Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

Diese Forschung wurde zum Teil durch das Intramural Research Program des National Center for Advancing Translational Sciences, NIH, unterstützt. Das Naval Research Laboratory stellte die Finanzierung über sein internes Nanoscience Institute zur Verfügung. Die Reagenzienvorbereitung wurde über den NRL COVID-19 Basisfonds unterstützt.

Die in dieser Studie verwendete HEK293T-Zelllinie ist eine immortalisierte Zelllinie. In dieser Studie wurden keine menschlichen oder tierischen Probanden verwendet.
1. Zellkultivierung und Aussaat
<ol><li>Bereiten Sie in einer sterilen Biosicherheitskabine mit persönlicher Schutzausrüstung (einschließlich Laborhandschuhen, Laborkittel und Schutzbrille) Zellkulturmedium vor, indem Sie das modifizierte Adlermedium (DMEM) von Dulbecco mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% P...

<ol>
	<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Lysosomes+in+Live+Cells+with+LysoTracker.">Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments.">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li><li>Barroso, M. 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S., Pal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+CdS+quantum+dots:+Host+of+biomolecular+ligands.">Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+together+with+virus+receptor+ACE2.">Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2.</a> Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).</li><li>Hildebrandt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer+with+semiconductor+quantum+dot+bioconjugates:+A+versatile+platform+for+biosensing,+energy+harvesting,+and+other+developing+applications.">Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications.</a> Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).</li></ol>

Die in diesem Artikel beschriebene Methode bietet die notwendigen Schritte für die Bildgebung funktionalisierter QDs in menschlichen Zellen mittels konfokaler Hochdurchsatzmikroskopie. Diese Methode eignet sich am besten für Zellen, bei denen Endozytose der Hauptweg des viralen Eintritts und nicht die Aktivität von TMPRSS2 und Membranfusion ist, da sie die Untersuchung von SARS-CoV-2 Spike und hACE2 Endozytose ermöglicht. Aufgrund der Art des QD-Modells und des C-terminalen His-Tags auf dem kommerziell erhältlichen ...

