Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

इस शोध को नेशनल सेंटर फॉर एडवांसिंग ट्रांसलेशनल साइंसेज, एनआईएच के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। नौसेना अनुसंधान प्रयोगशाला ने अपने आंतरिक नैनोसाइंस इंस्टीट्यूट के माध्यम से धन प्रदान किया। एनआरएल कोविड-19 बेस फंड के माध्यम से अभिकर्मक तैयारी का समर्थन किया गया था।

इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली HEK293T सेल लाइन एक अमर सेल लाइन है। इस अध्ययन में किसी भी मानव या पशु विषय का उपयोग नहीं किया गया था।
1. सेल culturing और सीडिंग
<ol><li>एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट के अं?...

<ol>
	<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Lysosomes+in+Live+Cells+with+LysoTracker.">Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments.">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li><li>Barroso, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots+in+cell+biology.">Quantum dots in cell biology.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).</li><li>Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACE2:+Evidence+of+role+as+entry+receptor+for+SARS-CoV-2+and+implications+in+comorbidities.">ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities.</a> eLife. 9, 61390 (2020).</li><li>Shang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+mechanisms+of+SARS-CoV-2.">Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).</li><li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Coronaviruses+use+lysosomes+for+egress+instead+of+the+biosynthetic+secretory+pathway.">&#946;-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway.</a> Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).</li><li>Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+guidelines+for+image-based+high+content+screening,+high+content+analysis+and+high+content+imaging.">Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+profiling+for+drug+discovery:+due+for+a+machine-learning+upgrade.">Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).</li><li>Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+properties+of+SARS-CoV-2+spike+protein:+potential+antivirus+drug+development+for+COVID-19.">Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+spike+protein+interacts+with+multiple+innate+immune+receptors.">SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors.</a> bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+assists+SARS-CoV-2+in+cell+entry+and+can+be+targeted+by+approved+drugs+in+vitro.">Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro.</a> Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+Is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+conformational+states+of+SARS-CoV-2+spike+protein.">Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein.</a> Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).</li><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+cellular+toxicity+for+cadmium-containing+quantum+dots.">Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots.</a> Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).</li><li>Gorshkov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-conjugated+SARS-CoV-2+spike+pseudo-virions+enable+tracking+of+angiotensin+Converting+enzyme+2+binding+and+endocytosis.">Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis.</a> ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).</li><li>Narayanan, S. S., Pal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+CdS+quantum+dots:+Host+of+biomolecular+ligands.">Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+together+with+virus+receptor+ACE2.">Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2.</a> Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).</li><li>Hildebrandt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer+with+semiconductor+quantum+dot+bioconjugates:+A+versatile+platform+for+biosensing,+energy+harvesting,+and+other+developing+applications.">Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications.</a> Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).</li></ol>

इस आलेख में वर्णित विधि उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मानव कोशिकाओं में कार्यात्मक क्यूडी इमेजिंग के लिए आवश्यक चरण प्रदान करती है। यह विधि उन कोशिकाओं के लिए सबसे उपयुक्त है जहा...

