures metabolic homeostasis in an insect host.</a> Proceedings. Biological Sciences. 281 (1796), 20141838 (2014).</li><li>Koch, H., Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Socially+transmitted+gut+microbiota+protect+bumble+bees+against+an+intestinal+parasite.">Socially transmitted gut microbiota protect bumble bees against an intestinal parasite.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19288-19292 (2011).</li><li>Cirimotich, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+microbe-mediated+refractoriness+to+Plasmodium+infection+in+Anopheles+gambiae.">Natural microbe-mediated refractoriness to Plasmodium infection in Anopheles gambiae.</a> Science. 332 (6031), 855-858 (2011).</li><li>Kaltenpoth, M., Gottler, W., Herzner, G., Strohm, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symbiotic+bacteria+protect+wasp+larvae+from+fungal+infestation.">Symbiotic bacteria protect wasp larvae from fungal infestation.</a> Current Biology. 15 (5), 475-479 (2005).</li><li>Yuan, C., Xing, L., Wang, M., Hu, Z., Zou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+modulates+gut+immunity+and+promotes+baculovirus+infection+in+Helicoverpa+armigera.">Microbiota modulates gut immunity and promotes baculovirus infection in Helicoverpa armigera.</a> Insect Science. , (2021).</li><li>Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pheromones+-+Exploitation+of+gut+bacteria+in+the+locust.">Pheromones - Exploitation of gut bacteria in the locust.</a> Nature. 403 (6772), 851 (2000).</li><li>Xu, L. T., Lou, Q. Z., Cheng, C. H., Lu, M., Sun, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-associated+bacteria+of+Dendroctonus+valens+and+their+involvement+in+verbenone+production.">Gut-associated bacteria of Dendroctonus valens and their involvement in verbenone production.</a> Microbial Ecology. 70 (4), 1012-1023 (2015).</li><li>Schretter, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gut+microbial+factor+modulates+locomotor+behaviour+in+Drosophila.">A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila.</a> Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).</li><li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiome+modulates+Drosophila+aggression+through+octopamine+signaling.">Gut microbiome modulates Drosophila aggression through octopamine signaling.</a> Nature Communications. 12 (1), 2698 (2021).</li><li>Ma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+and+immunological+effects+of+gut+microbiota+in+leaf+beetles+at+the+local+and+systemic+levels.">Metabolic and immunological effects of gut microbiota in leaf beetles at the local and systemic levels.</a> Integrative Zoology. 16 (3), 313-323 (2021).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+action+of+the+gut+microbiota+in+environmental+RNA+interference+in+a+leaf+beetle.">Synergistic action of the gut microbiota in environmental RNA interference in a leaf beetle.</a> Microbiome. 9 (1), 98 (2021).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+in+an+invasive+bark+beetle+infected+by+a+pathogenic+fungus+accelerates+beetle+mortality.">Gut microbiota in an invasive bark beetle infected by a pathogenic fungus accelerates beetle mortality.</a> Journal of Pest Science. 92, 343-351 (2019).</li><li>Berasategui, A., Shukla, S., Salem, H., Kaltenpoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+applications+of+insect+symbionts+in+biotechnology.">Potential applications of insect symbionts in biotechnology.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (4), 1567-1577 (2016).</li><li>Tikhe, C. V., Martin, T. M., Howells, A., Delatte, J., Husseneder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+genetically+engineered+Trabulsiella+odontotermitis+as+a+'Trojan+Horse'+for+paratransgenesis+in+termites.">Assessment of genetically engineered Trabulsiella odontotermitis as a 'Trojan Horse' for paratransgenesis in termites.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 202 (2016).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fighting+malaria+with+engineered+symbiotic+bacteria+from+vector+mosquitoes.">Fighting malaria with engineered symbiotic bacteria from vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (31), 12734-12739 (2012).</li><li>Leonard, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+symbionts+activate+honey+bee+immunity+and+limit+pathogens.">Engineered symbionts activate honey bee immunity and limit pathogens.</a> Science. 367 (6477), 573-576 (2020).</li><li>Kietz, C., Pollari, V., Meinander, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+germ-free+Drosophila+to+study+gut-microbe+interactions:+protocol+to+rear+Drosophila+under+axenic+conditions.">Generating germ-free Drosophila to study gut-microbe interactions: protocol to rear Drosophila under axenic conditions.</a> Current Protocols in Toxicology. 77 (1), 52 (2018).</li><li>Brummel, T., Ching, A., Seroude, L., Simon, A. F., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+lifespan+enhancement+by+exogenous+bacteria.">Drosophila lifespan enhancement by exogenous bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (35), 12974-12979 (2004).