Die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es Forschern, mit speziellen Farbstoffen1, genetisch kodierten fluoreszierenden Proteinen2 und fluoreszierenden Nanopartikeln in Form von Quantenpunkten (QDs)3 in das Innenleben der Zelle zu blicken. Für das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus von 2019 (SARS-CoV-2) globale Pandemie haben Forscher Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt, um zu verstehen, wie das Virus mit der Zelle sowohl an der Plasmamembran als auch im Zytoplasma interagiert. So konnten Forscher Einblicke in die Bindung des SARS-CoV-2-Spike-Proteins auf der Oberfläche des Virions an das menschliche Angiotensin-Converting-Enzym 2 (hACE2) auf der Oberfläche menschlicher Zellen, die anschließende Internalisierung durch Fusion an der Plasmamembran und die Endozytose des Spike:hACE2-Proteinkomplexes4,5 gewinnen. Große Einblicke wurden auch in das SARS-CoV-2-Austritt aus Zellen über das Lysosom unter Verwendung der zellulären Fluoreszenzbildgebung gewonnen, ein einzigartiges Merkmal von Coronaviren, von denen bisher angenommen wurde, dass sie über traditionelle Vesikelknospen aus dem Golgi auftreten, wie es bei vielen anderen Viren der Fall ist6. Die zelluläre Fluoreszenzmikroskopie-Technik, eine tragende Säule fast aller Aspekte der biologischen Forschung, hat sich in ihrer Breite und ihrem Anwendungsbereich notwendigerweise weiterentwickelt, von der hochauflösenden Bildgebung ganzer Tiere bis hin zur automatisierten multiparametrischen High-Content-Bildgebung für das Arzneimittelscreening. Hier wird eine automatisierte konfokale High-Content-Mikroskopie zur Untersuchung des SARS-CoV-2-Zelleintritts unter Verwendung fluoreszierender QDs angewendet, die mit dem viralen Spike-Protein konjugiert sind.
Die High-Content-Analyse von Bildern, die von biologischen Bildgebungsplattformen erzeugt werden, ermöglicht eine bessere Extraktion wertvoller biologischer Erkenntnisse als einzelne Parameter wie die Intensität des gesamten Bohrlochs, die man mit einem multimodalen Plattenleser erhalten würde7. Durch die Trennung der Objekte in einem Sichtfeld mithilfe automatisierter Segmentierungsalgorithmen kann jedes Objekt oder eine Population von Objekten auf Parameter wie Intensität, Fläche und Textur in jedem verfügbaren Fluoreszenzkanal analysiert werden8. Die Kombination vieler Messungen in multivariaten Datensätzen ist ein nützlicher Ansatz für die phänotypische Profilerstellung. Wenn der gewünschte Phänotyp bekannt ist, wie z.B. die QD-Internalisierung in Form von Puncta, kann man die mit Puncta verbundenen Messungen wie Größe, Anzahl und Intensität verwenden, um die Wirksamkeit einer Behandlung zu beurteilen.
Cloud-basierte High-Content-Imaging-Analysesoftware kann eine Vielzahl von Instrumentendatenausgaben aufnehmen, einschließlich der High-Content-Imaging-Plattform. Durch die Verwendung eines Cloud-basierten Servers für die Bildspeicherung und Online-Analyse kann der Benutzer seine Daten entweder vom Bildgebungsgerät oder vom Netzlaufwerk, auf dem die Daten gespeichert sind, hochladen. Der Analyseteil des Protokolls wird innerhalb der Cloud-Softwareumgebung durchgeführt, und die Daten können in einer Vielzahl von Dateiformaten für die nachgelagerte Datenvisualisierung exportiert werden.
Das SARS-CoV-2-Virus besteht aus Nichtstruktur- und Strukturproteinen, die bei seiner Montage und Replikation helfen. SARS-CoV-2-Spike hat zwei Domänen namens S1 und S2, wobei S1 die Rezeptorbindungsdomäne enthält, die für hACE2-Wechselwirkungen an der Plasmamembran verantwortlich ist9. Es wurde auch festgestellt, dass Spike mit anderen Molekülen an der Plasmamembran interagiert, die zusätzlich zu hACE210,11 als Co-Rezeptoren fungieren können. Während der gesamten Spike-Proteinsequenz und insbesondere an der S1/S2-Grenzfläche gibt es Protease-Spaltungsstellen, die eine Fusion an der Membran nach der Transmembran-Serin-Protease 2 (TMPRSS2)12 ermöglichen. Verschiedene rekombinante SARS-CoV-2-Spike-Proteine wurden aus einzelnen Rezeptorbindungsdomänen hergestellt, zu S1, S2, S1 mit S2 und ganzen Spike-Trimern von mehreren kommerziellen Anbietern für den Einsatz in Forschungsaktivitäten13.
In dieser Arbeit wurde die Oberfläche von QDs mit rekombinanten Spike-Trimern funktionalisiert, die ein Histidin-Tag (QD-Spike) enthalten. Die von der Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section hergestellten QDs enthalten einen Cadmiumselenidkern und eine Zinksulfidschale14,15. Das Zink auf der QD-Oberfläche koordiniert die Histidinreste innerhalb des rekombinanten Proteins, um eine funktionalisierte QD zu bilden, die in Form und Funktion einem SARS-CoV-2-Viruspartikel ähnelt. Die Erzeugung der Nanopartikel und der Proteinkonjugation wurde zuvor unter Verwendung der QD-konjugierten Rezeptorbindungsdomäne beschrieben15. Diese Methode beschreibt die Zellkulturpräparate, die QD-Behandlung, die Bilderfassung und das Datenanalyseprotokoll, das einen Forscher bei der Untersuchung der SARS-CoV-2-Spike-Aktivität im physiologischen Kontext einer menschlichen Zelle leiten kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

Die Entwicklung neuer Technologien für die zelluläre Fluoreszenzmikroskopie hat Hochdurchsatz-Screening-Methoden für die Wirkstoffforschung ermöglicht. Quantenpunkte sind fluoreszierende Nanopartikel mit hervorragenden photophysikalischen Eigenschaften, die von heller und stabiler Photolumineszenz sowie schmalen Emissionsbändern durchdrungen sind. Quantenpunkte haben eine kugelförmige Form und können mit der richtigen Modifikation der Oberflächenchemie verwendet werden, um Biomoleküle für zelluläre Anwendungen zu konjugieren. Diese optischen Eigenschaften, kombiniert mit der Fähigkeit, sie mit Biomolekülen zu funktionalisieren, machen sie zu einem ausgezeichneten Werkzeug für die Untersuchung von Rezeptor-Ligand-Interaktionen und zellulärem Transport. Hier stellen wir eine Methode vor, die Quantenpunkte verwendet, um die Bindung und Endozytose des SARS-CoV-2-Spike-Proteins zu verfolgen. Dieses Protokoll kann als Leitfaden für Experimentatoren verwendet werden, die Quantenpunkte verwenden möchten, um Protein-Protein-Interaktionen und -Handel im Kontext der zellulären Physiologie zu untersuchen.

