Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

Denne forskning blev delvist støttet af intramural forskningsprogrammet fra National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Naval Research Laboratory ydede finansiering via sit interne Nanoscience Institute. Reagensforberedelse blev støttet via NRL's covid-19-basisfond.

HEK293T-cellelinjen, der anvendes i denne undersøgelse, er en udødeliggjort cellelinje. Ingen mennesker eller dyr blev anvendt i denne undersøgelse.
1. Celledyrkning og såning
<ol><li>Inde i et sterilt biosikkerhedsskab, iført personlige værnemidler (herunder laboratoriehandsker, laboratoriefrakke og sikkerhedsbriller), skal du forberede cellekulturmedium ved at supplere Dulbeccos modified Eagle Medium (DMEM) med 10% føtalt kvægserum (FBS), 1% penicillin / streptomyc...

<ol>
	<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Lysosomes+in+Live+Cells+with+LysoTracker.">Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments.">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li><li>Barroso, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots+in+cell+biology.">Quantum dots in cell biology.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).</li><li>Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACE2:+Evidence+of+role+as+entry+receptor+for+SARS-CoV-2+and+implications+in+comorbidities.">ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities.</a> eLife. 9, 61390 (2020).</li><li>Shang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+mechanisms+of+SARS-CoV-2.">Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).</li><li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Coronaviruses+use+lysosomes+for+egress+instead+of+the+biosynthetic+secretory+pathway.">&#946;-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway.</a> Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).</li><li>Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+guidelines+for+image-based+high+content+screening,+high+content+analysis+and+high+content+imaging.">Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+profiling+for+drug+discovery:+due+for+a+machine-learning+upgrade.">Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).</li><li>Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+properties+of+SARS-CoV-2+spike+protein:+potential+antivirus+drug+development+for+COVID-19.">Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+spike+protein+interacts+with+multiple+innate+immune+receptors.">SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors.</a> bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+assists+SARS-CoV-2+in+cell+entry+and+can+be+targeted+by+approved+drugs+in+vitro.">Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro.</a> Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+Is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+conformational+states+of+SARS-CoV-2+spike+protein.">Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein.</a> Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).</li><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+cellular+toxicity+for+cadmium-containing+quantum+dots.">Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots.</a> Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).</li><li>Gorshkov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-conjugated+SARS-CoV-2+spike+pseudo-virions+enable+tracking+of+angiotensin+Converting+enzyme+2+binding+and+endocytosis.">Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis.</a> ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).</li><li>Narayanan, S. S., Pal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+CdS+quantum+dots:+Host+of+biomolecular+ligands.">Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+together+with+virus+receptor+ACE2.">Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2.</a> Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).</li><li>Hildebrandt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer+with+semiconductor+quantum+dot+bioconjugates:+A+versatile+platform+for+biosensing,+energy+harvesting,+and+other+developing+applications.">Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications.</a> Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).</li></ol>

Metoden beskrevet i denne artikel giver de nødvendige trin til billeddannelse af funktionaliserede QD'er i humane celler ved hjælp af konfokal mikroskopi med høj gennemstrømning. Denne metode er bedst egnet til celler, hvor endocytose er den vigtigste indgangsvej snarere end aktiviteten af TMPRSS2 og membranfusion, da den muliggør undersøgelse af SARS-CoV-2 Spike og hACE2 endocytose. På grund af QD-modellens karakter og C-terminal His-tag på den kommercielt tilgængelige Spike-trimer vil enhver TMPRSS2-spaltning ...

