Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

この研究は、NIHの国立トランスレーショナルサイエンス推進センターの学内研究プログラムによって部分的に支援されました。海軍研究所は、内部のナノサイエンス研究所 を通じて 資金を提供しました。試薬調製は、NRL COVID-19基本基金 を通じて 支援されました。

本研究で用いたHEK293T細胞株は、不死化細胞株である。ヒトまたは動物の被験者は、この研究において使用されなかった。
1. 細胞の培養と播種
<ol><li>滅菌バイオセーフティキャビネット内で、個人用保護具(ラボグローブ、ラボコート、安全メガネを含む)を着用し、ダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)に10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシ?...

<ol>
	<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Lysosomes+in+Live+Cells+with+LysoTracker.">Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments.">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li><li>Barroso, M. 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S., Pal, S. 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この記事で説明する方法は、ハイスループット共焦点顕微鏡を使用してヒト細胞中の機能化QDをイメージングするために必要な手順を提供します。この方法は、SARS-CoV-2スパイクおよびhACE2エンドサイトーシスの研究を可能にするため、TMPRSS2の活性および膜融合ではなく、エンドサイトーシスがウイルス侵入の主な経路である細胞に最も適している。QDモデルの性質と市販のスパイク三量体上?...

蛍光顕微鏡により、研究者は特殊な色素1、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質2、および量子ドット(QD)3の形の蛍光ナノ粒子を使用して、細胞の内部の仕組みを覗くことができます。2019年の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV-2)の世界的なパンデミックのために、研究者は蛍光顕微鏡法を使用して、ウイルスが原形質膜と細胞質の両方で細胞とどのように相互作用するかを理解しました。例えば、研究者らは、ビリオン表面のSARS-CoV-2スパイクタンパク質とヒト細胞表面のヒトアンジオテンシン変換酵素2(hACE2)との結合、その後の原形質膜での融合によるインターナリゼーション、およびスパイク:hACE2タンパク質複合体のエンドサイトーシスに関する洞察を得ることができました4,5。また、他の多くのウイルスと同様に、ゴルジ体から出芽する伝統的な小胞を介して発生すると考えられていたコロナウイルスのユニークな特徴である細胞蛍光イメージングを使用して、リソソームを介して細胞からSARS-CoV-2が出ることについても大きな洞察が得られました6。生物学的研究のほぼすべての側面の柱である細胞蛍光顕微鏡技術は、動物全体の超解像イメージングから薬物スクリーニングのための自動高含有量マルチパラメトリックイメージングまで、その幅広さと応用範囲において必然的に進歩してきました。ここでは、自動高含量共焦点顕微鏡法が、ウイルススパイクタンパク質にコンジュゲートした蛍光QDを用いたSARS-CoV-2細胞侵入の研究に適用される。
生物学的イメージングプラットフォームによって生成された画像のハイコンテンツ分析は、マルチモーダルプレートリーダーを使用して取得するウェル全体の強度などの単一のパラメータよりも、貴重な生物学的洞察のより大きな抽出を可能にします7。自動セグメンテーションアルゴリズムを使用して視野内のオブジェクトを分離することにより、各オブジェクトまたはオブジェクトの集団を、利用可能な各蛍光チャネルの強度、面積、テクスチャなどのパラメータについて分析できます8。多くの測定値を多変量データセットに結合することは、表現型プロファイリングに便利なアプローチです。プンクタの形態のQDインターナリゼーションなどの所望の表現型が知られている場合、サイズ、数、強度などのプンクタに関連する測定値を使用して、治療の有効性を評価することができる。
クラウドベースのハイコンテンツイメージング解析ソフトウェアは、ハイコンテンツイメージングプラットフォームを含む多種多様な機器データ出力に対応できます。画像ストレージとオンライン分析にクラウドベースのサーバーを使用することで、ユーザーはイメージング機器またはデータが保存されているネットワークドライブからデータをアップロードできます。プロトコルの分析部分はクラウドソフトウェア環境内で行われ、ダウンストリームのデータ視覚化のためにさまざまなファイル形式でデータをエクスポートできます。
SARS-CoV-2ウイルスは、その集合および複製を助ける非構造的および構造的タンパク質からなる。SARS-CoV-2スパイクはS1とS2と呼ばれる2つのドメインを有し、S1は原形質膜におけるhACE2相互作用に関与する受容体結合ドメインを含む9。スパイクはまた、hACE210,11に加えて共受容体として作用し得る原形質膜において他の分子と相互作用することが見出されている。スパイクタンパク質配列全体、特にS1/S2界面には、膜貫通後の膜における融合を可能にするプロテアーゼ切断部位がセリンプロテアーゼ2(TMPRSS2)12に存在する。個々の受容体結合ドメインから、S1、S2、S1、およびスパイク三量体全体を研究活動に使用するために、複数の商業ベンダーからS1、S2、およびスパイク三量体全体に対して、さまざまな組換えSARS-CoV-2スパイクタンパク質が産生されています13。
この研究において、QDsの表面を、ヒスチジンタグを含む組換えスパイク三量体(QD-Spike)で官能化した。海軍研究所光学ナノ材料部門によって製造されたQDは、セレン化カドミウムコアと硫化亜鉛シェル14,15を含む。QD表面上の亜鉛は、組換えタンパク質内のヒスチジン残基を調整して、SARS-CoV-2ウイルス粒子に形態および機能的に類似した機能化されたQDを形成する。ナノ粒子の生成およびタンパク質コンジュゲーションは、QD結合型受容体結合ドメインを用いて先に記載した15。この方法は、ヒト細胞の生理学的文脈におけるSARS-CoV-2スパイク活性を研究する際に研究者を導くことができる細胞培養調製物、QD処理、画像取得、およびデータ解析プロトコルを記述する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

