Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

Cette recherche a été soutenue en partie par le programme de recherche intra-muros du National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Le Naval Research Laboratory a fourni un financement par l’intermédiaire de son Institut interne de nanosciences. La préparation des réactifs a été soutenue par le fonds de base NRL COVID-19.

La lignée cellulaire HEK293T utilisée dans cette étude est une lignée cellulaire immortalisée. Aucun sujet humain ou animal n’a été utilisé dans cette étude.
1. Culture et ensemencement cellulaire
<ol><li>À l’intérieur d’une armoire stérile de biosécurité, en portant de l’équipement de protection individuelle (y compris des gants de laboratoire, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité), préparez le milieu de culture cellulaire en compl...

<ol>
	<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Lysosomes+in+Live+Cells+with+LysoTracker.">Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments.">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li><li>Barroso, M. 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S., Pal, S. 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La méthode décrite dans cet article fournit les étapes nécessaires pour l’imagerie de QD fonctionnalisés dans des cellules humaines à l’aide de la microscopie confocale à haut débit. Cette méthode convient mieux aux cellules où l’endocytose est la principale voie d’entrée virale plutôt que l’activité de TMPRSS2 et de fusion membranaire, car elle permet d’étudier le PIC SARS-CoV-2 et l’endocytose hACE2. En raison de la nature du modèle QD et de l’étiquette His-terminal C sur le trimer Spike...

La microscopie à fluorescence permet aux chercheurs d’examiner le fonctionnement interne de la cellule à l’aide de colorants spécialisés1, de protéines fluorescentes génétiquement codées2 et de nanoparticules fluorescentes sous forme de points quantiques (QD)3. Pour la pandémie mondiale du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère de 2019 (SARS-CoV-2), les chercheurs ont utilisé la microscopie à fluorescence pour comprendre comment le virus interagit avec la cellule à la fois au niveau de la membrane plasmique et du cytoplasme. Par exemple, les chercheurs ont pu mieux comprendre la liaison de la protéine Spike du SRAS-CoV-2 à la surface du virion à l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine 2 (hACE2) à la surface des cellules humaines, l’internalisation ultérieure par fusion au niveau de la membrane plasmique et l’endocytose du complexe protéique Spike:hACE24,5. De grandes connaissances ont également été acquises sur la sortie du SARS-CoV-2 des cellules via le lysosome à l’aide de l’imagerie par fluorescence cellulaire, une caractéristique unique des coronavirus que l’on pensait auparavant se produire via le bourgeonnement traditionnel des vésicules du Golgi, comme c’est le cas avec de nombreux autres virus6. Pilier de presque tous les aspects de la recherche biologique, la technique de microscopie à fluorescence cellulaire a nécessairement progressé dans son étendue et son champ d’application, de l’imagerie à super-résolution d’animaux entiers à l’imagerie multiparamétrique automatisée à haut contenu pour le dépistage de drogues. Ici, la microscopie confocale automatisée à haute teneur est appliquée à l’étude de l’entrée des cellules du SARS-CoV-2 à l’aide de QD fluorescents conjugués à la protéine de pointe virale.
L’analyse à haut contenu des images générées par les plates-formes d’imagerie biologique permet une plus grande extraction d’informations biologiques précieuses que des paramètres uniques tels que l’intensité du puits entier, que l’on obtiendrait à l’aide d’un lecteur de plaque multimodal7. En séparant les objets dans un champ de vision à l’aide d’algorithmes de segmentation automatisés, chaque objet ou une population d’objets peut être analysé pour des paramètres tels que l’intensité, la surface et la texture dans chaque canal de fluorescence disponible8. La combinaison de nombreuses mesures dans des ensembles de données multivariés est une approche utile pour le profilage phénotypique. Lorsque le phénotype souhaité est connu, comme l’internalisation du QD sous forme de puncta, on peut utiliser les mesures liées au puncta telles que la taille, le nombre et l’intensité pour évaluer l’efficacité d’un traitement.
Le logiciel d’analyse d’imagerie à haut contenu basé sur le cloud peut accueillir une grande variété de sorties de données d’instruments, y compris la plate-forme d’imagerie à haut contenu. En utilisant un serveur basé sur le cloud pour le stockage d’images et l’analyse en ligne, l’utilisateur peut télécharger ses données à partir de l’instrument d’imagerie ou du lecteur réseau où les données sont stockées. La partie analyse du protocole est effectuée dans l’environnement logiciel cloud, et les données peuvent être exportées dans une variété de formats de fichiers pour la visualisation des données en aval.
Le virus SARS-CoV-2 est composé de protéines non structurelles et structurelles qui aident à son assemblage et à sa réplication. Le pic du SRAS-CoV-2 a deux domaines appelés S1 et S2, S1 contenant le domaine de liaison aux récepteurs responsable des interactions hACE2 au niveau de la membrane plasmique9. Spike a également été trouvé pour interagir avec d’autres molécules à la membrane plasmique qui peuvent agir comme co-récepteurs en plus de hACE210,11. Tout au long de la séquence protéique de pointe et en particulier à l’interface S1/S2, il existe des sites de clivage de la protéase qui permettent la fusion au niveau de la membrane après la sérine transmembranaire protéase 2 (TMPRSS2)12. Diverses protéines recombinantes de spike du SARS-CoV-2 ont été produites à partir de domaines de liaison de récepteurs individuels, à S1, S2, S1 avec S2 et à des trimères de pointe entiers de plusieurs fournisseurs commerciaux pour une utilisation dans des activités de recherche13.
Dans ce travail, la surface des QD a été fonctionnalisée avec des trimères de pointes recombinants contenant une étiquette d’histidine (QD-Spike). Les QD produits par naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section contiennent un noyau de séléniure de cadmium et une coque de sulfure de zinc14,15. Le zinc à la surface du QD coordonne les résidus d’histidine dans la protéine recombinante pour former un QD fonctionnalisé qui ressemble à une particule virale du SARS-CoV-2 dans sa forme et sa fonction. La génération des nanoparticules et la conjugaison des protéines ont été décrites précédemment à l’aide du domaine de liaison au récepteur conjugué QD15. Cette méthode décrit les préparations de culture cellulaire, le traitement QD, l’acquisition d’images et le protocole d’analyse de données qui peuvent guider un chercheur dans l’étude de l’activité du pic du SRAS-CoV-2 dans le contexte physiologique d’une cellule humaine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

