Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר הפנימית של המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום, NIH. מעבדת המחקר הימית סיפקה מימון באמצעות המכון הפנימי שלה למדעי הננו- מדעים. הכנת ריאגנט נתמכה באמצעות קרן הבסיס NRL COVID-19.

קו התא HEK293T המשמש במחקר זה הוא קו תאים מונצח. במחקר זה לא נעשה שימוש בנבדקים אנושיים או בעלי חיים.
1. פולחן תאים וזריעה
<ol><li>בתוך ארון בטיחות ביולוגית סטרילי, לבוש בציוד מגן אישי (כולל כפפות מעבדה, חלוק מעבדה ומשקפי בטיחות), הכן מדיום תרבית תאים על ידי השלמת מדיום הנשר ...

<ol>
	<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Lysosomes+in+Live+Cells+with+LysoTracker.">Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments.">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li><li>Barroso, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots+in+cell+biology.">Quantum dots in cell biology.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).</li><li>Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACE2:+Evidence+of+role+as+entry+receptor+for+SARS-CoV-2+and+implications+in+comorbidities.">ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities.</a> eLife. 9, 61390 (2020).</li><li>Shang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+mechanisms+of+SARS-CoV-2.">Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).</li><li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Coronaviruses+use+lysosomes+for+egress+instead+of+the+biosynthetic+secretory+pathway.">&#946;-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway.</a> Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).</li><li>Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+guidelines+for+image-based+high+content+screening,+high+content+analysis+and+high+content+imaging.">Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+profiling+for+drug+discovery:+due+for+a+machine-learning+upgrade.">Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).</li><li>Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+properties+of+SARS-CoV-2+spike+protein:+potential+antivirus+drug+development+for+COVID-19.">Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+spike+protein+interacts+with+multiple+innate+immune+receptors.">SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors.</a> bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+assists+SARS-CoV-2+in+cell+entry+and+can+be+targeted+by+approved+drugs+in+vitro.">Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro.</a> Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+Is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+conformational+states+of+SARS-CoV-2+spike+protein.">Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein.</a> Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).</li><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+cellular+toxicity+for+cadmium-containing+quantum+dots.">Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots.</a> Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).</li><li>Gorshkov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-conjugated+SARS-CoV-2+spike+pseudo-virions+enable+tracking+of+angiotensin+Converting+enzyme+2+binding+and+endocytosis.">Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis.</a> ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).</li><li>Narayanan, S. S., Pal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+CdS+quantum+dots:+Host+of+biomolecular+ligands.">Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+together+with+virus+receptor+ACE2.">Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2.</a> Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).</li><li>Hildebrandt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer+with+semiconductor+quantum+dot+bioconjugates:+A+versatile+platform+for+biosensing,+energy+harvesting,+and+other+developing+applications.">Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications.</a> Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).</li></ol>

השיטה המתוארת במאמר זה מספקת את השלבים הדרושים להדמיית QDs פונקציונליים בתאים אנושיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בתפוקה גבוהה. שיטה זו מתאימה ביותר לתאים שבהם אנדוציטוזיס היא המסלול העיקרי של כניסה ויראלית ולא הפעילות של TMPRSS2 והיתוך ממברנה, כפי שהוא מאפשר את המחקר של SARS-CoV-2 ספייק ו hACE2 א...