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी शोधकर्ताओं को विशेष रंगों 1, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन 2, और क्वांटम डॉट्स (क्यूडी) 3 के रूप में फ्लोरोसेंट नैनोकणों का उपयोग करके सेल के आंतरिक कामकाज में सहकर्मी बनाने में सक्षम बनाता है। 2019 (सार्स-कोव -2) वैश्विक महामारी के गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनोवायरस के लिए, शोधकर्ताओं ने यह समझने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को नियोजित किया है कि वायरस प्लाज्मा झिल्ली और साइटोप्लाज्म दोनों में कोशिका के साथ कैसे बातचीत करता है। उदाहरण के लिए, शोधकर्ताओं ने मानव कोशिकाओं की सतह पर मानव एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम 2 (एचएसीई 2) के लिए विषाणु की सतह पर सार्स-कोव -2 स्पाइक प्रोटीन के बंधन में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में सक्षम किया है, बाद में प्लाज्मा झिल्ली पर संलयन के माध्यम से आंतरिककरण, और स्पाइक के एंडोसाइटोसिस: एचएसीई 2 प्रोटीन कॉम्प्लेक्स 4,5। सेलुलर प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करके लाइसोसोम के माध्यम से कोशिकाओं से सार्स-कोव -2 के उत्सर्जन में भी महान अंतर्दृष्टि प्राप्त की गई है, कोरोनोवायरस की एक अनूठी विशेषता जो पहले गोल्गी से पारंपरिक पुटिका नवोदित के माध्यम से होने के लिए सोचा गया था, क्योंकि यह कई अन्य वायरस के साथ है। जैविक अनुसंधान के लगभग सभी पहलुओं का एक मुख्य आधार, सेलुलर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक ने आवश्यक रूप से दवा स्क्रीनिंग के लिए स्वचालित उच्च-सामग्री मल्टी-पैरामीट्रिक इमेजिंग के लिए पूरे जानवरों के सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग से अनुप्रयोगों की चौड़ाई और दायरे में उन्नत किया है। यहां, स्वचालित उच्च-सामग्री कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी को वायरल स्पाइक प्रोटीन के लिए संयुग्मित फ्लोरोसेंट क्यूडी का उपयोग करके सार्स-कोव -2 सेल प्रविष्टि के अध्ययन के लिए लागू किया जाता है।
जैविक इमेजिंग प्लेटफार्मों द्वारा उत्पन्न छवियों का उच्च-सामग्री विश्लेषण एकल मापदंडों जैसे कि पूरी तरह से तीव्रता की तुलना में मूल्यवान जैविक अंतर्दृष्टि के अधिक निष्कर्षण की अनुमति देता है, जो एक बहु-मोडल प्लेट रीडर 7 का उपयोग करके प्राप्त करेगा। स्वचालित विभाजन एल्गोरिदम का उपयोग करके दृश्य के क्षेत्र में वस्तुओं को अलग करके, प्रत्येक ऑब्जेक्ट या वस्तुओं की आबादी का विश्लेषण प्रत्येक उपलब्ध प्रतिदीप्ति चैनल 8 में तीव्रता, क्षेत्र और बनावट जैसे मापदंडों के लिए किया जा सकता है। Multivariate datasets में कई मापों का संयोजन फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है। जब वांछित फेनोटाइप ज्ञात होता है, जैसे कि पंक्टा के रूप में क्यूडी आंतरिककरण, तो कोई भी उपचार की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए आकार, संख्या और तीव्रता जैसे पंक्टा से संबंधित मापों का उपयोग कर सकता है।
क्लाउड-आधारित उच्च सामग्री इमेजिंग विश्लेषण सॉफ़्टवेयर उच्च सामग्री इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म सहित विभिन्न प्रकार के इंस्ट्रूमेंट डेटा आउटपुट को समायोजित कर सकता है। छवि भंडारण और ऑनलाइन विश्लेषण के लिए क्लाउड-आधारित सर्वर का उपयोग करके, उपयोगकर्ता अपने डेटा को या तो इमेजिंग इंस्ट्रूमेंट से या उस नेटवर्क ड्राइव से अपलोड करने में सक्षम है जहां डेटा संग्रहीत किया जाता है। प्रोटोकॉल का विश्लेषण भाग क्लाउड सॉफ़्टवेयर वातावरण के भीतर आयोजित किया जाता है, और डेटा को डाउनस्ट्रीम डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के लिए विभिन्न प्रकार के फ़ाइल प्रारूपों में निर्यात किया जा सकता है।
सार्स-कोव -2 वायरस गैर-संरचनात्मक और संरचनात्मक प्रोटीन से बना है जो इसकी असेंबली और प्रतिकृति में सहायता करता है। सार्स-कोव -2 स्पाइक में एस 1 और एस 2 नामक दो डोमेन हैं, जिसमें एस 1 में प्लाज्मा झिल्ली 9 पर एचएसीई 2 इंटरैक्शन के लिए जिम्मेदार रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन होता है। स्पाइक को प्लाज्मा झिल्ली पर अन्य अणुओं के साथ बातचीत करने के लिए भी पाया गया है जो एचएसीई 210,11 के अलावा सह-रिसेप्टर्स के रूप में कार्य कर सकते हैं। स्पाइक प्रोटीन अनुक्रम के दौरान और विशेष रूप से S1 / S2 इंटरफ़ेस पर, प्रोटीज क्लीवेज साइटें हैं जो ट्रांसमेम्ब्रेन सेरीन प्रोटीज 2 (TMPRSS2) 12 के बाद झिल्ली पर संलयन को सक्षम करती हैं। विभिन्न पुनः संयोजक सार्स-कोव -2 स्पाइक प्रोटीन का उत्पादन व्यक्तिगत रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन से किया गया है, एस 1, एस 2 के साथ एस 1, एस 2, और अनुसंधान गतिविधियों में उपयोग के लिए कई वाणिज्यिक विक्रेताओं से पूरे स्पाइक ट्रिमर।
इस काम में, क्यूडी की सतह को पुनः संयोजक स्पाइक ट्रिमर के साथ कार्यात्मक किया गया था जिसमें हिस्टिडीन टैग (क्यूडी-स्पाइक) होता है। नौसेना अनुसंधान प्रयोगशाला ऑप्टिकल नैनोमटेरियल्स अनुभाग द्वारा उत्पादित क्यूडी में एक कैडमियम सेलेनाइड कोर और एक जस्ता सल्फाइड शेल 14,15 शामिल हैं। क्यूडी सतह पर जस्ता पुनः संयोजक प्रोटीन के भीतर हिस्टिडीन अवशेषों का समन्वय करता है ताकि एक कार्यात्मक क्यूडी बनाया जा सके जो रूप और कार्य में सार्स-कोव -2 वायरल कण जैसा दिखता है। नैनोकणों और प्रोटीन संयुग्मन की पीढ़ी को पहले क्यूडी-संयुग्मित रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन 15 का उपयोग करके वर्णित किया गया था। यह विधि सेल संस्कृति की तैयारी, क्यूडी उपचार, छवि अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल का वर्णन करती है जो मानव सेल के शारीरिक संदर्भ में सार्स-कोव -2 स्पाइक गतिविधि का अध्ययन करने में एक शोधकर्ता का मार्गदर्शन कर सकती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