Nach der Behandlung werden die QDs internalisiert, da das Nanopartikel an ACE2 auf der Plasmamembran bindet und eine Endozytose induziert. Mit einer ACE2-GFP-exprimierenden Zelllinie kann die Translokation von QDs und ACE2 mittels Fluoreszenzmikroskopie visualisiert werden. Nach der Internalisierung zeigen die beiden QD- und ACE2-Signale eine starke Kolokalisation. Aus diesen Bildern kann eine Bildsegmentierung und anschließende Analyse durchgeführt werden, um relevante Parameter wie die Spotanzahl zu extrahieren (Abbi...

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High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

In diesem Protokoll ermöglichen Quantenpunkte, die an rekombinante SARS-CoV-2-Spike konjugiert sind, zellbasierte Assays, die Spike-Bindung an hACE2 an der Plasmamembran und die anschließende Endozytose der gebundenen Proteine in das Zytoplasma zu überwachen.

Konfokale Hochdurchsatz-Bildgebung von quantenpunktkonjugierten SARS-CoV-2-Spike-Trimern zur Verfolgung von Bindung und Endozytose in HEK293T-Zellen

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Wir haben eine Plattformtechnologie für SARS COVID 2 etabliert, die auf andere Viren mit Spike-vermittelter Zellerkennung und -eintritt als erster Schritt bei zellulären Virusinfektionen anwendbar ist. Quantenpunkte sind hell, stabil und ihre Oberfläche kann für eine Vielzahl von zellulären Anwendungen funktionalisiert werden. Mit dieser Methode können wir die Spike-Internalisierung in Zellen visualisieren und messen.Zur Vorbereitung von 0,1% BSA. Fügen Sie 130 Mikroliter 7,5% BSA zu 10 Millilitern Bildgebungsmedien im Mix hinzu. Für eine 6,1 bis drei serielle Verdünnung und dreifache fügen Sie 14,26 Mikroliter QD Spike zu 285,74 Mikrolitern der 0,1% BSA hinzu, um die höchste Konzentration von 20 Nanomol zu erhalten.Dann fügen Sie 100 Mikroliter von 20 Nanomol oder QD Spike zu 200 Mikrolitern von 0,1% BSA hinzu, um die zweite Wahnvorstellung von 6,67 Nanomol QD Spike zu machen. Entfernen Sie alle verbrauchten Medien aus jedem Vertiefungsfeld mit einem Mehrkanal-Aspirator, waschen Sie einmal mit einer Mehrkanalpipette mit 100 Mikrolitern Bildgebungsmedien pro Vertiefung und saugen Sie dann 100 Mikroliter der Bildgebungsmedien ab. Fügen Sie 50 Mikroliter QD Spike-Lösung pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte drei Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Bereiten Sie mit Schutzausrüstung 4% PFA- und 0,1% PSA-Bildgebungsmedien in einer sterilen Biosicherheitskabine vor, saugen Sie 50 Mikroliter QD Spike aus jedem Bohrloch und fügen Sie 100 Mikroliter 4% PFA pro Bohrung mit einer automatisierten Mehrkanalpipette hinzu, um eine Trocknung der Bohrlöcher zu vermeiden. Inkubieren Sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur, waschen Sie dann dreimal mit PBS, bereiten Sie den tiefroten Kernfarbstoff vor, indem Sie die Fünf-Millimeter-Stammlösung bei einem bis 1000 in PBS verdünnen, saugen Sie das PBS ab und fügen Sie 50 Mikroliter verdünnten Kernfarbstoff pro Vertiefung wieder hinzu. 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und dann dreimal mit PBS waschen, die Platte abbilden oder mit einem Plattenversiegeler für die spätere Bildgebung versiegeln.Lagern Sie den Teller bei vier Grad Celsius. Starten Sie die Software für die Imaging-Plattform. Nachdem Sie sich bei der Bildgebungsplattform angemeldet haben, erstellen Sie ein neues Erfassungsprotokoll, indem Sie den Plattentyp als 96-wandige transparente Bodenabbildungsplatte auswählen, den optischen Modus als 40-faches Eintauchen in das Wasser auswählen, den optischen Modus als 40-faches Eintauchen in Wasser auswählen.Wählen Sie den Modus für digitale Gesichtskontraste wie hohen Kontrast, um gut definierte Zellkörper zu erzeugen. Machen Sie einen Schnappschuss, um zu bestätigen, dass diese Überschrift im Bildfenster angezeigt wird, und wählen Sie den passenden C-Kanal für die Verwendung mit der ACE2-GFP-Zelllinie, um den ACE2-Verkehr innerhalb der Zelle zu visualisieren. Um einen benutzerdefinierten QD-Kanal zu erstellen, wählen Sie das Dreiecks-Dropdown-Menü und wählen Sie die Anregung im 405-Nanometer-Bereich in der Emission im 608-Nanometer-Bereich, wählen Sie einen Brunnen mit einem robusten zytoplasmatischen QD-Signal, um die Belichtungszeit, die Laserleistung und die Z-Höhenposition einzustellen.