Le développement de nouvelles technologies pour la microscopie à fluorescence cellulaire a facilité les méthodes de criblage à haut débit pour la découverte de médicaments. Les points quantiques sont des nanoparticules fluorescentes avec d’excellentes propriétés photophysiques imprégnées d’une photoluminescence brillante et stable ainsi que de bandes d’émission étroites. Les points quantiques sont de forme sphérique et, avec la modification appropriée de la chimie de surface, peuvent être utilisés pour conjuguer des biomolécules pour des applications cellulaires. Ces propriétés optiques, combinées à la capacité de les fonctionnaliser avec des biomolécules, en font un excellent outil pour étudier les interactions récepteur-ligand et le trafic cellulaire. Ici, nous présentons une méthode qui utilise des points quantiques pour suivre la liaison et l’endocytose de la protéine de pointe du SRAS-CoV-2. Ce protocole peut être utilisé comme guide pour les expérimentateurs qui cherchent à utiliser des points quantiques pour étudier les interactions et le trafic protéine-protéine dans le contexte de la physiologie cellulaire.

Après le traitement, les QD seront internalisés car la nanoparticule se liera à ACE2 sur la membrane plasmique et induira une endocytose. À l’aide d’une lignée cellulaire exprimant ACE2-GFP, la translocation des QD et de l’ACE2 peut être visualisée à l’aide de la microscopie à fluorescence. Une fois internalisés, les deux signaux QD et ACE2 montrent une forte colocalisation. À partir de ces images, la segmentation de l’image et l’analyse ultérieure peuvent être effectuées pour extraire des param...

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High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

Dans ce protocole, les points quantiques conjugués au pic recombinant du SARS-CoV-2 permettent aux tests cellulaires de surveiller la liaison du pic à hACE2 au niveau de la membrane plasmique et l’endocytose ultérieure des protéines liées dans le cytoplasme.

Imagerie confocale à haut débit des trimères de pointes SRAS-CoV-2 conjuguées aux points quantiques pour suivre la liaison et l’endocytose dans les cellules HEK293T