</li><li>Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+axenic+Aedes+aegypti+demonstrate+live+bacteria+are+not+required+for+mosquito+development.">Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development.</a> Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).</li><li>Romoli, O., Schonbeck, J. C., Hapfelmeier, S., Gendrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+germ-free+mosquitoes+via+transient+colonisation+allows+stage-specific+investigation+of+host-microbiota+interactions.">Production of germ-free mosquitoes via transient colonisation allows stage-specific investigation of host-microbiota interactions.</a> Nature Communications. 12 (1), 942 (2021).</li><li>Berasategui, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+of+the+pine+weevil+degrades+conifer+diterpenes+and+increases+insect+fitness.">Gut microbiota of the pine weevil degrades conifer diterpenes and increases insect fitness.</a> Molecular Ecology. 26 (15), 4099-4110 (2017).</li><li>Lin, X. L., Kang, Z. W., Pan, Q. J., Liu, T. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+five+antibiotics+on+larval+gut+bacterial+diversity+of+Plutella+xylostella+(Lepidoptera:+Plutellidae).">Evaluation of five antibiotics on larval gut bacterial diversity of Plutella xylostella (Lepidoptera: Plutellidae).</a> Insect Science. 22 (5), 619-628 (2015).</li><li>Muhammad, A., Habineza, P., Hou, Y., Shi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+red+palm+weevil+Rhynchophorus+Ferrugineus+(Olivier)+(Coleoptera:+Dryophthoridae)+germ-free+larvae+for+host-gut+microbes+interaction+studies.">Preparation of red palm weevil Rhynchophorus Ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) germ-free larvae for host-gut microbes interaction studies.</a> Bio-protocol. 9 (24), 3456 (2019).</li><li>Gelman, D. B., Bell, R. A., Liska, L. J., Hu, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+diets+for+rearing+the+Colorado+potato+beetle,+Leptinotarsa+decemlineata.">Artificial diets for rearing the Colorado potato beetle, Leptinotarsa decemlineata.</a> Journal of Insect Science. 1, 7 (2001).</li><li>Bengtson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+program+for+the+evaluation+of+artificial+diets.">A comprehensive program for the evaluation of artificial diets.</a> Journal of the World Aquaculture Society. 24 (2), 285-293 (2007).</li><li>Utsumi, S., Ando, Y., Ohgushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+feeding+preference+in+a+leaf+beetle:+the+importance+of+phenotypic+plasticity+of+a+host+plant.">Evolution of feeding preference in a leaf beetle: the importance of phenotypic plasticity of a host plant.</a> Ecology Letters. 12 (9), 920-929 (2009).</li><li>Ishihara, M., Ohgushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+inactivity+and+prolonged+developmental+time+induced+by+seasonal+decline+in+host+plant+quality+in+the+willow+leaf+beetle+Plagiodera+versicolora+(Coleoptera:+Chrysomelidae).">Reproductive inactivity and prolonged developmental time induced by seasonal decline in host plant quality in the willow leaf beetle Plagiodera versicolora (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Environmental Entomology. 35 (2), 524-530 (2006).</li><li>Bright, M., Bulgheresi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+complex+journey:+transmission+of+microbial+symbionts.">A complex journey: transmission of microbial symbionts.</a> Nature Reviews: Microbiology. 8 (3), 218-230 (2010).</li><li>Hassan, B., Siddiqui, J. A., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertically+transmitted+gut+bacteria+and+nutrition+influence+the+immunity+and+fitness+of+Bactrocera+dorsalis+larvae.">Vertically transmitted gut bacteria and nutrition influence the immunity and fitness of Bactrocera dorsalis larvae.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 596352 (2020).</li><li>Hosokawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obligate+bacterial+mutualists+evolving+from+environmental+bacteria+in+natural+insect+populations.">Obligate bacterial mutualists evolving from environmental bacteria in natural insect populations.</a> Nature Microbiology. 1, 15011 (2016).</li><li>Habineza, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+promoting+effect+of+gut+microbiota+on+growth+and+development+of+red+palm+weevil,+Rhynchophorus+ferrugineus+(Olivier)+(Coleoptera:+Dryophthoridae)+by+modulating+its+nutritional+metabolism.">The promoting effect of gut microbiota on growth and development of red palm weevil, Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Dryophthoridae) by modulating its nutritional metabolism.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1212 (2019).</li><li>Meilan, R., Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poplar+(Populus+spp.).">Poplar (Populus spp.).</a> Methods in Molecular Biology. 344, 143-151 (2006).</li><li>Wani, Z. A., Ashraf, N., Mohiuddin, T., Riyaz-Ul-Hassan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-endophyte+symbiosis,+an+ecological+perspective.">Plant-endophyte symbiosis, an ecological perspective.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (7), 2955-2965 (2015).</li><li>Grout, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meristem-tip+culture.">Meristem-tip culture.</a> Methods in Molecular Biology. 6, 81-91 (1990).</li></ol>