Überprüfen Sie, ob die Standardhöhe ein Bild der Zellen in der gewünschten Fokusebene erzeugt. Die Z-Position ist für die Endozytosepuncta niedriger als die Z-Position für die Plasmamembran. Wählen Sie eine Belichtungszeit, typischerweise zwischen 100 und 300 Millisekunden, die ein helles Bild mit Graustufen erzeugt, die mindestens dreimal so hoch sind wie das Hintergrundsignal.Bei 20 Nanomol sollten die Graustufen etwa 6.000 Atomeinheiten mit 200 Millisekunden Belichtungszeit und 80% Laserleistung betragen. Überprüfen Sie die Graustufen, indem Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild klicken, das mit der Schnappschussfunktion in jedem Kanal erzeugt wird, und die Show-Intensität auswählen, dann mit der linken Maustaste auf das Objekt von Interesse oder den Hintergrund klicken, um den Graustufen für dieses Pixel anzuzeigen, und passen Sie die Laserleistung an, um die Intensität der Objekte von Interesse zu optimieren. Speichern Sie das Erfassungsprotokoll, wechseln Sie zum Ausführen des Experiments, geben Sie den Plattennamen ein, führen Sie das Experiment aus.Die Translokation von QDs und ACE2 wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie und einer ACE2-GFP-exprimierenden Zelllinie visualisiert. Die Bildsegmentierung und die anschließende Analyse wurden durchgeführt, um relevante Parameter wie die Spotanzahl zu extrahieren. Zuerst wurden Kerne aus dem Kernmarkerkanal segmentiert, um eine ROI-Population zu erzeugen.Dann ein ROI-Bereich, der die Zelle mit Segmentierung unter Verwendung des ACE2-GFP-Kanals umreißt. Schließlich wurden QD 608 Spike-Spots aus der Zell-ROI-Region segmentiert, internalisierte QD- und ACE2-Signale zeigten eine starke Co-Lokalisierung. Ein Konzentrationsantwortexperiment mit sechs verschiedenen Konzentrationen von QD Spike wurde in HEK 293T-Zellen durchgeführt.Bei der Bestimmung der optischen Konzentrationen von QD kann QDS so niedrig wie 2,22 Nanomol verwendet werden, es wird jedoch empfohlen, Konzentrationen von 10 Nanomol oder höher zu verwenden, um eine robuste Reaktion zu gewährleisten. Während der Konjugation zur QD-Proteinaggregation kann es zu einer Aggregation kommen. Aggregate wurden in der QD-Lösung als hell verklumpte Ausfällungen und HEK 293T-Zellen entdeckt, QDs wurden mit neutralisierten Antikörpern ab 30 Mikrogramm pro Mikroliter vor der Zugabe zu Zellen inkubiert, diese Antikörper blockierten die Bindungsinternalisierung und verursachten eine Verringerung der Spotanzahl im Vergleich zu Zellen, die nur mit QD behandelt wurden.Dieser Aufsatz kann auch für das Hochdurchsatz-Screening verwendet werden, um die Bewertung neutralisierender Antikörper zu leiten, um antivirale Mittel zum Viruseintritt zu identifizieren und an die Untersuchung neu auftretender Varianten angepasst zu werden.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Forschung

Biologie

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Ein hoher Durchsatz MHC II-Bindungsassay für die quantitative Analyse von Peptid-Epitope

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Anwendungen von pHluorin für Quantitative, Kinetic und Hochdurchsatz-Analyse von Endozytose in Bäckerhefe

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Nutzung von Live Imaging Track Kerne während Myoblast Differenzierung und Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

High-Throughput Live Imaging von Mikrokolonien zur Messung der Heterogenität in Wachstum und Genexpression

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Zweistufige digitale Transkriptions-Tröpfchenprotokolle für den Nachweis und die Quantifizierung von SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Swabbing the Urban Environment - Eine Pipeline zur Probenahme und zum Nachweis von SARS-CoV-2 aus Umweltreservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Eine Hochdurchsatzplattform für Kultur und 3D-Bildgebung von Organoiden

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

Charakterisierung von Zinktransportern in Säugetieren mit einem In-vitro-Zinktransportassay

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...