Fluorescensmikroskopi gør det muligt for forskere at kigge ind i cellens indre arbejde ved hjælp af specialiserede farvestoffer1, genetisk kodede fluorescerende proteiner2 og fluorescerende nanopartikler i form af kvantepunkter (QD'er)3. For det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus i 2019 (SARS-CoV-2) globale pandemi har forskere anvendt fluorescensmikroskopi til at forstå, hvordan virussen interagerer med cellen både ved plasmamembranen og i cytoplasmaet. For eksempel har forskere været i stand til at få indsigt i bindingen af SARS-CoV-2 Spike-proteinet på virionens overflade til humant angiotensinkonverterende enzym 2 (hACE2) på overfladen af humane celler, efterfølgende internalisering via fusion ved plasmamembranen og endocytose af Spike: hACE2-proteinkomplekset4,5. Der er også opnået stor indsigt i SARS-CoV-2-udgang fra celler via lysosomet ved hjælp af cellulær fluorescensbilleddannelse, et unikt træk ved coronavirus, der tidligere blev anset for at forekomme via traditionel vesikel, der spirer fra Golgi, som det er med mange andre vira6. En grundpille i næsten alle aspekter af biologisk forskning, den cellulære fluorescensmikroskopiteknik har nødvendigvis udviklet sig i sin bredde og anvendelsesområde fra superopløsningsbilleddannelse af hele dyr til automatiseret multiparametrisk billeddannelse med højt indhold til lægemiddelscreening. Her anvendes automatiseret konfokalmikroskopi med højt indhold til undersøgelsen af SARS-CoV-2-celleindgang ved hjælp af fluorescerende QD'er konjugeret til det virale spikeprotein.
Højindholdsanalyse af billeder genereret af biologiske billeddannelsesplatforme giver mulighed for større udvinding af værdifuld biologisk indsigt end enkeltparametre såsom helbrøndeintensitet, som man ville opnå ved hjælp af en multimodal pladelæser7. Ved at adskille objekterne i et synsfelt ved hjælp af automatiserede segmenteringsalgoritmer kan hvert objekt eller en population af objekter analyseres for parametre som intensitet, areal og tekstur i hver tilgængelig fluorescenskanal8. Kombination af mange målinger i multivariate datasæt er en nyttig tilgang til fænotypisk profilering. Når den ønskede fænotype er kendt, såsom QD-internalisering i form af puncta, kan man bruge målingerne relateret til puncta såsom størrelse, antal og intensitet til at vurdere effekten af en behandling.
Cloudbaseret billedanalysesoftware med højt indhold kan rumme et stort udvalg af instrumentdataudgange, herunder billedbehandlingsplatformen med højt indhold. Ved at bruge en skybaseret server til billedlagring og onlineanalyse kan brugeren uploade sine data fra enten billedbehandlingsinstrumentet eller fra det netværksdrev, hvor dataene er gemt. Analysedelen af protokollen udføres i cloud-softwaremiljøet, og data kan eksporteres i en række filformater til downstream-datavisualisering.
SARS-CoV-2-viruset består af ikke-strukturelle og strukturelle proteiner, der hjælper med dets samling og replikation. SARS-CoV-2 spike har to domæner kaldet S1 og S2, hvor S1 indeholder det receptorbindende domæne, der er ansvarlig for hACE2-interaktioner ved plasmamembranen9. Spike har også vist sig at interagere med andre molekyler ved plasmamembranen, der kan fungere som co-receptorer ud over hACE210,11. I hele spikeproteinsekvensen og især ved S1/S2-grænsefladen er der proteasespaltningssteder, der muliggør fusion ved membranen efter transmembranserinprotease 2 (TMPRSS2)12. Forskellige rekombinante SARS-CoV-2 Spike-proteiner er blevet produceret fra individuelle receptorbindingsdomæner til S1, S2, S1 med S2 og hele spike-trimere fra flere kommercielle leverandører til brug i forskningsaktiviteter13.
I dette arbejde blev overfladen af QD'er funktionaliseret med rekombinante spike trimers, der indeholder et histidin tag (QD-Spike). QD'erne produceret af Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section indeholder en cadmiumselenidkerne og en zinksulfidskal14,15. Zinket på QD-overfladen koordinerer histidinresterne i det rekombinante protein for at danne en funktionaliseret QD, der ligner en SARS-CoV-2 viral partikel i form og funktion. Dannelsen af nanopartiklerne og proteinkonjugeringen blev tidligere beskrevet ved anvendelse af det QD-konjugerede receptorbindingsdomæne15. Denne metode beskriver cellekulturpræparater, QD-behandling, billedoptagelse og dataanalyseprotokol, der kan guide en forsker i at studere SARS-CoV-2 Spike-aktivitet i den fysiologiske sammenhæng med en menneskelig celle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

