Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door het Intramurale Onderzoeksprogramma van het National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Naval Research Laboratory verstrekte financiering via zijn interne Nanoscience Institute. Reagensvoorbereiding werd ondersteund via het NRL COVID-19-basisfonds.

De HEK293T-cellijn die in deze studie wordt gebruikt, is een vereeuwigde cellijn. In deze studie werden geen menselijke of dierlijke proefpersonen gebruikt.
1. Cel kweken en zaaien
<ol><li>In een steriele bioveiligheidskast, met persoonlijke beschermingsmiddelen (inclusief laboratoriumhandschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril), bereidt u celkweekmedium voor door Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aan te vullen met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / s...

<ol>
	<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Lysosomes+in+Live+Cells+with+LysoTracker.">Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments.">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li><li>Barroso, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots+in+cell+biology.">Quantum dots in cell biology.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).</li><li>Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACE2:+Evidence+of+role+as+entry+receptor+for+SARS-CoV-2+and+implications+in+comorbidities.">ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities.</a> eLife. 9, 61390 (2020).</li><li>Shang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+mechanisms+of+SARS-CoV-2.">Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).</li><li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Coronaviruses+use+lysosomes+for+egress+instead+of+the+biosynthetic+secretory+pathway.">&#946;-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway.</a> Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).</li><li>Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+guidelines+for+image-based+high+content+screening,+high+content+analysis+and+high+content+imaging.">Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+profiling+for+drug+discovery:+due+for+a+machine-learning+upgrade.">Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).</li><li>Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+properties+of+SARS-CoV-2+spike+protein:+potential+antivirus+drug+development+for+COVID-19.">Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+spike+protein+interacts+with+multiple+innate+immune+receptors.">SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors.</a> bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+assists+SARS-CoV-2+in+cell+entry+and+can+be+targeted+by+approved+drugs+in+vitro.">Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro.</a> Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+Is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+conformational+states+of+SARS-CoV-2+spike+protein.">Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein.</a> Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).</li><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+cellular+toxicity+for+cadmium-containing+quantum+dots.">Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots.</a> Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).</li><li>Gorshkov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-conjugated+SARS-CoV-2+spike+pseudo-virions+enable+tracking+of+angiotensin+Converting+enzyme+2+binding+and+endocytosis.">Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis.</a> ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).</li><li>Narayanan, S. S., Pal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+CdS+quantum+dots:+Host+of+biomolecular+ligands.">Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+together+with+virus+receptor+ACE2.">Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2.</a> Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).</li><li>Hildebrandt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer+with+semiconductor+quantum+dot+bioconjugates:+A+versatile+platform+for+biosensing,+energy+harvesting,+and+other+developing+applications.">Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications.</a> Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).</li></ol>

De methode die in dit artikel wordt beschreven, biedt de nodige stappen voor het in beeld brengen van gefunctionaliseerde QD's in menselijke cellen met behulp van confocale microscopie met hoge doorvoer. Deze methode is het meest geschikt voor cellen waar endocytose de belangrijkste route van virale binnenkomst is in plaats van de activiteit van TMPRSS2 en membraanfusie, omdat het de studie van SARS-CoV-2 Spike en hACE2 endocytose mogelijk maakt. Vanwege de aard van het QD-model en de C-terminal His-tag op de in de hande...