Beredning av bakteriefria larver och erhållande av gnotobiotiska larver genom att återinföra specifika bakteriestammar är kraftfulla metoder för att belysa mekanismerna bakom värd-mikrobinteraktioner. Nykläckta larver får tarmmikrobiota på två huvudsakliga sätt: vertikal överföring från modern till avkomman eller horisontellt förvärv från syskon och miljön34. Den förstnämnda kan uppfyllas genom föräldraöverföring till avkomman genom förorening av äggytan...

I likhet med däggdjur är insektens matsmältningsorgan ett hålrum för matsmältning och absorption. De flesta insekter har olika kommensala bakterier som trivs i sina tarmar och lever på näring som levereras av värdar1. Tarmsamhället har en djupgående inverkan på flera fysiologiska processer hos insekter, inklusive matsmältning och avgiftning 2,3,4, näring och utveckling 5,6,7, försvar mot patogener och parasiter 8,9,10,11, kemisk kommunikation12,13 och beteenden14 ,15. Intressant nog kan vissa tarmmikrobiota vara fakultativt patogena eller manipuleras av invaderande patogener för att förvärra infektion, vilket indikerar att tarmbakterier kan vara skadliga i vissa fall 16,17,18. Tarmbakterier kan också fungera som en mikrobiell resurs för biotekniska tillämpningar och skadedjursbekämpning. Till exempel användes lignocellulosasmältande bakterier från fytofagösa och xylophagösa insekter för att smälta växtceller för att utveckla biobränslen19. Spridningen av konstruerade tarmsymbionter som uttrycker bioaktiva molekyler är en ny och lovande taktik för att hantera jord- och skogsbruksskadegörare och myggor som överför infektionssjukdomar 19,20,21, som också kan användas för att förbättra hälsan hos nyttiga insekter22. Att illustrera hur en tarmbakterie beter sig in vivo anses därför vara en prioritet för att fullt ut utnyttja dess funktion och ytterligare utnyttja den för olika applikationer.
Djur kan hysa 1 till >1000 symbiotiska mikrobiella arter i tarmen1. Som ett resultat är det svårt att exakt verifiera hur enskilda bakteriella taxa eller deras sammansättning fungerar inuti ett djur, och om värden eller dess mikrobiella partners driver en specifik funktion. Därför är det nödvändigt att förbereda axeniska larver för att erhålla gnotobiotiska insekter genom mono- eller flerartskolonisering för att undersöka bakteriell funktion och interaktion med insekter23. För närvarande är administrering av antibiotikacocktails och sterilisering av ytan på insektsägg vanliga metoder för att avlägsna tarmbakterier 14,24,25,26. Antibiotikadieter kan dock inte eliminera tarmbakterier helt och har en negativ effekt på värdinsektfysiologin27,28. Följaktligen kan användningen av antibiotikabehandlade insekter dölja de verkliga förmågorna hos vissa tarmbakterier. Lyckligtvis kan ytsterilisering av ägg negera detta problem23,29, vilket inte har några eller försumbara effekter på experimentella insekter. Dessutom kan konstgjorda dieter inte helt likna naturlig insektsmat, och att utveckla en konstgjord diet är en kostsam och arbetskrävande process30,31.
Pilbladbaggen, Plagiodera versicolora (Laicharting) (Coleoptera: Chrysomelidae), är en utbredd bladätande skadedjur som främst livnär sig på salicaceous träd, såsom pil (Salix) och poppel (Populus L.) 32,33. Här användes pilbladbaggen som en representativ bladätande insekt för att utveckla ett protokoll för att förbereda och föda upp en bakteriefri insekt. Vi utnyttjade växtvävnadsodling för att få bakteriefria poppelblad för att föda upp P. versicolora axeniska larver från steriliserade ägg. Den axeniska statusen för P. versicolora-larver verifierades via kulturberoende och kulturoberoende analyser. Detta protokoll kan upprätthålla axeniska insekter som bättre efterliknar det vilda tillståndet än insektsuppfödning med en konstgjord diet. Ännu viktigare är att denna metod är bekväm till en mycket låg kostnad, vilket ökar möjligheten att erhålla axeniska insekter för framtida interaktionsstudier mellan insekter och tarmmikrobiota, särskilt för icke-modellinsekter utan välutvecklade konstgjorda dieter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mg/mL NAA stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a. Prepare 0.1 M NaOH solution (dissolve 0.8 g NaOH in 200 mL of distilled water). 
			b. Add 0.2 g NAA in a 250 mL beaker, add little 0.1 M NaOH solution until NAA dissolved, and adjust the final volume to 200 mL with distilled water. 
			c. Filter the solution to remove bacteria with a 0.22 &#181;m syringe filter and a 50 mL sterile syringe, subpackage the solution in 1.5 mL centrifuge tubes and restore at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>F600620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x PBS stock solution</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 M KOH solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissolve 22.44 g KOH (molecular weight: 56.1) in 200 mL of distilled water and autoclave it for 20 min at 121 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL and 2,000 mL beakers</td>
			<td>Shubo</td>
			<td>sb16455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile syringes</td>
			<td>Jinta</td>
			<td>JT0125789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL measuring cylinder</td>
			<td>Shubo</td>