Udviklingen af nye teknologier til cellulær fluorescensmikroskopi har lettet screeningsmetoder med høj kapacitet til lægemiddelopdagelse. Kvantepunkter er fluorescerende nanopartikler med fremragende fotofysiske egenskaber gennemsyret af lys og stabil fotoluminescens samt smalle emissionsbånd. Kvanteprikker er sfæriske i form, og med den rette modifikation af overfladekemien kan de bruges til at konjugere biomolekyler til cellulære applikationer. Disse optiske egenskaber kombineret med evnen til at funktionalisere dem med biomolekyler gør dem til et glimrende værktøj til at undersøge receptor-ligandinteraktioner og cellulær handel. Her præsenterer vi en metode, der bruger kvanteprikker til at spore bindingen og endocytosen af SARS-CoV-2 spike-protein. Denne protokol kan bruges som en vejledning til eksperimentalister, der ønsker at bruge kvantepunkter til at studere protein-protein-interaktioner og menneskehandel i forbindelse med cellulær fysiologi.

Efter behandling vil QD'erne blive internaliseret, da nanopartiklen vil binde sig til ACE2 på plasmamembranen og inducere endocytose. Ved hjælp af en ACE2-GFP-ekspressorcellelinje kan translokation af både QD'er og ACE2 visualiseres ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Når de er internaliseret, viser de to QD- og ACE2-signaler stærk colokalisering. Fra disse billeder kan billedsegmentering og efterfølgende analyse udføres for at udtrække relevante parametre såsom spotantal (figur 1,...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

I denne protokol muliggør kvantepunkter konjugeret til rekombinant SARS-CoV-2-spike cellebaserede assays at overvåge spikebinding til hACE2 ved plasmamembranen og efterfølgende endocytose af de bundne proteiner i cytoplasmaet.

Konfokal billeddannelse med høj gennemstrømning af kvantepunkt-konjugerede SARS-CoV-2 spike-trimmere til at spore binding og endocytose i HEK293T-celler