Fluorescentiemicroscopie stelt onderzoekers in staat om in de innerlijke werking van de cel te kijken met behulp van gespecialiseerde kleurstoffen1, genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten2 en fluorescerende nanodeeltjes in de vorm van quantum dots (QDs)3. Voor de wereldwijde pandemie van het ernstige acute respiratoire syndroom coronavirus van 2019 (SARS-CoV-2) hebben onderzoekers fluorescentiemicroscopie gebruikt om te begrijpen hoe het virus interageert met de cel, zowel bij het plasmamembraan als in het cytoplasma. Onderzoekers hebben bijvoorbeeld inzicht kunnen krijgen in de binding van het SARS-CoV-2 Spike-eiwit op het oppervlak van het virion aan het menselijke angiotensine-converterende enzym 2 (hACE2) op het oppervlak van menselijke cellen, daaropvolgende internalisatie via fusie aan het plasmamembraan en endocytose van het Spike: hACE2-eiwitcomplex4,5. Er zijn ook geweldige inzichten verkregen in de SARS-CoV-2-uitgang van cellen via het lysosoom met behulp van cellulaire fluorescentiebeeldvorming, een uniek kenmerk van coronavirussen waarvan eerder werd gedacht dat ze optraden via traditionele blaasjes die ontluiken uit de Golgi, zoals het is met veel andere virussen6. Een steunpilaar van bijna alle aspecten van biologisch onderzoek, de cellulaire fluorescentiemicroscopietechniek is noodzakelijkerwijs gevorderd in zijn breedte en toepassingsgebied van superresolutie beeldvorming van hele dieren tot geautomatiseerde multi-parametrische beeldvorming met een hoog gehalte voor geneesmiddelenscreening. Hier wordt geautomatiseerde confocale microscopie met een hoog gehalte toegepast op de studie van SARS-CoV-2-celinvoer met behulp van fluorescerende QD's geconjugeerd aan het virale spike-eiwit.
High-content analyse van beelden gegenereerd door biologische beeldvormingsplatforms maakt een grotere extractie van waardevolle biologische inzichten mogelijk dan afzonderlijke parameters zoals de intensiteit van de hele put, die men zou verkrijgen met behulp van een multimodale plaatlezer7. Door de objecten in een gezichtsveld te scheiden met behulp van geautomatiseerde segmentatiealgoritmen, kan elk object of een populatie objecten worden geanalyseerd op parameters zoals intensiteit, oppervlakte en textuur in elk beschikbaar fluorescentiekanaal8. Het combineren van veel metingen in multivariate datasets is een nuttige benadering voor fenotypische profilering. Wanneer het gewenste fenotype bekend is, zoals QD-internalisatie in de vorm van puncta, kan men de metingen met betrekking tot puncta zoals grootte, aantal en intensiteit gebruiken om de werkzaamheid van een behandeling te beoordelen.
Cloudgebaseerde high content imaging-analysesoftware is geschikt voor een grote verscheidenheid aan instrumentgegevensuitvoer, waaronder het high content imaging-platform. Door een cloudgebaseerde server te gebruiken voor beeldopslag en online analyse, kan de gebruiker zijn gegevens uploaden vanaf het beeldvormingsinstrument of vanaf de netwerkschijf waar de gegevens zijn opgeslagen. Het analysegedeelte van het protocol wordt uitgevoerd binnen de cloudsoftwareomgeving en gegevens kunnen in verschillende bestandsindelingen worden geëxporteerd voor downstream-gegevensvisualisatie.
Het SARS-CoV-2-virus bestaat uit niet-structurele en structurele eiwitten die helpen bij de assemblage en replicatie ervan. SARS-CoV-2-piek heeft twee domeinen genaamd S1 en S2, waarbij S1 het receptorbindende domein bevat dat verantwoordelijk is voor hACE2-interacties bij het plasmamembraan9. Spike blijkt ook te interageren met andere moleculen in het plasmamembraan die naast hACE210,11 als co-receptoren kunnen fungeren. Gedurende de spike-eiwitsequentie en met name op de S1/S2-interface zijn er proteasesplitsingsplaatsen die fusie op het membraan mogelijk maken na het transmembraan serineprotease 2 (TMPRSS2)12. Verschillende recombinante SARS-CoV-2 Spike-eiwitten zijn geproduceerd uit individuele receptorbindende domeinen, tot S1, S2, S1 met S2 en hele spike trimers van meerdere commerciële leveranciers voor gebruik in onderzoeksactiviteiten13.
In dit werk werd het oppervlak van QD's gefunctionaliseerd met recombinante spike trimers die een histidine tag (QD-Spike) bevatten. De QD's geproduceerd door Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section bevatten een cadmiumselenidekern en een zinksulfideschaal14,15. Het zink op het QD-oppervlak coördineert de histidineresiduen in het recombinante eiwit om een gefunctionaliseerde QD te vormen die qua vorm en functie lijkt op een SARS-CoV-2-virusdeeltje. De generatie van de nanodeeltjes en eiwitconjugatie werd eerder beschreven met behulp van het QD-geconjugeerde receptorbindingsdomein15. Deze methode beschrijft de celkweekpreparaten, QD-behandeling, beeldacquisitie en data-analyseprotocol dat een onderzoeker kan begeleiden bij het bestuderen van SARS-CoV-2 Spike-activiteit in de fysiologische context van een menselijke cel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