सेलुलर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए नई प्रौद्योगिकियों के विकास ने दवा की खोज के लिए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधियों की सुविधा प्रदान की है। क्वांटम डॉट्स उत्कृष्ट फोटोफिजिकल गुणों के साथ फ्लोरोसेंट नैनोकणों हैं जो उज्ज्वल और स्थिर फोटोल्यूमिनेसेंस के साथ-साथ संकीर्ण उत्सर्जन बैंड के साथ प्रभावित होते हैं। क्वांटम डॉट्स आकार में गोलाकार होते हैं, और सतह रसायन विज्ञान के उचित संशोधन के साथ, सेलुलर अनुप्रयोगों के लिए बायोमोलेक्यूल्स को संयुग्मित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। ये ऑप्टिकल गुण, बायोमोलेक्यूल्स के साथ उन्हें कार्यात्मक बनाने की क्षमता के साथ संयुक्त हैं, उन्हें रिसेप्टर-लिगैंड इंटरैक्शन और सेलुलर तस्करी की जांच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण बनाते हैं। यहां, हम एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो सार्स-कोव -2 स्पाइक प्रोटीन के बंधन और एंडोसाइटोसिस को ट्रैक करने के लिए क्वांटम डॉट्स का उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगात्मकवादियों के लिए एक गाइड के रूप में किया जा सकता है जो सेलुलर फिजियोलॉजी के संदर्भ में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और तस्करी का अध्ययन करने के लिए क्वांटम डॉट्स का उपयोग करना चाहते हैं।

उपचार पर, क्यूडी को आंतरिक रूप से बदल दिया जाएगा क्योंकि नैनोपार्टिकल प्लाज्मा झिल्ली पर एसीई 2 से बंधेगा और एंडोसाइटोसिस को प्रेरित करेगा। सेल लाइन को व्यक्त करने वाले एसीई 2-जीएफपी का उपयोग करके, प्रत...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

इस प्रोटोकॉल में, पुनः संयोजक सार्स-कोव-2 स्पाइक के लिए संयुग्मित क्वांटम डॉट्स सेल-आधारित assays को प्लाज्मा झिल्ली पर hACE2 के लिए स्पाइक बाइंडिंग और साइटोप्लाज्म में बाध्य प्रोटीन के बाद के एंडोसाइटोसिस की निगरानी करने में सक्षम बनाते हैं।

क्वांटम डॉट-संयुग्मित SARS-CoV-2 स्पाइक ट्रिमर्स के उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल इमेजिंग HEK293T कोशिकाओं में बाइंडिंग और एंडोसाइटोसिस को ट्रैक करने के लिए