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Vi har etableret en platformteknologi til SARS COVID 2, der kan anvendes på andre vira med Spike-medieret cellegenkendelse og -indgang som det første skridt i cellulær virusinfektion. Kvantepunkter er lyse, stabile, og deres overflade kan funktionaliseres til en række cellulære applikationer. Ved hjælp af denne metode kan vi visualisere og måle Spike-internalisering i celler.At forberede 0,1% BSA. Tilsæt 130 mikroliter 7,5 % BSA til 10 ml billeddannende medier i mix. For en 6,1 til tre seriel fortynding og tredobling tilsættes 14,26 mikroliter QD Spike til 285,74 mikroliter af 0,1% BSA for at gøre den højeste koncentration på 20 nanomole.Tilsæt derefter 100 mikroliter 20 nanomole eller QD Spike til 200 mikroliter på 0,1% BSA for at gøre den anden vildfarelse af 6,67 nanomole QD Spike. Fjern alle brugte medier fra hver brønd med en flerkanals aspirator, vask en gang med en flerkanalspipette med 100 mikroliter billedmedier pr. brønd, og aspirer derefter 100 mikroliter af billedmediet. Tilsæt 50 mikroliter QD Spike-opløsning pr. Brønd og inkuber pladen i tre timer i en befugtet inkubator ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid.Brug beskyttelsesudstyr, forbered 4% PFA og 0,1% PSA-billedmedier inde i et sterilt biosikkerhedsskab, aspirer 50 mikroliter QD Spike fra hver brønd og tilsæt 100 mikroliter 4% PFA pr. Brønd med en automatiseret flerkanalspipette for at undgå tørring af brøndene. Inkuber i 15 minutter ved stuetemperatur, vask derefter tre gange med PBS, forbered det dybrøde atomfarvestof ved at fortynde fem millimeter stamopløsningen ved en til 1000 i PBS, aspirer PBS og tilsæt 50 mikroliter fortyndet nukleart farvestof pr. Brønd. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur, vask derefter tre gange med PBS, forestil dig pladen eller forsegl den ved hjælp af en pladeforsegler til billeddannelse senere.Opbevar pladen ved fire grader Celsius. Start softwaren til billedbehandlingsplatformen. Efter at have logget ind på billedbehandlingsplatformen opret en ny erhvervelsesprotokol ved at vælge pladetype som en 96 væg gennemsigtig bundbilledplade, vælg optisk tilstand er gået i fokus og forstørrelse som 40 gange vandnedsænkning, vælg binning som en.Vælg tilstanden for digitale ansigtskontraster såsom høj kontrast for at producere veldefinerede cellelegemer. Tag et øjebliksbillede for at bekræfte, at denne overskrift er passende, som det ses i billedvinduet, og vælg den passende C-kanal til brug sammen med ACE2-GFP-cellelinjen for at visualisere ACE2-handel i cellen. For at oprette en brugerdefineret QD-kanal skal du vælge rullemenuen trekant og vælge excitationen i 405 nanometer-området i emission i 608 nanometer-området, vælge en brønd med et robust cytoplasmatisk QD-signal for at indstille eksponeringstiden, lasereffekten og Z-højdepositionen.Kontroller, om standardhøjden giver et billede af cellerne i det ønskede brændplan. Z-positionen vil være lavere for endocytose puncta end Z-positionen for plasmamembranen. Vælg en eksponeringstid, typisk mellem 100 og 300 millisekunder, der producerer et lyst billede med grå niveauer, mindst tre gange større end baggrundssignalet.Ved 20 nanomole skal de grå niveauer være ca. 6.000 atomenheder med 200 millisekunders eksponeringstid og 80% lasereffekt. Kontroller grå niveauer ved at højreklikke på det billede, der er produceret med snapshot-funktionen i hver kanal, og vælg vis intensitet, og venstreklik derefter på objektet af interesse eller baggrund for at se gråniveauet for den pixel, juster lasereffekten for at finjustere intensiteten af de objekter, der er af interesse. Gem anskaffelsesprotokollen, skift til at køre eksperimentet og indtast pladenavnet, kør eksperimentet.Translokation af både QD'er og ACE2 blev visualiseret ved hjælp af fluorescensmikroskopi og en ACE2-GFP-ekspressor cellelinje. Billedsegmentering og efterfølgende analyse blev udført for at udtrække relevante parametre såsom spotantal. For det første blev kerner segmenteret fra den nukleare markørkanal for at skabe en ROI-population.Derefter et ROI-område, der skitserer cellen med segmenteret ved hjælp af ACE2-GFP-kanalen. Endelig blev QD 608 Spike-pletter segmenteret fra cellens ROI-region, internaliserede QD- og ACE2-signaler viste stærk co-lokalisering. Et koncentrationsresponseksperiment med seks forskellige koncentrationer af QD Spike blev udført i HEK 293T-celler.Bestemmelse af optiske koncentrationer af QD, QDS kan anvendes så lavt som 2,22 nanomole, men det anbefales at anvende koncentrationer på 10 nanomole eller højere for at sikre et robust respons. Under konjugering til QD-proteinaggregeringen kan forekomme. Aggregater blev spottet i QD-opløsningen som lyse klumpede bundfald og HEK 293T-celler, QD'er blev inkuberet med neutraliserede antistoffer startende ved 30 mikrogram pr. Mikroliter før tilsætning til celler, disse antistoffer blokerede bindende internalisering og forårsagede en reduktion i spottællingen sammenlignet med celler, der kun blev behandlet med QD.Dette essay kan også bruges til screening med høj gennemstrømning, blyevaluering af neutraliserende antistoffer for at identificere ordspil antivirale midler til blokviralindgangen og tilpasses til at studere nyopståede varianter.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserede Måling af Store betjente Calcium indtastning i levende celler: fra kulturperler kræftcellen til at Skeletmuskel Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

En High Throughput MHC II Bindende Assay til kvantitativ analyse af peptidepitoper

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening for kemiske modulatorer af post-transkriptionelt regulerede gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Anvendelser af pHluorin Kvantitative, Kinetic og High-throughput Analyse af Endocytose i Spirende gær

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

At udnytte Live Imaging til Track kerner under Myoblast differentiering og Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

High-Throughput Live Imaging af mikrokolonier til måling af heterogenitet i vækst og genekspression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

To-trins omvendt transkriptionsdråbe digitale PCR-protokoller til SARS-CoV-2-detektion og kvantificering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Swabbing bymiljøet - En rørledning til prøveudtagning og påvisning af SARS-CoV-2 fra miljøreservoirer

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

En platform med høj kapacitet til kultur og 3D-billeddannelse af organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

Karakterisering af pattedyrs zinktransportører ved hjælp af et in vitro zinktransportassay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...