De ontwikkeling van nieuwe technologieën voor cellulaire fluorescentiemicroscopie heeft screeningmethoden met hoge doorvoer voor het ontdekken van geneesmiddelen vergemakkelijkt. Quantum dots zijn fluorescerende nanodeeltjes met uitstekende fotofysische eigenschappen doordrenkt met heldere en stabiele fotoluminescentie en smalle emissiebanden. Quantum dots zijn bolvormig en kunnen met de juiste modificatie van de oppervlaktechemie worden gebruikt om biomoleculen te conjugeren voor cellulaire toepassingen. Deze optische eigenschappen, gecombineerd met het vermogen om ze te functionaliseren met biomoleculen, maken ze een uitstekend hulpmiddel voor het onderzoeken van receptor-ligandinteracties en cellulaire handel. Hier presenteren we een methode die quantum dots gebruikt om de binding en endocytose van SARS-CoV-2 spike-eiwit te volgen. Dit protocol kan worden gebruikt als een gids voor experimentalisten die quantum dots willen gebruiken om eiwit-eiwitinteracties en mensenhandel te bestuderen in de context van cellulaire fysiologie.

Na behandeling zullen de QD's worden geïnternaliseerd omdat het nanodeeltje zich bindt aan ACE2 op het plasmamembraan en endocytose induceert. Met behulp van een ACE2-GFP-expressiecellijn kan de translocatie van zowel QD's als ACE2 worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie. Eenmaal geïnternaliseerd, vertonen de twee QD- en ACE2-signalen een sterke colocalisatie. Uit deze beelden kan beeldsegmentatie en daaropvolgende analyse worden uitgevoerd om relevante parameters zoals spot count te extraheren (<...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

In dit protocol stellen quantum dots geconjugeerd aan recombinant SARS-CoV-2 spike celgebaseerde assays in staat om spikebinding aan hACE2 aan het plasmamembraan en daaropvolgende endocytose van de gebonden eiwitten in het cytoplasma te controleren.

Confocale beeldvorming met hoge doorvoer van Quantum Dot-geconjugeerde SARS-CoV-2 Spike Trimers om binding en endocytose in HEK293T-cellen te volgen