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

हमने सार्स कोविड 2 के लिए एक प्लेटफ़ॉर्म तकनीक स्थापित की है जो स्पाइक मध्यस्थता सेल मान्यता और सेलुलर वायरल संक्रमण में पहले कदम के रूप में प्रवेश के साथ अन्य वायरस पर लागू हो सकती है। क्वांटम डॉट्स उज्ज्वल, स्थिर हैं, और उनकी सतह को विभिन्न प्रकार के सेलुलर अनुप्रयोगों के लिए कार्यात्मक बनाया जा सकता है। इस विधि का उपयोग करके, हम कोशिकाओं में स्पाइक आंतरिककरण की कल्पना और माप सकते हैं।0.1% BSA तैयार करने के लिए। मिश्रण में इमेजिंग मीडिया के 10 मिलीलीटर के लिए 7.5% बीएसए के 130 माइक्रोलीटर जोड़ें। 6.1 से तीन सीरियल कमजोर पड़ने और तीन प्रतियों के लिए 0.1% बीएसए के 285.74 माइक्रोलीटर में क्यूडी स्पाइक के 14.26 माइक्रोलीटर जोड़ें ताकि 20 नैनोमोल की उच्चतम एकाग्रता हो सके।फिर 6.67 नैनोमोल क्यूडी स्पाइक का दूसरा भ्रम बनाने के लिए 0.1% बीएसए के 200 माइक्रोलीटर में 20 नैनोमोल या क्यूडी स्पाइक के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। एक बहु-चैनल एस्पिरेटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से खर्च किए गए सभी मीडिया को हटा दें, एक बार मल्टी-चैनल पिपेट के साथ 100 माइक्रोलीटर इमेजिंग मीडिया के साथ धोएं, फिर इमेजिंग मीडिया के 100 माइक्रोलीटर को एस्पिरेट करें। प्रति अच्छी तरह से क्यूडी स्पाइक समाधान के 50 माइक्रोलीटर वापस जोड़ें और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में तीन घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।सुरक्षात्मक उपकरण पहने हुए, एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर 4% पीएफए और 0.1% पीएसए इमेजिंग मीडिया तैयार करें, प्रत्येक अच्छी तरह से क्यूडी स्पाइक के 50 माइक्रोलीटर को एस्पिरेट करें और कुओं को सुखाने से बचने के लिए एक स्वचालित मल्टीचैनल पिपेट के साथ प्रति अच्छी तरह से 4% पीएफए के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, फिर पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, पीबीएस में एक से 1000 पर पांच मिलीमीटर स्टॉक समाधान को पतला करके गहरे लाल परमाणु डाई तैयार करें, पीबीएस को एस्पिरेट करें और प्रति अच्छी तरह से पतला परमाणु डाई के 50 माइक्रोलीटर वापस जोड़ें। कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, फिर पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, प्लेट की छवि बनाएं या बाद में इमेजिंग के लिए प्लेट सीलर का उपयोग करके इसे सील करें।प्लेट को चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म के लिए सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें. इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म में लॉग इन करने के बाद 96 दीवार पारदर्शी नीचे इमेजिंग प्लेट के रूप में प्लेट प्रकार का चयन करके एक नया अधिग्रहण प्रोटोकॉल बनाएं, ऑप्टिकल मोड का चयन करें फोकल और आवर्धन 40 बार पानी के विसर्जन के रूप में चला गया है, एक के रूप में बिनिंग का चयन करें।अच्छी तरह से परिभाषित सेल निकायों का उत्पादन करने के लिए उच्च कंट्रास्ट जैसे डिजिटल फेस कॉन्ट्रास्ट के लिए मोड का चयन करें। यह पुष्टि करने के लिए एक स्नैपशॉट लें कि यह शीर्षक उपयुक्त है जैसा कि छवि विंडो में देखा गया है, सेल के भीतर ACE2 तस्करी की कल्पना करने के लिए ACE2-GFP सेल लाइन के साथ उपयोग के लिए फ़िट C चैनल का चयन करें. एक कस्टम क्यूडी चैनल बनाने के लिए, त्रिभुज ड्रॉपडाउन मेनू का चयन करें और 608 नैनोमीटर रेंज में उत्सर्जन में 405 नैनोमीटर रेंज में उत्तेजना का चयन करें, एक्सपोजर समय, लेजर पावर और जेड ऊंचाई की स्थिति निर्धारित करने के लिए एक मजबूत साइटोप्लाज्मिक क्यूडी सिग्नल के साथ एक अच्छी तरह से चुनें।जाँचें कि डिफ़ॉल्ट ऊँचाई वांछित फोकल प्लेन में कक्षों की एक छवि उत्पन्न करती है या नहीं. प्लाज्मा झिल्ली के लिए जेड स्थिति की तुलना में एंडोसाइटोज पंक्टा के लिए जेड स्थिति कम होगी। एक एक्सपोज़र समय चुनें, आमतौर पर 100 और 300 मिलीसेकंड के बीच जो ग्रे स्तरों के साथ एक उज्ज्वल छवि का उत्पादन करता है, जो पृष्ठभूमि सिग्नल की तुलना में कम से कम तीन गुना अधिक है।20 नैनोमोल पर ग्रे का स्तर लगभग 6, 000 परमाणु इकाइयों में 200 मिलीसेकंड एक्सपोजर समय और 80% लेजर शक्ति के साथ होना चाहिए। प्रत्येक चैनल में स्नैपशॉट सुविधा के साथ उत्पादित छवि पर राइट क्लिक करके और शो तीव्रता का चयन करके ग्रे स्तर की जांच करें, फिर उस पिक्सेल के लिए ग्रे स्तर को देखने के लिए ब्याज या पृष्ठभूमि की वस्तु पर बाएं क्लिक करें, ब्याज की वस्तुओं की तीव्रता को ठीक करने के लिए लेजर शक्ति को समायोजित करें। अधिग्रहण प्रोटोकॉल को सहेजें, प्रयोग चलाने के लिए स्विच करें और प्लेट नाम दर्ज करें, प्रयोग चलाएं।क्यूडी और एसीई 2 दोनों के स्थानांतरण को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और एक एसीई 2-जीएफपी व्यक्त सेल लाइन का उपयोग करके कल्पना की गई थी। स्पॉट काउंट जैसे प्रासंगिक मापदंडों को निकालने के लिए छवि विभाजन और बाद का विश्लेषण किया गया था। सबसे पहले, नाभिक को एक आरओआई आबादी बनाने के लिए परमाणु मार्कर चैनल से विभाजित किया गया था।फिर एक ROI क्षेत्र ACE2-GFP चैनल का उपयोग करके खंडित के साथ सेल को रेखांकित करता है। अंत में, क्यूडी 608 स्पाइक स्पॉट को सेल आरओआई क्षेत्र से विभाजित किया गया था, आंतरिक क्यूडी और एसीई 2 संकेतों ने मजबूत सह-स्थानीयकरण दिखाया। क्यूडी स्पाइक के छह अलग-अलग सांद्रता के साथ एक एकाग्रता प्रतिक्रिया प्रयोग एचईके 293 टी कोशिकाओं में किया गया था।क्यूडी की ऑप्टिकल सांद्रता का निर्धारण करते हुए, क्यूडीएस का उपयोग 2.22 नैनोमोल के रूप में कम किया जा सकता है, हालांकि, एक मजबूत प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के लिए 10 नैनोमोल या उच्चतर की सांद्रता का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। क्यूडी प्रोटीन एकत्रीकरण के लिए संयुग्मन के दौरान हो सकता है। समुच्चय को क्यूडी समाधान में उज्ज्वल clumped अवक्षेप और HEK 293T कोशिकाओं के रूप में देखा गया था, QDs को कोशिकाओं के अलावा 30 माइक्रोलीटर प्रति माइक्रोलीटर से शुरू होने वाले बेअसर एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था, इन एंटीबॉडी ने बाध्यकारी आंतरिककरण को अवरुद्ध कर दिया और केवल क्यूडी के साथ इलाज की गई कोशिकाओं की तुलना में स्पॉट गिनती में कमी का कारण बना।इस निबंध का उपयोग उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए भी किया जा सकता है, ब्लॉक वायरल प्रविष्टि के लिए यमक एंटीवायरल की पहचान करने के लिए एंटीबॉडी को बेअसर करने के लिए लीड मूल्यांकन और नए उभरते वेरिएंट का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