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מאפשרת לחוקרים להציץ לתוך הפעולות הפנימיות של התא באמצעות צבעים מיוחדים1, חלבונים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית2, וננו-חלקיקים פלואורסצנטיים בצורה של נקודות קוונטיות (QDs)3. לתסמונת הנשימה החריפה החמורה קורונה של 2019 (SARS-CoV-2) המגפה העולמית, חוקרים השתמשו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי להבין כיצד הנגיף אינטראקציה עם התא הן בקרום הפלזמה והן בציטופלסמה. לדוגמה, חוקרים הצליחו לקבל תובנות על הכריכה של חלבון ספייק SARS-CoV-2 על פני השטח של הנגיף לאנזים אנושיים המרת אנגיוטנסין 2 (hACE2) על פני השטח של תאים אנושיים, הפנמה לאחר מכן באמצעות היתוך בקרום הפלזמה, אנדוציטוזיס של קומפלקס חלבון Spike:hACE2 4,5. תובנות נהדרות הושגו גם ליציאה SARS-CoV-2 מהתאים דרך הליזוזום באמצעות הדמיית פלואורסצנטיות תאית, תכונה ייחודית של נגיפי קורונה שנחשבו בעבר להתרחש באמצעות ניצני שלפוחית מסורתיים מהגולגי, כפי שהוא עם וירוסים רבים אחרים6. טכניקת המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית התאית, המהווה עמוד התווך של כמעט כל ההיבטים של המחקר הביולוגי, התקדמה בהכרח ברוחב ובהיקף היישומים שלה, החל מהדמיית סופר-רזולוציה של בעלי חיים שלמים וכלה בהדמיה רב-פרמטרית אוטומטית בעלת תוכן גבוה להקרנת סמים. כאן, מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית בעלת תוכן גבוה מוחלת על המחקר של הזנת תאים SARS-CoV-2 באמצעות QDs פלורסנט מצומדים לחלבון ספייק הנגיפי.
ניתוח תוכן גבוה של תמונות שנוצרו על ידי פלטפורמות הדמיה ביולוגית מאפשר מיצוי גדול יותר של תובנות ביולוגיות יקרות ערך מאשר פרמטרים בודדים כגון עוצמה מלאה, כי ניתן להשיג באמצעות קורא לוחות רב מודאלי7. על-ידי הפרדת האובייקטים בשדה ראייה באמצעות אלגוריתמי פילוח אוטומטיים, ניתן לנתח כל אובייקט או אוכלוסייה של אובייקטים לקבלת פרמטרים כגון עוצמה, שטח ומרקם בכל ערוץ פלואורסצנטי זמין8. שילוב מדידות רבות לתוך ערכות נתונים מרובות משתנים היא גישה שימושית עבור פרופיל פנוטיפי. כאשר הפנוטיפ הרצוי ידוע, כגון הפנמת QD בצורה של puncta, ניתן להשתמש במדידות הקשורות puncta כגון גודל, מספר, ועוצמה כדי להעריך את היעילות של טיפול.
תוכנה לניתוח הדמיית תוכן גבוהה מבוססת ענן יכולה להכיל מגוון גדול של יציאות נתונים של מכשירים, כולל פלטפורמת הדמיית התוכן הגבוהה. באמצעות שרת מבוסס ענן לאחסון תמונות וניתוח מקוון, המשתמש יכול להעלות את הנתונים שלו ממכשיר ההדמיה או מכונן הרשת שבו הנתונים מאוחסנים. חלק הניתוח של הפרוטוקול מתבצע בתוך סביבת תוכנת הענן, וניתן לייצא נתונים במגוון תבניות קובץ להדמיית נתונים במורד הזרם.
נגיף SARS-CoV-2 מורכב מחלבונים לא מבניים ומבניים המסייעים בהרכבו ובשכפולו. לספייק SARS-CoV-2 יש שני תחומים הנקראים S1 ו- S2, כאשר S1 מכיל את תחום איגוד הקולטן האחראי לאינטראקציות hACE2 בקרום הפלזמה9. ספייק נמצא גם לקיים אינטראקציה עם מולקולות אחרות בקרום הפלזמה שעשויות לשמש כקולטנים משותפים בנוסף hACE210,11. לאורך רצף חלבון ספייק ובמיוחד בממשק S1/S2, ישנם אתרי מחשוף פרוטאז המאפשרים היתוך בממברנה לאחר פרוטאז סרין transmembrane 2 (TMPRSS2)12. חלבונים שונים של ספייק SARS-CoV-2 רקומביננטיים הופקו מתחומים מחייבים קולטנים בודדים, ל- S1, S2, S1 עם S2, וגוזמי ספייק שלמים מספקים מסחריים מרובים לשימוש בפעילויות מחקר13.
בעבודה זו, פני השטח של QDs היה פונקציונלי עם גוזמי ספייק רקומביננטי המכילים תג היסטידין (QD-Spike). ה-QDs המיוצרים על ידי המעבדה הימית לחקר ננו-חומרים אופטיים מכילים ליבת קדמיום סלניד ומעטפת אבץ גופרתית14,15. האבץ על פני השטח של QD מתאם את שאריות ההיסטידין בתוך החלבון הרומביננטי כדי ליצור QD פונקציונלי הדומה לחלקיק נגיפי SARS-CoV-2 בצורה ובתפקוד. הדור של חלקיקים והטיית חלבון תואר בעבר באמצעות QD-מצומד קולטן מחייב domain15. שיטה זו מתארת את ההכנות לתרבות התאים, טיפול QD, רכישת תמונה ופרוטוקול ניתוח נתונים שיכול להנחות חוקר בחקר פעילות ספייק SARS-CoV-2 בהקשר הפיזיולוגי של תא אנושי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