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

We hebben een platformtechnologie voor SARS COVID 2 opgezet die van toepassing kan zijn op andere virussen met Spike-gemedieerde celherkenning en -invoer als de eerste stap in cellulaire virale infectie. Quantum dots zijn helder, stabiel en hun oppervlak kan worden gefunctionaliseerd voor een verscheidenheid aan cellulaire toepassingen. Met behulp van deze methode kunnen we Spike-internalisatie in cellen visualiseren en meten.Om 0,1% BSA voor te bereiden. Voeg 130 microliter van 7,5% BSA toe aan 10 milliliter beeldmedia in de mix. Voeg voor een 6,1 tot drie seriële verdunning en drievoud 14,26 microliter QD Spike toe aan 285,74 microliter van de 0,1% BSA om de hoogste concentratie van 20 nanomol te maken.Voeg vervolgens 100 microliter van 20 nanomol of QD Spike toe aan 200 microliter van 0,1% BSA om de tweede waan van 6,67 nanomol QD Spike te maken. Verwijder alle gebruikte media uit elke put met een meerkanaals aspirator, was eenmaal met een meerkanaalspipet met 100 microliter beeldmedia per put enspirateer vervolgens 100 microliter van de beeldvormende media. Voeg 50 microliter QD Spike-oplossing per put toe en incubeer de plaat gedurende drie uur in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.Draag beschermende uitrusting, bereid 4% PFA en 0,1% PSA-beeldvormingsmedia voor in een steriele bioveiligheidskast, zuig 50 microliter QD Spike uit elke put en voeg 100 microliter van 4% PFA per put toe met een geautomatiseerde meerkanaalspipet om te voorkomen dat de putten worden gedroogd. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, was vervolgens drie keer met PBS, bereid de dieprode kernkleurstof voor door de vijf millimeter voorraadoplossing te verdunnen bij één tot 1000 in PBS, zuig de PBS op en voeg 50 microliter verdunde kernkleurstof per put toe. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en was vervolgens drie keer met PBS, beeld de plaat in of verzegel deze met een platensealer voor beeldvorming later.Bewaar het bord bij vier graden Celsius. Start de software voor het imaging platform. Na het inloggen op het beeldvormingsplatform maakt u een nieuw acquisitieprotocol door het plaattype te selecteren als een 96-wand transparante bodembeeldplaat, selecteer optische modus is focale en vergroting als 40 keer onderdompeling in water gegaan, selecteer binning als één.Selecteer de modus voor digitale gezichtscontrasten zoals hoog contrast om goed gedefinieerde cellichamen te produceren. Maak een momentopname om te bevestigen dat deze kop geschikt is zoals te zien in het afbeeldingsvenster, selecteer het geschikte C-kanaal voor gebruik met de ACE2-GFP-cellijn om ACE2-handel in de cel te visualiseren. Om een aangepast QD-kanaal te maken, selecteert u het vervolgkeuzemenu driehoek en kiest u de excitatie in het 405 nanometerbereik in emissie in het bereik van 608 nanometer, selecteert u een put met een robuust cytoplasmatisch QD-signaal om de belichtingstijd, het laservermogen en de Z-hoogtepositie in te stellen.Controleer of de standaardhoogte een afbeelding van de cellen in het gewenste brandpuntsvlak oplevert. De Z-positie zal lager zijn voor de endocytose puncta dan de Z-positie voor het plasmamembraan. Kies een belichtingstijd, meestal tussen 100 en 300 milliseconden, die een helder beeld oplevert met grijswaarden die ten minste drie keer groter zijn dan het achtergrondsignaal.Bij 20 nanomol zouden de grijswaarden ongeveer 6.000 atomaire eenheden moeten zijn met een belichtingstijd van 200 milliseconden en een laservermogen van 80%. Controleer grijsniveaus door met de rechtermuisknop op de afbeelding te klikken die is geproduceerd met de snapshot-functie in elk kanaal en toonintensiteit te selecteren, klik vervolgens met de linkermuisknop op het interessante object of de achtergrond om het grijsniveau voor die pixel te bekijken, pas het laservermogen aan om de intensiteit van de interessante objecten nauwkeurig af te stellen. Sla het acquisitieprotocol op, schakel over om het experiment uit te voeren en voer de naam van de plaat in, voer het experiment uit.Translocatie van zowel QD's als ACE2 werd gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie en een ACE2-GFP-expresserende cellijn. Beeldsegmentatie en daaropvolgende analyse werd uitgevoerd om relevante parameters zoals het aantal vlekken te extraheren. Eerst werden kernen gesegmenteerd uit het nucleaire markerkanaal om een ROI-populatie te creëren.Vervolgens een ROI-regio waarin de cel wordt geschetst met gesegmenteerd met behulp van het ACE2-GFP-kanaal. Ten slotte werden QD 608 Spike-spots gesegmenteerd vanuit de cel ROI-regio, geïnternaliseerde QD- en ACE2-signalen vertoonden een sterke co-lokalisatie. Een concentratieresponsexperiment met zes verschillende concentraties QD Spike werd uitgevoerd in HEK 293T-cellen.Het bepalen van optische concentraties van QD, QDS kan worden gebruikt zo laag als 2,22 nanomol, maar het wordt aanbevolen om concentraties van 10 nanomol of hoger te gebruiken om een robuuste respons te garanderen. Tijdens conjugatie naar de QD-eiwitaggregatie kan optreden. Aggregaten werden in de QD-oplossing gespot als heldere samengeklonterde neerslag en HEK 293T-cellen, QD's werden geïncubeerd met geneutraliseerde antilichamen vanaf 30 microgram per microliter vóór toevoeging aan cellen, deze antilichamen blokkeerden bindende internalisatie en veroorzaakten een vermindering van het aantal vlekken in vergelijking met cellen die alleen met QD werden behandeld.Dit essay kan ook worden gebruikt voor high-throughput screening, leadevaluatie van neutraliserende antilichamen om pun antivirals te identificeren voor de blok virale binnenkomst en worden aangepast om nieuw opkomende varianten te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescentie-gebaseerde waardering van Store-bediende Calcium Entry in levende cellen: van Cultured Cancer Cell op Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Een High Throughput MHC II Bindingsassay voor de kwantitatieve analyse van peptide-epitopen

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Toepassingen van pHluorin voor Quantitative, Kinetic en High-throughput analyse van de Humor in gist

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Exploitatie van de levende Imaging te Track kernen tijdens Myoblast differentiatie en Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Live imaging met hoge doorvoer van microkolonnies om heterogeniteit in groei en genexpressie te meten

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Tweestaps omgekeerde transcriptiedruppel digitale PCR-protocollen voor SARS-CoV-2-detectie en kwantificering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Swabbing the Urban Environment - Een pijpleiding voor bemonstering en detectie van SARS-CoV-2 uit milieureservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Een high-throughput platform voor cultuur en 3D-beeldvorming van organoïden

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

Karakterisering van zinktransporters bij zoogdieren met behulp van een in-vitro-zinktransporttest

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...