स्टोर संचालित जीवित कोशिकाओं में कैल्शियम प्रविष्टि प्रतिदीप्ति आधारित मापन संवर्धित सेल कैंसर से कंकाल की मांसपेशी फाइबर

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

पेप्टाइड epitopes के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक उच्च Throughput MHC द्वितीय बंधन परख

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

पोस्ट-transcriptionally विनियमित जीन का रासायनिक Modulators के लिए उच्च throughput स्क्रीनिंग

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

मात्रात्मक, काइनेटिक और उच्च throughput नवोदित खमीर में endocytosis के विश्लेषण के लिए pHluorin के आवेदन

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

मायोब्लास्ट विभेद और फ्यूजन के दौरान नाभिक को ट्रैक करने के लिए लाइव इमेजिंग का दोहन

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

विकास और जीन अभिव्यक्ति में विषमता को मापने के लिए माइक्रोकॉलोनियों की उच्च-थ्रूपुट लाइव इमेजिंग

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने और परिमाणीकरण के लिए दो-चरण रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन ड्रॉपलेट डिजिटल पीसीआर प्रोटोकॉल

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

शहरी पर्यावरण को स्वैबिंग - पर्यावरण जलाशयों से सार्स-सीओवी-2 के नमूने और पता लगाने के लिए एक पाइपलाइन

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

ऑर्गेनोइड्स की संस्कृति और 3 डी इमेजिंग के लिए एक उच्च-थ्रूपुट प्लेटफॉर्म

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

इन विट्रो जिंक ट्रांसपोर्ट परख का उपयोग करके स्तनधारी जस्ता ट्रांसपोर्टरों की विशेषता

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...