Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

Questa ricerca è stata supportata in parte dal programma di ricerca intramurale del National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Il Naval Research Laboratory ha fornito finanziamenti attraverso il suo Nanoscience Institute interno. La preparazione dei reagenti è stata supportata tramite il fondo base NRL COVID-19.

La linea cellulare HEK293T utilizzata in questo studio è una linea cellulare immortalata. In questo studio non sono stati utilizzati soggetti umani o animali.
1. Coltivazione e semina cellulare
<ol><li>All'interno di un armadio sterile per la biosicurezza, indossando dispositivi di protezione individuale (inclusi guanti da laboratorio, cappotto da laboratorio e occhiali di sicurezza), preparare il terreno di coltura cellulare integrando il Modified Eagle Medium (DMEM) di Du...

<ol>
	<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Lysosomes+in+Live+Cells+with+LysoTracker.">Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments.">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li><li>Barroso, M. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+properties+of+SARS-CoV-2+spike+protein:+potential+antivirus+drug+development+for+COVID-19.">Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+spike+protein+interacts+with+multiple+innate+immune+receptors.">SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors.</a> bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+assists+SARS-CoV-2+in+cell+entry+and+can+be+targeted+by+approved+drugs+in+vitro.">Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro.</a> Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+Is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+conformational+states+of+SARS-CoV-2+spike+protein.">Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein.</a> Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).</li><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+cellular+toxicity+for+cadmium-containing+quantum+dots.">Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots.</a> Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).</li><li>Gorshkov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-conjugated+SARS-CoV-2+spike+pseudo-virions+enable+tracking+of+angiotensin+Converting+enzyme+2+binding+and+endocytosis.">Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis.</a> ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).</li><li>Narayanan, S. S., Pal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+CdS+quantum+dots:+Host+of+biomolecular+ligands.">Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+together+with+virus+receptor+ACE2.">Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2.</a> Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).</li><li>Hildebrandt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer+with+semiconductor+quantum+dot+bioconjugates:+A+versatile+platform+for+biosensing,+energy+harvesting,+and+other+developing+applications.">Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications.</a> Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).</li></ol>

Il metodo descritto in questo articolo fornisce i passaggi necessari per l'imaging di QD funzionalizzati in cellule umane utilizzando la microscopia confocale ad alto rendimento. Questo metodo è più adatto per le cellule in cui l'endocitosi è la principale via di ingresso virale piuttosto che l'attività di TMPRSS2 e fusione di membrana, in quanto consente lo studio dell'endocitosi SARS-CoV-2 Spike e hACE2. A causa della natura del modello QD e del C-terminal His-tag sul trimero Spike disponibile in commercio, qualsia...