פיתוח טכנולוגיות חדשות למיקרוסקופיה פלואורסצנטית תאית הקל על שיטות סינון בתפוקה גבוהה לגילוי תרופות. נקודות קוונטיות הן חלקיקים פלואורסצנטיים עם תכונות פוטופיזיות מעולות חדורות פוטולומינציה בהירה ויציבה, כמו גם רצועות פליטה צרות. נקודות קוונטיות הן כדוריות בצורתן, ועם השינוי הנכון של כימיית פני השטח, ניתן להשתמש בהן כדי להטות ביומולקולות עבור יישומים תאיים. מאפיינים אופטיים אלה, בשילוב עם היכולת לתפקד אותם עם ביומולקולות, הופכים אותם לכלי מצוין לחקירת אינטראקציות קולטן-ליגנד וסחר תאי. כאן, אנו מציגים שיטה המשתמשת בנקודות קוונטיות כדי לעקוב אחר הכריכה והאנדוציטוזיס של חלבון ספייק SARS-CoV-2. פרוטוקול זה יכול לשמש כמדריך לניסויים המעוניינים לנצל נקודות קוונטיות כדי לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון וסחר בהקשר של פיזיולוגיה תאית.

לאחר הטיפול, QDs יופנמו כמו חלקיקים ייקשרו ACE2 על קרום הפלזמה ולגרום אנדוציטוזיס. באמצעות קו תא מבטא ACE2-GFP, טרנסלוקציה של QDs ו- ACE2 ניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר ההפנמה, שני אותות QD ו- ACE2 מראים colocalization חזק. מתמונות אלה ניתן לבצע פילוח תמונות וניתוחים הבאים כדי לחלץ פרמטרים ר?...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

בפרוטוקול זה, נקודות קוונטיות המצומדות לספייק SARS-CoV-2 רקומביננטי מאפשרות בדיקות מבוססות תאים כדי לפקח על קשירת ספייק ל- hACE2 בקרום הפלזמה ואנדוציטוזיס לאחר מכן של החלבונים הכרוכים לתוך הציטופלסמה.

הדמיה קונפוקלית בתפוקה גבוהה של מטרימי ספייק SARS-CoV-2 מצומדים קוונטיים למעקב אחר כריכה ואנדוציטוזיס בתאי HEK293T

