Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

تم دعم هذا البحث جزئيا من قبل برنامج البحوث الداخلية التابع للمركز الوطني للنهوض بالعلوم الانتقالية ، المعاهد الوطنية للصحة. قدم مختبر البحوث البحرية التمويل من خلال معهد علوم النانو الداخلي التابع له. تم دعم إعداد الكاشف من خلال الصندوق الأساسي NRL COVID-19.

خط الخلية HEK293T المستخدم في هذه الدراسة هو خط خلية خالد. لم يتم استخدام أي أشخاص بشريين أو حيوانيين في هذه الدراسة.
1. زراعة الخلايا والبذر
<ol><li>داخل خزانة السلامة البيولوجية المعقمة ، وارتداء معدات الحماية الشخصية (بما في ذلك قفازات المختبر ، ومعطف المختبر ، ونظارات...

<ol>
	<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Lysosomes+in+Live+Cells+with+LysoTracker.">Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments.">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li><li>Barroso, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots+in+cell+biology.">Quantum dots in cell biology.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).</li><li>Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACE2:+Evidence+of+role+as+entry+receptor+for+SARS-CoV-2+and+implications+in+comorbidities.">ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities.</a> eLife. 9, 61390 (2020).</li><li>Shang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+mechanisms+of+SARS-CoV-2.">Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).</li><li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Coronaviruses+use+lysosomes+for+egress+instead+of+the+biosynthetic+secretory+pathway.">&#946;-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway.</a> Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).</li><li>Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+guidelines+for+image-based+high+content+screening,+high+content+analysis+and+high+content+imaging.">Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+profiling+for+drug+discovery:+due+for+a+machine-learning+upgrade.">Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).</li><li>Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+properties+of+SARS-CoV-2+spike+protein:+potential+antivirus+drug+development+for+COVID-19.">Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+spike+protein+interacts+with+multiple+innate+immune+receptors.">SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors.</a> bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+assists+SARS-CoV-2+in+cell+entry+and+can+be+targeted+by+approved+drugs+in+vitro.">Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro.</a> Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+Is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+conformational+states+of+SARS-CoV-2+spike+protein.">Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein.</a> Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).</li><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+cellular+toxicity+for+cadmium-containing+quantum+dots.">Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots.</a> Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).</li><li>Gorshkov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-conjugated+SARS-CoV-2+spike+pseudo-virions+enable+tracking+of+angiotensin+Converting+enzyme+2+binding+and+endocytosis.">Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis.</a> ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).</li><li>Narayanan, S. S., Pal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+CdS+quantum+dots:+Host+of+biomolecular+ligands.">Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+together+with+virus+receptor+ACE2.">Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2.</a> Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).</li><li>Hildebrandt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer+with+semiconductor+quantum+dot+bioconjugates:+A+versatile+platform+for+biosensing,+energy+harvesting,+and+other+developing+applications.">Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications.</a> Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).</li></ol>

توفر الطريقة الموضحة في هذه المقالة الخطوات اللازمة لتصوير QDs الوظيفية في الخلايا البشرية باستخدام المجهر البؤري عالي الإنتاجية. هذه الطريقة هي الأنسب للخلايا حيث يكون كثرة الخلايا الداخلية هو الطريق الرئيسي للدخول الفيروسي بدلا من نشاط TMPRSS2 والانصهار الغشائي ، لأنها تمكن من دراسة SARS-CoV-2...