			<td>sb1601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50x TAE stock solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a.&#160;Dissolve 242 g Tris and 18.612 g EDTA in 700 mL of distilled water. 
			b. Adjust pH to 7.8 with about 57.1 mL of acetic acid. 
			c. Adjust the final volume to 1,000 mL. 
			d. The stock solution was diluted to 1x TAE buffer when used.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% ethanol</td>
			<td>Xingheda trade</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-naphthalene acetic acid (NAA)</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>86-87-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absorbing paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>111860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MLS-3781L-PC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead-beating homogenizer</td>
			<td>Jing Xin</td>
			<td>XM-GTL64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA extraction kit</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116560200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Saiguo Biotech</td>
			<td>1340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Jiaojie</td>
			<td></td>
			<td>70 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis unit</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>164-5052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Signal Green nucleic acid dye</td>
			<td>TsingKe</td>
			<td>TSJ003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germ-free poplar seedlings</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Shan Xin poplar from Ludong University in Shandong Province</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Golden Star Super PCR Master Mix (1.1&#215;)</td>
			<td>TsingKe</td>
			<td>TSE101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth chamber</td>
			<td>Ruihua</td>
			<td>HP400GS-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a. Dissolve 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g yeast extract in 300 mL of distilled water. 
			b. Adjust the final volume to 500 mL, transfer the solution to a 1,000 mL conical flask, and add 7.5 g agar. 
			c. Autoclave the medium for 20 min at 121 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini centrifuge</td>
			<td>DRAGONLAB</td>
			<td>D1008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS basic medium</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>PM1121-50L</td>
			<td>M0245</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS solid medium for germ-free poplar seedling culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a. Dissolve 4.43 g MS basic medium powder and 30 g sucrose in 800 mL of distilled water. 
			b. Adjust the pH to about 5.8 with 2 M KOH by a pH meter. 
			c. Adjust the final volume to 1,000 mL, separate into two parts, transfer into two 1,000 mL conical flasks, and add 2.6 g agar per 500 mL. 
			d. Autoclave for 20 min at 121 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 cm width, used to collect the eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Thermal Cyclers</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>6331000076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Supin</td>
			<td></td>
			<td>90 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>METTLER TOLEDO</td>
			<td>FE20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes 0.2-2 &#181;L</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>ECS000699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes 100-1,000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes 20-200 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes 2-20 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3120000232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant tissue culture container</td>
			<td>Chembase</td>
			<td>ZP21</td>
			<td>240 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2.35 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for amplifying the bacterial 16S rRNA gene</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td></td>
			<td>27-F: 5&#8217;-ACGGATACCTTGTTACGAC-3&#8217;, 1492R: 5&#8217;-ACGGATACCTTGTTACGAC-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel balls</td>
			<td></td>
			<td>0.25 mm</td>
			<td>used to grind tissues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>SZ61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans2K plus II DNA marker</td>
			<td>Transgene Biotech</td>
			<td>BM121-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>1115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;LP0037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV transilluminator</td>
			<td>Monad Biotech</td>
			<td>QuickGel 6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortexer</td>
			<td>Scilogex</td>
			<td>MX-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Willow branches</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sha Lake Park, Wuhan, China</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Willow leaf beetle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Huazhong Agricultural University, Wuhan, China</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing and rearing axenic insects with tissue cultured seedlings for host-gut microbiota interaction studies of the leaf beetle