La microscopia a fluorescenza consente ai ricercatori di scrutare il funzionamento interno della cellula utilizzando coloranti specializzati1, proteine fluorescenti geneticamente codificate2 e nanoparticelle fluorescenti sotto forma di punti quantici (QD)3. Per la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus della pandemia globale del 2019 (SARS-CoV-2), i ricercatori hanno impiegato la microscopia a fluorescenza per capire come il virus interagisce con la cellula sia sulla membrana plasmatica che nel citoplasma. Ad esempio, i ricercatori sono stati in grado di ottenere informazioni sul legame della proteina Spike SARS-CoV-2 sulla superficie del virione all'enzima umano di conversione dell'angiotensina 2 (hACE2) sulla superficie delle cellule umane, sulla successiva internalizzazione tramite fusione alla membrana plasmatica e sull'endocitosi del complesso proteico Spike:hACE24,5. Sono state acquisite anche grandi intuizioni sull'uscita di SARS-CoV-2 dalle cellule attraverso il lisosoma utilizzando l'imaging a fluorescenza cellulare, una caratteristica unica dei coronavirus precedentemente ritenuta verificarsi tramite vescicole tradizionali in erba dal Golgi, come è con molti altri virus6. Un pilastro di quasi tutti gli aspetti della ricerca biologica, la tecnica di microscopia a fluorescenza cellulare è necessariamente avanzata nella sua ampiezza e portata di applicazioni dall'imaging a super-risoluzione di animali interi all'imaging multiparametrico automatizzato ad alto contenuto per lo screening dei farmaci. Qui, la microscopia confocale automatizzata ad alto contenuto viene applicata allo studio dell'ingresso delle cellule SARS-CoV-2 utilizzando QD fluorescenti coniugati alla proteina spike virale.
L'analisi ad alto contenuto delle immagini generate da piattaforme di imaging biologico consente una maggiore estrazione di preziose informazioni biologiche rispetto a singoli parametri come l'intensità del pozzo intero, che si otterrebbe utilizzando un lettore di lastre multimodale7. Separando gli oggetti in un campo visivo utilizzando algoritmi di segmentazione automatizzati, ogni oggetto o una popolazione di oggetti può essere analizzato per parametri quali intensità, area e trama in ciascun canale di fluorescenza disponibile8. La combinazione di molte misurazioni in set di dati multivariati è un approccio utile per la profilazione fenotipica. Quando il fenotipo desiderato è noto, come l'internalizzazione QD sotto forma di puncta, è possibile utilizzare le misurazioni relative al puncta come dimensioni, numero e intensità per valutare l'efficacia di un trattamento.
Il software di analisi di imaging ad alto contenuto basato su cloud può ospitare un'ampia varietà di output di dati strumentali, inclusa la piattaforma di imaging ad alto contenuto. Utilizzando un server basato su cloud per l'archiviazione delle immagini e l'analisi online, l'utente è in grado di caricare i propri dati dallo strumento di imaging o dall'unità di rete in cui sono archiviati i dati. La parte di analisi del protocollo viene condotta all'interno dell'ambiente software cloud e i dati possono essere esportati in una varietà di formati di file per la visualizzazione dei dati a valle.
Il virus SARS-CoV-2 è composto da proteine non strutturali e strutturali che aiutano nel suo assemblaggio e replicazione. Lo spike SARS-CoV-2 ha due domini chiamati S1 e S2, con S1 contenente il dominio di legame del recettore responsabile delle interazioni hACE2 sulla membrana plasmatica9. Spike è stato anche trovato per interagire con altre molecole sulla membrana plasmatica che possono agire come co-recettori in aggiunta a hACE210,11. In tutta la sequenza della proteina spike e in particolare all'interfaccia S1/S2, ci sono siti di scissione della proteasi che consentono la fusione sulla membrana dopo la serina proteasi 2 transmembrana (TMPRSS2)12. Varie proteine Spike RICOMBINANTI SARS-CoV-2 sono state prodotte da singoli domini di legame del recettore, a S1, S2, S1 con S2 e trimeri spike interi da più fornitori commerciali per l'uso in attività di ricerca13.
In questo lavoro, la superficie dei QD è stata funzionalizzata con trimeri spike ricombinanti che contengono un tag di istidina (QD-Spike). I QD prodotti dalla Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section contengono un nucleo di seleniuro di cadmio e un guscio di solfuro di zinco14,15. Lo zinco sulla superficie QD coordina i residui di istidina all'interno della proteina ricombinante per formare un QD funzionalizzato che assomiglia a una particella virale SARS-CoV-2 nella forma e nella funzione. La generazione delle nanoparticelle e della coniugazione proteica è stata precedentemente descritta utilizzando il dominio di legame del recettore coniugato QD15. Questo metodo descrive i preparati di coltura cellulare, il trattamento QD, l'acquisizione di immagini e il protocollo di analisi dei dati che possono guidare un ricercatore nello studio dell'attività di SARS-CoV-2 Spike nel contesto fisiologico di una cellula umana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

Lo sviluppo di nuove tecnologie per la microscopia a fluorescenza cellulare ha facilitato i metodi di screening ad alto rendimento per la scoperta di farmaci. I punti quantici sono nanoparticelle fluorescenti con eccellenti proprietà fotofisiche intrise di fotoluminescenza luminosa e stabile e bande di emissione strette. I punti quantici sono di forma sferica e, con la corretta modifica della chimica superficiale, possono essere utilizzati per coniugare biomolecole per applicazioni cellulari. Queste proprietà ottiche, unite alla capacità di funzionalizzarle con biomolecole, le rendono un ottimo strumento per studiare le interazioni recettore-ligando e il traffico cellulare. Qui, presentiamo un metodo che utilizza punti quantici per tracciare il legame e l'endocitosi della proteina spike SARS-CoV-2. Questo protocollo può essere utilizzato come guida per gli sperimentatori che cercano di utilizzare i punti quantici per studiare le interazioni proteina-proteina e il traffico nel contesto della fisiologia cellulare.