يمكن الفحص المجهري الفلوري الباحثين من النظر في الأعمال الداخلية للخلية باستخدام أصباغ متخصصة1 وبروتينات فلورسنت مشفرة وراثيا2 وجسيمات نانوية فلورية في شكل نقاط كمومية (QDs)3. بالنسبة للوباء العالمي لفيروس كورونا المسبب للمتلازمة التنفسية الحادة الوخيمة لعام 2019 (SARS-CoV-2) ، استخدم الباحثون المجهر الفلوري لفهم كيفية تفاعل الفيروس مع الخلية في كل من غشاء البلازما والسيتوبلازم. على سبيل المثال ، تمكن الباحثون من اكتساب رؤى ثاقبة حول ارتباط بروتين SARS-CoV-2 Spike على سطح الفيريون بالإنزيم البشري المحول للأنجيوتنسين 2 (hACE2) على سطح الخلايا البشرية ، والاستيعاب اللاحق عن طريق الاندماج في غشاء البلازما ، وكثرة الخلايا الداخلية لمركب بروتين Spike:hACE24,5. كما تم اكتساب رؤى كبيرة حول خروج SARS-CoV-2 من الخلايا عبر الليزوسوم باستخدام التصوير الفلوري الخلوي، وهي ميزة فريدة من الفيروسات التاجية التي كان يعتقد سابقا أنها تحدث عبر الحويصلة التقليدية الناشئة من غولجي، كما هو الحال مع العديد من الفيروسات الأخرى6. تعد تقنية الفحص المجهري الفلوري الخلوي الدعامة الأساسية لجميع جوانب البحوث البيولوجية تقريبا ، وقد تقدمت بالضرورة في اتساعها ونطاق تطبيقاتها من التصوير فائق الدقة للحيوانات الكاملة إلى التصوير الآلي متعدد المعلمات عالي المحتوى لفحص الأدوية. هنا ، يتم تطبيق المجهر البؤري الآلي عالي المحتوى على دراسة دخول خلايا SARS-CoV-2 باستخدام QDs الفلورية المترافقة مع بروتين سبايك الفيروسي.
يسمح التحليل عالي المحتوى للصور التي تم إنشاؤها بواسطة منصات التصوير البيولوجي باستخراج أكبر للرؤى البيولوجية القيمة من المعلمات الفردية مثل كثافة البئر الكاملة ، والتي يمكن للمرء الحصول عليها باستخدام قارئ لوحة متعدد الوسائط 7. من خلال فصل الكائنات في مجال رؤية باستخدام خوارزميات التجزئة الآلية، يمكن تحليل كل كائن أو مجموعة من الكائنات بحثا عن معلمات مثل الكثافة والمساحة والملمس في كل قناة فلورية متاحة8. يعد الجمع بين العديد من القياسات في مجموعات بيانات متعددة المتغيرات نهجا مفيدا للتنميط المظهري. عندما يكون النمط الظاهري المطلوب معروفا ، مثل استيعاب QD في شكل puncta ، يمكن للمرء استخدام القياسات المتعلقة بالثقب مثل الحجم والعدد والشدة لتقييم فعالية العلاج.
يمكن لبرنامج تحليل التصوير عالي المحتوى المستند إلى السحابة استيعاب مجموعة كبيرة ومتنوعة من مخرجات بيانات الأجهزة ، بما في ذلك منصة التصوير عالية المحتوى. باستخدام خادم قائم على السحابة لتخزين الصور والتحليل عبر الإنترنت ، يمكن للمستخدم تحميل بياناته إما من أداة التصوير أو من محرك أقراص الشبكة حيث يتم تخزين البيانات. يتم إجراء جزء التحليل من البروتوكول داخل بيئة البرامج السحابية ، ويمكن تصدير البيانات في مجموعة متنوعة من تنسيقات الملفات لتصور البيانات النهائية.
يتكون فيروس SARS-CoV-2 من بروتينات غير هيكلية وهيكلية تساعد في تجميعه وتكراره. يحتوي ارتفاع SARS-CoV-2 على مجالين يطلق عليهما S1 و S2 ، حيث يحتوي S1 على مجال ربط المستقبلات المسؤول عن تفاعلات hACE2 في غشاء البلازما 9. كما وجد أن سبايك يتفاعل مع جزيئات أخرى في غشاء البلازما التي قد تعمل كمستقبلات مشتركة بالإضافة إلى hACE210,11. في جميع أنحاء تسلسل بروتين سبايك وخاصة في واجهة S1 / S2 ، هناك مواقع انقسام البروتياز التي تمكن من الاندماج في الغشاء بعد بروتياز سيرين عبر الغشاء 2 (TMPRSS2)12. تم إنتاج العديد من بروتينات SARS-CoV-2 Spike المؤتلفة من مجالات ربط المستقبلات الفردية ، إلى S1 و S2 و S1 مع S2 ، وآلات تشذيب السنبلة الكاملة من بائعين تجاريين متعددين لاستخدامها في الأنشطة البحثية13.
في هذا العمل ، تم تشغيل سطح QDs باستخدام أدوات تشذيب السنبلة المؤتلفة التي تحتوي على علامة الهيستيدين (QD-Spike). تحتوي QDs التي ينتجها قسم المواد النانوية البصرية في مختبر البحوث البحرية على نواة سيلينيد الكادميوم وقذيفة كبريتيد الزنك 14,15. يقوم الزنك الموجود على سطح QD بتنسيق بقايا الهيستيدين داخل البروتين المؤتلف لتشكيل QD وظيفي يشبه جسيم فيروس SARS-CoV-2 في الشكل والوظيفة. وقد سبق وصف توليد الجسيمات النانوية واقتران البروتين باستخدام مجال ربط المستقبلات المترافقة مع QD15. تصف هذه الطريقة مستحضرات زراعة الخلايا ، وعلاج QD ، والحصول على الصور ، وبروتوكول تحليل البيانات الذي يمكن أن يوجه الباحث في دراسة نشاط SARS-CoV-2 Spike في السياق الفسيولوجي للخلية البشرية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