Insekts tarmar koloniseras av olika bakterier som kan påverka värdens fysiologiska egenskaper djupt. Att introducera en viss bakteriestam i en axenisk insekt är en kraftfull metod för att verifiera tarmens mikrobiella funktion och belysa mekanismerna bakom tarmmikrob-värdinteraktioner. Administrering av antibiotika eller sterilisering av äggytor är två vanliga metoder för att ta bort tarmbakterier från insekter. Men förutom de potentiella negativa effekterna av antibiotika på insekter, indikerade tidigare studier att utfodring av antibiotika inte kunde eliminera tarmbakterier. Således används bakteriefria konstgjorda dieter i allmänhet för att upprätthålla axeniska insekter, vilket är en tråkig och arbetsintensiv process som inte helt kan likna näringskomponenter i naturlig mat. Här beskrivs ett effektivt och enkelt protokoll för att förbereda och underhålla axeniska larver av en bladbagge (Plagiodera versicolora). Specifikt steriliserades ytorna på skalbaggsäggen, varefter bakteriefria poppelblad användes för att odla axeniska larver. Insekternas axeniska status bekräftades ytterligare via kulturberoende och kulturoberoende analyser. Sammantaget, genom att kombinera äggdesinfektion och bakteriefri odling, utvecklades en effektiv och bekväm metod för att erhålla axenisk P. versicolora, vilket ger ett lätt överförbart verktyg för andra bladätande insekter.