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

הקמנו טכנולוגיית פלטפורמה עבור SARS COVID 2 שיכולה להיות ישימה לווירוסים אחרים עם זיהוי תאים בתיווך ספייק וכניסה כצעד הראשון בזיהום ויראלי תאי. נקודות קוונטיות בהירות, יציבות, וניתן לתפקד על פני השטח שלהן עבור מגוון יישומים תאיים. בשיטה זו, אנו יכולים לדמיין ולמדוד הפנמה של ספייק לתאים.כדי להכין 0.1%BSA. הוסף 130 מיקרוליטרים של 7.5%BSA ל-10 מיליליטר של מדיית הדמיה בתערובת. עבור דילול סדרתי של 6.1 עד 3 ומשולש להוסיף 14.26 מיקרוליטרים של QD ספייק ל 285.74 מיקרוליטרים של 0.1%BSA כדי להפוך את הריכוז הגבוה ביותר של 20 nanomole.לאחר מכן להוסיף 100 מיקרוליטרים של 20 nanomole או QD ספייק ל 200 microliters של 0.1% BSA כדי להפוך את האשליה השנייה של 6.67 ננומול QD ספייק. הסר את כל המדיה המבוזבזת מכל באר עם שאיפה רב ערוצית, שטוף פעם אחת עם פיפטה רב ערוצית עם 100 מיקרוליטרים של מדיית הדמיה לבאר, ואז שאף 100 מיקרוליטרים של מדיית ההדמיה. מוסיפים בחזרה 50 מיקרוליטרים של פתרון QD Spike לבאר ודגור על הצלחת במשך שלוש שעות בחממה לחה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.לבושים בציוד מגן, הכינו 4% PFA ו-0.1%PSA הדמיה בתוך ארון בטיחות ביולוגי סטרילי, שאפו 50 מיקרוליטרים של QD Spike מכל באר והוסיפו 100 מיקרוליטרים של 4%PFA לבאר עם פיפטה רב ערוצית אוטומטית כדי להימנע מייבוש הבארות. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם PBS, להכין את הצבע הגרעיני האדום העמוק על ידי דילול פתרון מלאי חמישה מילימטר באחד עד 1000 ב PBS, לשאוף PBS ולהוסיף בחזרה 50 מיקרוליטרים של צבע גרעיני מדולל לכל באר. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואז לשטוף שלוש פעמים עם PBS, לדחוף את הצלחת או לאטום אותה באמצעות אטם צלחת להדמיה מאוחר יותר.יש לאחסן את הצלחת ב-4 מעלות צלזיוס. הפעל את התוכנה עבור פלטפורמת ההדמיה. לאחר הכניסה לפלטפורמת ההדמיה צור פרוטוקול רכישה חדש על ידי בחירת סוג צלחת כלוח הדמיה תחתון שקוף 96 קיר, מצב אופטי נבחר הלך מוקד והגדלה כמו 40 פעמים טבילה במים, בחר binning כאחד.בחר את המצב עבור ניגודיות פנים דיגיטלית כגון ניגודיות גבוהה כדי לייצר גופי תא מוגדרים היטב. צלם תמונה כדי לאשר שכותרת זו מתאימה כפי שניתן לראות בחלון התמונה, בחר בערוץ C המתאים לשימוש עם קו התא ACE2-GFP כדי להציג באופן חזותי סחר ב- ACE2 בתוך התא. ליצירת ערוץ QD מותאם אישית, בחרו בתפריט הנפתח של המשולש ובחרו את העירור בטווח של 405 ננומטר בפליטה בטווח של 608 ננומטר, בחרו באר עם אות QD ציטופלסמי חזק כדי להגדיר את זמן החשיפה, עוצמת הלייזר ומיקום הגובה של Z.בדוק אם גובה ברירת המחדל מפיק תמונה של התאים במישור המוקד הרצוי. מיקום Z יהיה נמוך יותר עבור puncta אנדוציקטוז מאשר מיקום Z עבור קרום הפלזמה. בחר זמן חשיפה, בדרך כלל בין 100 ל- 300 אלפיות השניה, המפיק תמונה בהירה עם רמות אפורות, הגדולה לפחות פי שלושה מאות הרקע.ב 20 ננומול רמות האפור צריך להיות כ 6, 000 יחידות אטומיות עם 200 אלפיות השנייה זמן חשיפה ו 80% כוח לייזר. בדוק את רמות האפור על ידי לחיצה ימנית על התמונה המיוצרת עם תכונת התמונה בכל ערוץ ובחירת עוצמת המופע, ולאחר מכן לחץ שמאלה על האובייקט של עניין או רקע כדי להציג את רמת האפור עבור פיקסל זה, להתאים את כוח הלייזר כדי לכוונן את עוצמת האובייקטים של עניין. שמור את פרוטוקול הרכישה, לעבור כדי להפעיל ניסוי ולהזין את שם הלוחית, להפעיל את הניסוי.טרנסלוקציה של QDs ו- ACE2 הומחשה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וקו תא מבטא ACE2-GFP. פילוח תמונה וניתוח שלאחר מכן בוצע כדי לחלץ פרמטרים רלוונטיים כגון ספירת ספוט. ראשית, גרעינים היו מקוטעים מערוץ הסמן הגרעיני כדי ליצור אוכלוסיית החזר על ההשקעה.לאחר מכן, אזור החזר השקעה המתאר את התא עם פילוח באמצעות ערוץ ACE2-GFP. לבסוף, כתמי ספייק QD 608 היו מפולחים מאזור החזר על ההשקעה בתא, אותות QD ו- ACE2 מופנמים הראו לוקליזציה משותפת חזקה. ניסוי תגובת ריכוז עם שישה ריכוזים שונים של QD ספייק בוצע בתאי HEK 293T.קביעת ריכוזים אופטיים של QD, QDS יכול לשמש נמוך כמו 2.22 nanomole, עם זאת, מומלץ להשתמש בריכוזים של 10 nanomole ומעלה כדי להבטיח תגובה חזקה. במהלך ההטיה לצבירה של חלבון QD עלולה להתרחש. אגרגטים נצפו בתמיסת QD כמשקעים מגושמים בהירים ותאי HEK 293T, QDs דוגר עם נוגדנים מנוטרלים החל מ 30 מיקרוגרם למיקרוליטר לפני תוספת לתאים, נוגדנים אלה חסמו הפנמה מחייבת וגרמו לירידה בספירת הספוט בהשוואה לתאים שטופלו ב- QD בלבד.מאמר זה יכול לשמש גם להקרנה בתפוקה גבוהה, הערכת עופרת של נטרול נוגדנים כדי לזהות אנטי-ויראליים של משחק מילים לכניסה ויראלית בלוק ולהיות מותאם ללמוד גרסאות חדשות המתעוררות.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

ניצול הדמיה בשידור חי על המסלול גרעינים במהלך התמיינות Myoblast, פיוז'ן

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

הדמיה חיה בעלת תפוקה גבוהה של מיקרוקולוניות למדידת הטרוגניות בצמיחה ובביטוי גנים

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

פרוטוקולי PCR דיגיטליים טיפתיים דו-שלביים של תמלול לאחור לזיהוי וכימות SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

סניקה של הסביבה העירונית - צינור לדגימה וזיהוי של SARS-CoV-2 ממאגרים סביבתיים

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

פלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה לתרבית והדמיה תלת-ממדית של אורגנואידים

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

אפיון מובילי אבץ של יונקים באמצעות בדיקת הובלת אבץ חוץ גופית

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...