وقد سهل تطوير تكنولوجيات جديدة للفحص المجهري الفلوري الخلوي طرق الفحص عالية الإنتاجية لاكتشاف الأدوية. النقاط الكمومية هي جسيمات نانوية فلورية ذات خصائص فيزيائية ضوئية ممتازة مشبعة بالتلألؤ الضوئي الساطع والمستقر بالإضافة إلى نطاقات الانبعاثات الضيقة. النقاط الكمومية كروية الشكل ، ومع التعديل المناسب لكيمياء السطح ، يمكن استخدامها لاقتران الجزيئات الحيوية للتطبيقات الخلوية. هذه الخصائص البصرية ، جنبا إلى جنب مع القدرة على تشغيلها مع الجزيئات الحيوية ، تجعلها أداة ممتازة للتحقيق في التفاعلات بين المستقبلات والروابط والاتجار الخلوي. هنا ، نقدم طريقة تستخدم النقاط الكمومية لتتبع الارتباط و endocytosis من بروتين سبايك SARS-CoV-2. يمكن استخدام هذا البروتوكول كدليل للتجريبيين الذين يتطلعون إلى استخدام النقاط الكمومية لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين والاتجار في سياق علم وظائف الأعضاء الخلوية.

عند العلاج ، سيتم استيعاب QDs لأن الجسيمات النانوية سترتبط ب ACE2 على غشاء البلازما وتحفز endocytosis. باستخدام خط خلية ACE2-GFP يعبر عن خط الخلية ، يمكن تصور نقل كل من QDs و ACE2 باستخدام المجهر الفلوري. بمجرد استيعابها ، تظهر إشارتا QD و ACE2 توطينا مشتركا قويا. من هذه الصور ، يمكن إجراء تجزئة الصور والتحليل ?...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

في هذا البروتوكول ، تمكن النقاط الكمومية المترافقة مع ارتفاع SARS-CoV-2 المؤتلف من الفحوصات القائمة على الخلايا من مراقبة ارتباط السنبلة إلى hACE2 في غشاء البلازما وكثرة الخلايا الداخلية اللاحقة للبروتينات المرتبطة في السيتوبلازم.