Livsstadierna för P. versicolora visas i figur 1. Den vuxna hanen är mindre än den vuxna honan (figur 1A). I fält kluster skalbaggen sina ägg på ett blad; här lösgjordes fyra ägg från ett blad (figur 1B). Poppelstamsegmenten och plantorna som används för axenisk insektsuppfödning visas i figur 2. Tarmen hos en 3rd instar larva visas i figur 3</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle at JoVE.com

Preparing and Rearing Axenic Insects with Tissue Cultured Seedlings for Host-Gut Microbiota Interaction Studies of the Leaf Beetle

För att erhålla en axenisk insekt steriliseras dess äggyta och den kläckta larven uppföds därefter med axeniska löv. Denna metod ger ett effektivt sätt för axenisk insektsberedning utan att administrera antibiotika eller utveckla en konstgjord diet, som också kan appliceras på andra bladätande insekter.

Förbereda och föda upp axeniska insekter med vävnadsodlade plantor för värd-tarmmikrobiotainteraktionsstudier av bladbaggen

Insect guts are colonized by diverse bacteria that can profoundly impact the host&#39;s physiological traits. Introducing a particular bacterial strain ...

Tarmbakterierna kan påverka flera fysiologiska processer hos insektsvärdar. Att förbereda och underhålla axenlarver är ett kraftfullt verktyg för att studera tarmbakteriers funktioner. De främsta fördelarna med detta protokoll är att växtvävnadsodling används för att erhålla bakteriefria löv till bakre axeniska bladätande insekter härledda från ytsteriliserade ägg, och att denna metod inte begränsas av konstgjorda dieter.Denna metod är bekväm och ökar synligheten för att upprätthålla axeniska insekter för framtida tarmbakteriestudier, särskilt för icke-modellinsekter utan välutvecklade konstgjorda dieter. Håll P.versicolora-populationen i en tillväxtkammare vid 27 grader Celsius och 70% relativ luftfuktighet, med en 16 timmars ljus och åtta timmars mörk fotoperiod. Placera insekterna i perforerade plastlådor med lutat vått absorberande papper och mata dem med färska poppelgrenar.Spraya rent vatten på absorberande papper för att bibehålla fukt och byt grenarna varannan dag. Isolera vuxna för oviposition efter valpning och mata dem ömma löv för att få fler ägg. Inom 24 timmar, samla nylagda ägg och placera dem på fuktabsorberande papper i 60 timmar för att förbereda axeniska larver.Förbered MS-medium i ett milligram per milliliter alfa-naftalenättiksyra eller NAA-stamlösningar. I en biosäkerhetshuv, tillsätt 50 mikroliter av NAA-stamlösningen till 500 ml MS-medium och skaka för att blanda väl. Häll sedan cirka 50 ml per vävnadsodlingsbehållare och vänta på stelning.Sterilisera skalpeller och pincett i en alkohollampa flamma i biosäkerhetshuven. Skär tre till fyra centimeter stamsegment med apikala knoppar eller sidoknoppar från poppelplantor vid ungefär en månads tillväxt och sätt in dem i odlingsmediet, ett eller två stamsegment per behållare. Inkubera dessa stamsegment i en tillväxtkammare i cirka 30 dagar.Och använd dessa bakteriefria löv för att mata de axeniska larverna. Autoklavera petriskålar, penslar, filterpapper, destillerat vatten i en petriskål som innehåller LB-agarmedium. Lägg löv med vidhäftande ägg i en petriskål.Ta sedan försiktigt bort äggen från bladen med pincett och överför dem till en annan petriskål. Tvätta dessa ägg med 75% etanol i åtta minuter. Upprepa sedan tvätten fyra gånger med sterilt vatten.Överför äggen till LB-agarmedium för att bevara fukt för kläckning. Placera petriskålen i en tillväxtkammare och vänta tills äggen kläcks inom 24 timmar. I en biosäkerhetshuv, kakel tre bitar vått filterpapper i en petriskål och lägg bakteriefria poppelblad på papperet.Samla larverna och placera dem på bladen. Försegla petriskålen med parafilm och inkubera den i en tillväxtkammare. Byt löv varannan dag.För de konventionellt uppfödda grupperna, överför äggen från bladen till en petriskål som innehåller fuktigt filterpapper och mata dessa larver med bakteriefria poppelblad. Välj slumpmässigt ut tre första, andra och tredje instarlarver från de bakteriefria och konventionellt uppfödda grupperna. Dissekera den tredje instarlarven med steril sax och pincett under ett stereomikroskop och samla in deras tarmar i mikrocentrifugrör.Samla intakta första och andra instar larver i rör. Tillsätt 100 mikroliter PBS och tre stålkulor till 1,5 ml-rören och slipa vävnaderna i homogenater med hjälp av en pärlslagande homogenisator. Tillsätt 100 mikroliter av homogenatet till LB-agarmedium och platta med en steril glasspridningsstång.Inkubera plattorna vid 37 grader Celsius i 24 timmar. Observera sedan bakteriekolonierna. Extrahera det totala DNA från de tidigare erhållna vävnaderna med hjälp av ett DNA-extraktionssats och mät DNA-koncentrationen med en spektrofotometer.Förstärk den bakteriella 16S rRNA-genen med hjälp av universella 16S rRNA-primers med PCR, vilket ställer in reaktionen enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Förvara PCR-produkterna vid fyra grader Celsius tills vidare analys. Blanda PCR-produkterna med nukleinsyrafärgämne och analysera dem med elektrofores på en 1% agarosgel i 1X TAE-buffert.Använd 10 mikroliter av en DNA-markör som referens. Observera gelén med en UV-transilluminator och leta efter målfragmentet runt 1 500 baspar. Även om inga bakteriekolonier observerades i någon bakteriefri grupp, observerades de i alla konventionellt uppfödda grupper, vilket indikerar att larver från steriliserade ägg som matades med vävnadsodlade poppelblad inte innehöll några bakterier.De 1 500 baspar pcr-banden uppträdde i alla konventionellt uppfödda grupper. Däremot observerades inget band i de bakteriefria grupperna eller den negativa kontrollen, vilket innebär att inga tarmbakterier fanns i axeniska larver. För insektsarter med små ägg behövde de olika typerna av desinfektionsmedel och steriliseringstid optimeras.Dessutom bör endofyter i vävnadsodlade växter vara anmärkningsvärda. Detta protokoll ger en ny metod för att upprätthålla bakteriefria insekter, vilket är ett praktiskt verktyg för att underlätta interaktionsstudier mellan insekter och tarmbakterier, särskilt för icke-modellinsekter utan välutvecklade konstgjorda dieter.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo and in vitro Studies of Adaptor-clathrin Interaction