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Nous avons mis en place une technologie de plate-forme pour le SRAS COVID 2 qui peut être applicable à d’autres virus avec la reconnaissance cellulaire médiée par Spike et l’entrée comme première étape de l’infection virale cellulaire. Les points quantiques sont brillants, stables et leur surface peut être fonctionnalisée pour une variété d’applications cellulaires. En utilisant cette méthode, nous pouvons visualiser et mesurer l’internalisation de Spike dans les cellules.Pour préparer 0,1%BSA. Ajouter 130 microlitres de 7,5 % de BSA à 10 millilitres de supports d’imagerie en mélange. Pour une dilution en série de 6,1 à trois et un triple, ajoutez 14,26 microlitres de QD Spike à 285,74 microlitres du 0,1% BSA pour obtenir la concentration la plus élevée de 20 nanomoles.Ajoutez ensuite 100 microlitres de 20 nanomoles ou QD Spike à 200 microlitres de 0,1% BSA pour faire la deuxième illusion de 6,67 nanomoles QD Spike. Retirez tous les supports usés de chaque puits à l’aide d’un aspirateur multicanal, lavez une fois avec une pipette multicanal avec 100 microlitres de supports d’imagerie par puits, puis aspirez 100 microlitres du support d’imagerie. Ajoutez 50 microlitres de solution QD Spike par puits et incubez la plaque pendant trois heures dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone.En portant un équipement de protection, préparez des supports d’imagerie à 4 % de PFA et 0,1 % de PSA à l’intérieur d’une armoire de biosécurité stérile, aspirez 50 microlitres de QD Spike de chaque puits et ajoutez 100 microlitres de 4 % de PFA par puits avec une pipette multicanal automatisée pour éviter de sécher les puits. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante, puis laver trois fois avec du PBS, préparer le colorant nucléaire rouge foncé en diluant la solution mère de cinq millimètres à un à 1000 dans du PBS, aspirer le PBS et ajouter 50 microlitres de colorant nucléaire dilué par puits. Incuber pendant 30 minutes à température ambiante puis laver trois fois avec du PBS, imager la plaque ou la sceller à l’aide d’un scellant à plaques pour l’imagerie ultérieure.Conservez la plaque à quatre degrés Celsius. Démarrez le logiciel de la plate-forme d’imagerie. Après avoir connecté à la plate-forme d’imagerie, créez un nouveau protocole d’acquisition en sélectionnant le type de plaque comme plaque d’imagerie inférieure transparente à 96 parois, sélectionnez le mode optique est devenu focal et le grossissement comme 40 fois l’immersion dans l’eau, sélectionnez le binning comme un.Sélectionnez le mode de contraste numérique du visage, tel qu’un contraste élevé, pour produire des corps cellulaires bien définis. Prenez un instantané pour confirmer que ce titre est approprié comme indiqué dans la fenêtre d’image, sélectionnez le canal C approprié à utiliser avec la lignée cellulaire ACE2-GFP pour visualiser le trafic ACE2 dans la cellule. Pour créer un canal QD personnalisé, sélectionnez le menu déroulant triangle et choisissez l’excitation dans la plage de 405 nanomètres en émission dans la gamme de 608 nanomètres, sélectionnez un puits avec un signal QD cytoplasmique robuste pour régler le temps d’exposition, la puissance laser et la position de hauteur Z.Vérifiez si la hauteur par défaut produit une image des cellules dans le plan focal souhaité. La position Z sera plus basse pour l’endocytose puncta que la position Z pour la membrane plasmique. Choisissez un temps d’exposition, généralement compris entre 100 et 300 millisecondes, qui produit une image lumineuse avec des niveaux de gris, au moins trois fois supérieurs au signal d’arrière-plan.À 20 nanomoles, les niveaux de gris devraient être d’environ 6 000 unités atomiques avec un temps d’exposition de 200 millisecondes et une puissance laser de 80%. Vérifiez les niveaux de gris en cliquant avec le bouton droit de la souris sur l’image produite avec la fonction d’instantané dans chaque canal et en sélectionnant afficher l’intensité, puis cliquez avec le bouton gauche sur l’objet d’intérêt ou l’arrière-plan pour afficher le niveau de gris de ce pixel, ajustez la puissance laser pour affiner l’intensité des objets d’intérêt. Enregistrez le protocole d’acquisition, basculez pour exécuter l’expérience et entrez le nom de la plaque, exécutez l’expérience.La translocation des QD et de l’ACE2 a été visualisée à l’aide de la microscopie à fluorescence et d’une lignée cellulaire exprimant ACE2-GFP. La segmentation de l’image et l’analyse ultérieure ont été effectuées pour extraire les paramètres pertinents tels que le nombre de points. Tout d’abord, les noyaux ont été segmentés à partir du canal marqueur nucléaire pour créer une population de retour sur investissement.Ensuite, une région roi décrivant la cellule avec segmenté à l’aide du canal ACE2-GFP. Enfin, les points de pointe QD 608 ont été segmentés à partir de la région roi cellulaire, les signaux QD et ACE2 internalisés ont montré une forte colocalisation. Une expérience de réponse de concentration avec six concentrations différentes de QD Spike a été réalisée dans des cellules HEK 293T.En déterminant les concentrations optiques de QD, QDS peut être utilisé aussi bas que 2,22 nanomoles, cependant, il est recommandé d’utiliser des concentrations de 10 nanomole ou plus pour assurer une réponse robuste. Au cours de la conjugaison avec l’agrégation de la protéine QD peut se produire. Des agrégats ont été repérés dans la solution QD sous forme de précipités agglomérés brillants et de cellules HEK 293T, les QD ont été incubés avec des anticorps neutralisés à partir de 30 microgrammes par microlitre avant l’ajout aux cellules, ces anticorps ont bloqué l’internalisation de la liaison et ont entraîné une réduction du nombre de points par rapport aux cellules traitées avec QD uniquement.Cet essai peut également être utilisé pour le dépistage à haut débit, l’évaluation principale des anticorps neutralisants afin d’identifier les antiviraux de jeu de mots à l’entrée virale de bloc et être adapté pour étudier les nouvelles variantes émergentes.

Research

JoVE Journal

Biology

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Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Protocoles de PCR numérique en gouttelettes à transcription inverse en deux étapes pour la détection et la quantification du SRAS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Écouvillonner l’environnement urbain - Un pipeline pour l’échantillonnage et la détection du SARS-CoV-2 dans les réservoirs environnementaux

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Une plateforme à haut débit pour la culture et l’imagerie 3D d’organoïdes

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

Caractérisation des transporteurs de zinc chez les mammifères à l’aide d’un test in vitro de transport du zinc

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...