تصوير بؤري عالي الإنتاجية لمشمشات سبايك SARS-CoV-2 ذات النقاط الكمومية لتتبع الارتباط وكثرة الخلايا الداخلية في خلايا HEK293T

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

لقد أنشأنا تقنية منصة ل SARS COVID 2 يمكن تطبيقها على الفيروسات الأخرى مع التعرف على الخلايا بوساطة Spike ودخولها كخطوة أولى في العدوى الفيروسية الخلوية. النقاط الكمومية مشرقة ومستقرة ويمكن تشغيل سطحها لمجموعة متنوعة من التطبيقات الخلوية. باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا تصور وقياس استيعاب Spike في الخلايا.لإعداد 0.1٪ BSA. أضف 130 ميكرولتر من 7.5٪ BSA إلى 10 ملليلتر من وسائط التصوير في مزيج. للحصول على تخفيف تسلسلي من 6.1 إلى ثلاثة وثلاثة أضعاف ، أضف 14.26 ميكرولتر من QD Spike إلى 285.74 ميكرولتر من 0.1٪ BSA لجعل أعلى تركيز من 20 نانومول.ثم أضف 100 ميكرولتر من 20 نانومول أو QD Spike إلى 200 ميكرولتر من 0.1٪ BSA لجعل الوهم الثاني من 6.67 نانومول QD Spike. قم بإزالة جميع الوسائط المستهلكة من كل بئر باستخدام شفاط متعدد القنوات ، واغسلها مرة واحدة باستخدام ماصة متعددة القنوات مع 100 ميكرولتر من وسائط التصوير لكل بئر ، ثم استطلع 100 ميكرولتر من وسائط التصوير. أضف 50 ميكرولتر من محلول QD Spike لكل بئر واحتضن الطبق لمدة ثلاث ساعات في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.ارتداء معدات الحماية ، وإعداد 4 ٪ PFA و 0.1 ٪ PSA وسائط التصوير داخل خزانة السلامة الحيوية المعقمة ، وشفط 50 ميكرولتر من QD Spike من كل بئر وإضافة 100 ميكرولتر من 4 ٪ PFA لكل بئر مع ماصة آلية متعددة القنوات لتجنب تجفيف الآبار. احتضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم اغسل ثلاث مرات باستخدام PBS ، وقم بإعداد الصبغة النووية الحمراء العميقة عن طريق تخفيف محلول مخزون الخمسة ملليمترات عند واحد إلى 1000 في PBS ، وشفط PBS وإضافة 50 ميكرولتر من الصبغة النووية المخففة لكل بئر. احتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم اغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS ، أو صور اللوحة أو أغلقها باستخدام مانع تسرب اللوحة للتصوير لاحقا.قم بتخزين اللوحة عند أربع درجات مئوية. بدء تشغيل البرنامج الخاص بمنصة التصوير. بعد تسجيل الدخول إلى منصة التصوير ، قم بإنشاء بروتوكول اكتساب جديد عن طريق تحديد نوع اللوحة كلوحة تصوير سفلية شفافة من 96 جدارا ، وحدد الوضع البصري وأصبح محوريا وتكبيره مثل غمر الماء 40 مرة ، وحدد binning كواحد.حدد وضع تباينات الوجه الرقمي مثل التباين العالي لإنتاج أجسام خلايا محددة جيدا. التقط لقطة للتأكد من أن هذا العنوان مناسب كما هو موضح في نافذة الصورة، وحدد قناة C المناسبة للاستخدام مع خط خلية ACE2-GFP لتصور تهريب ACE2 داخل الخلية. لإنشاء قناة QD مخصصة ، حدد القائمة المنسدلة للمثلث واختر الإثارة في نطاق 405 نانومتر في الانبعاثات في نطاق 608 نانومتر ، وحدد بئرا بإشارة QD سيتوبلازمية قوية لضبط وقت التعرض وقوة الليزر وموضع ارتفاع Z.تحقق مما إذا كان الارتفاع الافتراضي ينتج صورة للخلايا في المستوى البؤري المطلوب. سيكون موضع Z أقل بالنسبة للبونكتا الداخلية من موضع Z لغشاء البلازما. اختر وقت التعرض ، عادة ما بين 100 و 300 مللي ثانية ينتج صورة ساطعة بمستويات رمادية ، أكبر بثلاثة أضعاف على الأقل من إشارة الخلفية.