Dopo il trattamento, i QD saranno internalizzati poiché la nanoparticella si legherà ad ACE2 sulla membrana plasmatica e indurrà l'endocitosi. Utilizzando una linea cellulare che esprime ACE2-GFP, la traslocazione di QD e ACE2 può essere visualizzata utilizzando la microscopia a fluorescenza. Una volta internalizzati, i due segnali QD e ACE2 mostrano una forte colocalizzazione. Da queste immagini è possibile eseguire la segmentazione delle immagini e la successiva analisi per estrarre parametri rilevanti come il con...

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High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

In questo protocollo, i punti quantici coniugati al picco RICOMBINANTE SARS-CoV-2 consentono saggi basati su cellule per monitorare il legame dello spike a hACE2 sulla membrana plasmatica e la successiva endocitosi delle proteine legate nel citoplasma.

Imaging confocale ad alto rendimento di trimeri spike SARS-CoV-2 coniugati quantum dot per tracciare il legame e l'endocitosi nelle cellule HEK293T

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Abbiamo stabilito una tecnologia di piattaforma per LA SARS COVID 2 che può essere applicabile ad altri virus con il riconoscimento e l'ingresso delle cellule mediate da Spike come primo passo nell'infezione virale cellulare. I punti quantici sono luminosi, stabili e la loro superficie può essere funzionalizzata per una varietà di applicazioni cellulari. Usando questo metodo, possiamo visualizzare e misurare l'interiorizzazione di Spike nelle cellule.Per preparare lo 0,1% BSA. Aggiungere 130 microlitri da 7,5% BSA a 10 millilitri di supporti di imaging in mix. Per una diluizione seriale da 6,1 a tre e triplicato aggiungere 14,26 microlitri di QD Spike a 285,74 microlitri dello 0,1% BSA per ottenere la massima concentrazione di 20 nanomoli.Quindi aggiungere 100 microlitri di 20 nanomole o QD Spike a 200 microlitri dello 0,1% BSA per creare la seconda illusione di 6,67 nanomole QD Spike. Rimuovere tutti i supporti esauriti da ciascun pozzetto con un aspiratore multicanale, lavare una volta con una pipetta multicanale con 100 microlitri di supporti di imaging per pozzetto, quindi aspirare 100 microlitri del supporto di imaging. Aggiungere 50 microlitri di soluzione QD Spike per pozzetto e incubare la piastra per tre ore in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.Indossando dispositivi di protezione, preparare i supporti di imaging al 4% pfa e allo 0,1% PSA all'interno di un armadio di sicurezza biologico sterile, aspirare 50 microlitri di QD Spike da ciascun pozzo e aggiungere 100 microlitri del 4% di PFA per pozzetto con una pipetta multicanale automatizzata per evitare di asciugare i pozzetti. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare tre volte con PBS, preparare il colorante nucleare rosso intenso diluendo la soluzione madre da cinque millimetri a uno a 1000 in PBS, aspirare il PBS e aggiungere nuovamente 50 microlitri di colorante nucleare diluito per pozzetto. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare tre volte con PBS, visualizzare la piastra o sigillarla utilizzando un sigillante a piastre per l'imaging successivo.Conservare il piatto a quattro gradi Celsius. Avviare il software per la piattaforma di imaging. Dopo aver effettuato l'accesso alla piattaforma di imaging, creare un nuovo protocollo di acquisizione selezionando il tipo di piastra come piastra di imaging inferiore trasparente a 96 pareti, selezionare la modalità ottica è diventata focale e l'ingrandimento come 40 volte l'immersione in acqua, selezionare il binning come uno.Selezionare la modalità per i contrasti facciali digitali, ad esempio il contrasto elevato, per produrre corpi cellulari ben definiti. Scatta un'istantanea per confermare che questa intestazione è appropriata come mostrato nella