In vivo och in vitro studier av Adapter-clathrin Interaktion

A major endocytic pathway initiates with the formation of clathrin-coated vesicles (CCVs) that transport cargo from the cell surface to endosomes1-6. CCVs ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

En guide till Modern Kvantitativ Fluorescerande Western blotting med Felsökning Strategier

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Metoder för extraktion av endosymbioner från vitflyget<em&gt; Bemisia tabaci</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Tillämpning av passiv huvudrörelse för att generera definierade accelerationer vid gnagarnas huvuden

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Methods for Rearing the Parasitoid Ganaspis brasiliensis, a Promising Biological Control Agent for the Invasive Drosophila suzukii

Methods for Rearing the Parasitoid Ganaspis brasiliensis, a Promising Biological Control Agent for the Invasive Drosophila suzukii

Metoder för uppfödning av parasitoiden Ganaspis brasiliensis, ett lovande biologiskt bekämpningsmedel för invasiv Drosophila suzukii

Native to East Asia, the spotted-wing drosophila, Drosophila suzukii (Matsumura) (Diptera: Drosophilidae), has established widely in the Americas, Europe, ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, karakterisering och terapeutisk tillämpning av extracellulära vesiklar från odlade humana mesenkymala stamceller

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

Enhancing Survival and Development of Marmosets with Hand-Rearing Approach

Hand-Rearing Method for Infant Marmosets

Marmoset Research - Scope and Challenges (Video) | JoVE

Handuppfödningsmetod för silkesapor

The common marmoset (Callithrix jacchus) is a small and highly social New World monkey with high reproduction rates, which has been proven to be a ...

Rearing Germ-Free Nasonia Wasps

Optimizing the Rearing Procedure of Germ-Free Wasps

Optimizing the Rearing Procedure of Germ-Free Wasps (Video) | JoVE 

Optimering av uppfödningsförfarandet för bakteriefria getingar

Aseptic rearing technology is a method of culturing insects under sterile or almost sterile conditions, which can effectively eliminate the influence of ...

Germ-Free Wasp Embryo Collection and Rearing with Nasonia-Rearing Medium (NRM)

Germ-Free Wasp Embryo Collection and Rearing with Nasonia-Rearing Medium (NRM) (Video) | JoVE 

Bakteriefri insamling och uppfödning av getingembryon med Nasonia-Rearing Medium (NRM)

Improved Methods for Imaging Maize Leaf Primordia

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging

Improved Methods for Preparing Transverse Sections and Unrolled Whole Mounts of Maize Leaf Primordia for Fluorescence and Confocal Imaging (Video) | JoVE 

Förbättrade metoder för beredning av tvärsnitt och rullade hela fästen av majsbladsprimordia för fluorescens och konfokal avbildning

In maize (Zea mays) and other grasses (Poaceae), the leaf primordia are deeply ensheathed and rolled within the leaf whorl, making it difficult to study ...