عند 20 نانومول ، يجب أن تكون المستويات الرمادية حوالي 6000 وحدة ذرية مع وقت تعرض 200 مللي ثانية وقوة ليزر 80٪. تحقق من المستويات الرمادية من خلال النقر بزر الماوس الأيمن على الصورة المنتجة باستخدام ميزة اللقطة في كل قناة وتحديد كثافة العرض ، ثم انقر بزر الماوس الأيسر على الكائن محل الاهتمام أو الخلفية لعرض المستوى الرمادي لهذا البكسل ، واضبط طاقة الليزر لضبط شدة الكائنات ذات الاهتمام. احفظ بروتوكول الاكتساب ، وقم بالتبديل لتشغيل التجربة وأدخل اسم اللوحة ، وقم بتشغيل التجربة.تم تصور نقل كل من QDs و ACE2 باستخدام المجهر الفلوري وخط الخلية ACE2-GFP. تم إجراء تجزئة الصور والتحليل اللاحق لاستخراج المعلمات ذات الصلة مثل عدد النقاط. أولا ، تم تقسيم النوى من قناة العلامة النووية لإنشاء مجموعة عائد على الاستثمار.ثم منطقة عائد استثمار تحدد الخلية مع تقسيم باستخدام قناة ACE2-GFP. وأخيرا، تم تقسيم بقع QD 608 Spike من منطقة عائد الاستثمار الخلوي، وأظهرت إشارات QD و ACE2 الداخلية توطينا مشتركا قويا. تم إجراء تجربة استجابة التركيز مع ستة تركيزات مختلفة من QD Spike في خلايا HEK 293T.لتحديد التركيزات البصرية ل QD ، يمكن استخدام QDS منخفضة تصل إلى 2.22 نانومول ، ومع ذلك ، فمن المستحسن استخدام تركيزات 10 نانومول أو أعلى لضمان استجابة قوية. أثناء الاقتران إلى تجميع بروتين QD قد يحدث. تم رصد المجاميع في محلول QD كراسبات متكتلة ساطعة وخلايا HEK 293T ، تم احتضان QDs بأجسام مضادة محايدة تبدأ من 30 ميكروغرام لكل ميكرولتر قبل إضافتها إلى الخلايا ، هذه الأجسام المضادة منعت الاستيعاب الداخلي وتسببت في انخفاض في عدد البقع مقارنة بالخلايا المعالجة ب QD فقط.يمكن أيضا استخدام هذا المقال للفحص عالي الإنتاجية ، والتقييم الرئيسي للأجسام المضادة المحايدة لتحديد مضادات الفيروسات التورية إلى دخول الفيروس الكتلي وتكييفها لدراسة المتغيرات الناشئة حديثا.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

تطبيقات pHluorin لالكمي، الحركية وعالية الإنتاجية تحليل الإلتقام في مهدها الخميرة

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

استغلال التصوير الحي إلى نويات المسار خلال ميوبلاست التمايز والانصهار

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

تصوير حي عالي الإنتاجية للمستعمرات الدقيقة لقياس التغايرية في النمو والتعبير الجيني

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

بروتوكولات تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمية لقطرات النسخ العكسي المكونة من خطوتين للكشف عن SARS-CoV-2 وقياسه

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

مسح البيئة الحضرية - خط أنابيب لأخذ عينات من السارس -CoV-2 والكشف عنه من الخزانات البيئية

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

منصة عالية الإنتاجية للثقافة والتصوير 3D من المواد العضوية

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

توصيف ناقلات الزنك في الثدييات باستخدام مقايسة نقل الزنك في المختبر

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...