finestra dell'immagine, seleziona il canale C adatto per l'uso con la linea cellulare ACE2-GFP per visualizzare il traffico ACE2 all'interno della cella. Per creare un canale QD personalizzato, selezionare il menu a discesa triangolo e scegliere l'eccitazione nell'intervallo di 405 nanometri in emissione nell'intervallo 608 nanometri, selezionare un pozzo con un robusto segnale QD citoplasmatico per impostare il tempo di esposizione, la potenza del laser e la posizione di altezza Z.Verificate se l'altezza predefinita produce un'immagine delle celle nel piano focale desiderato. La posizione Z sarà inferiore per l'endocitosio puntata rispetto alla posizione Z per la membrana plasmatica. Scegli un tempo di esposizione, in genere compreso tra 100 e 300 millisecondi, che produca un'immagine luminosa con livelli di grigio, almeno tre volte superiori al segnale di sfondo.A 20 nanomole i livelli di grigio dovrebbero essere di circa 6.000 unità atomiche con un tempo di esposizione di 200 millisecondi e una potenza laser dell'80%. Controlla i livelli di grigio facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine prodotta con la funzione di istantanea in ciascun canale e selezionando l'intensità dello spettacolo, quindi fai clic con il pulsante sinistro del mouse sull'oggetto di interesse o sullo sfondo per visualizzare il livello di grigio per quel pixel, regola la potenza del laser per regolare l'intensità degli oggetti di interesse. Salva il protocollo di acquisizione, passa all'esperimento e inserisci il nome della piastra, esegui l'esperimento.La traslocazione di QD e ACE2 è stata visualizzata utilizzando la microscopia a fluorescenza e una linea cellulare che esprime ACE2-GFP. La segmentazione delle immagini e la successiva analisi sono state eseguite per estrarre parametri rilevanti come il conteggio spot. In primo luogo, i nuclei sono stati segmentati dal canale del marcatore nucleare per creare una popolazione ROI.Quindi una regione ROI che delinea la cella con segmentato utilizzando il canale ACE2-GFP. Infine, i punti QD 608 Spike sono stati segmentati dalla regione ROI delle celle, i segnali QD e ACE2 internalizzati hanno mostrato una forte co-localizzazione. Un esperimento di risposta alla concentrazione con sei diverse concentrazioni di QD Spike è stato eseguito in cellule HEK 293T.Determinando le concentrazioni ottiche di QD, QDS può essere utilizzato a partire da 2,22 nanomole, tuttavia, si consiglia di utilizzare concentrazioni di 10 nanomole o superiori per garantire una risposta robusta. Durante la coniugazione alla proteina QD può verificarsi l'aggregazione. Gli aggregati sono stati individuati nella soluzione QD come precipitati aggregati luminosi e cellule HEK 293T, i QD sono stati incubati con anticorpi neutralizzati a partire da 30 microgrammi per microlitro prima che l'aggiunta alle cellule, questi anticorpi bloccassero l'internalizzazione del legame e causassero una riduzione del numero di spot rispetto alle cellule trattate solo con QD.Questo saggio può anche essere utilizzato per lo screening ad alto rendimento, la valutazione del piombo degli anticorpi neutralizzanti per identificare gli antivirali del gioco di parole per l'ingresso virale di blocco ed essere adattato per studiare le nuove varianti emergenti.

Research

JoVE Journal

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Tamponare l'ambiente urbano - Una pipeline per il campionamento e il rilevamento della SARS-CoV-2 dai bacini ambientali

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Una piattaforma ad alto rendimento per la coltura e l'imaging 3D di organoidi

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

Caratterizzazione dei trasportatori di zinco nei mammiferi mediante un saggio di trasporto dello zinco in vitro

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...