細胞蛍光顕微鏡法の新技術の開発により、創薬のためのハイスループットスクリーニング方法が容易になりました。量子ドットは、明るく安定したフォトルミネッセンスと狭い発光帯を吹き込んだ優れた光物性を有する蛍光ナノ粒子である。量子ドットは球状の形状であり、表面化学を適切に修正して、細胞用途のために生体分子を共役するために使用することができる。これらの光学特性は、生体分子でそれらを機能化する能力と相まって、受容体 - リガンド相互作用および細胞輸送を調査するための優れたツールとなる。ここでは、量子ドットを使用してSARS-CoV-2スパイクタンパク質の結合およびエンドサイトーシスを追跡する方法を提示する。このプロトコルは、細胞生理学の文脈におけるタンパク質間相互作用およびトラッキングを研究するために量子ドットを利用しようとしている実験家のためのガイドとして使用することができる。

治療すると、ナノ粒子が原形質膜上のACE2に結合し、エンドサイトーシスを誘導するため、QDは内在化される。ACE2-GFP発現細胞株を用いて、QDおよびACE2の両方の転座を蛍光顕微鏡を用いて可視化することができる。一旦内部化されると、2つのQDおよびACE2シグナルは強い共局在化を示す。これらの画像から、画像セグメンテーションおよびその後の分析を実行して、スポットカウントなどの関連?...

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High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

このプロトコルでは、組換えSARS-CoV-2スパイクにコンジュゲートした量子ドットは、細胞ベースのアッセイを可能にし、原形質膜でのhACE2へのスパイク結合およびその後の細胞質への結合タンパク質のエンドサイトーシスをモニターする。

HEK293T細胞における結合およびエンドサイトーシスを追跡するための量子ドット共役SARS-CoV-2スパイク三量体のハイスループット共焦点イメージング

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

私たちは、スパイク媒介細胞の認識と侵入を細胞ウイルス感染の第一歩として、他のウイルスにも適用できるSARS新型コロナウイルスCOVID 2のプラットフォーム技術を確立しました。量子ドットは明るく、安定しており、その表面は様々な細胞用途のために官能化することができる。この方法を使用すると、細胞へのスパイクのインターナリゼーションを視覚化して測定することができます。0.1%BSAを準備する。10ミリリットルのイメージングメディアに130マイクロリットルの7.5%BSAを加えます。6.1~3段階希釈および3連の場合は、14.26マイクロリットルのQDスパイクを285.74マイクロリットルの0.1%BSAに加え、最高濃度の20ナノモルにします。次に、100マイクロリットルの20ナノモルまたはQDスパイクを200マイクロリットルの0.1%BSAに追加して、6.67ナノモルのQDスパイクの2番目の妄想を行います。マルチチャンネルアスピレーターで各ウェルからすべての使用済み培地を取り出し、ウェルあたり100マイクロリットルのイメージングメディアを含むマルチチャンネルピペットで1回洗浄し、次に100マイクロリットルのイメージングメディアを吸引します。1ウェルあたり50マイクロリットルのQDスパイク溶液を再び添加し、プレートを摂氏37度の加湿インキュベーターで5%の二酸化炭素で3時間インキュベートする。保護具を着用し、滅菌バイオ安全キャビネット内に4%PFAおよび0.1%PSAイメージングメディアを準備し、各ウェルから50マイクロリットルのQDスパイクを吸引し、ウェルの乾燥を避けるために自動マルチチャンネルピペットでウェルあたり100マイクロリットルの4%PFAを追加します。室温で15分間インキュベートし、次いでPBSで3回洗浄し、5ミリメートルの原液をPBSで1〜1000で希釈して深赤色核色素を調製し、PBSを吸引し、1ウェルあたり50マイクロリットルの希釈核色素を戻す。室温で30分間インキュベートし、PBSで3回洗浄し、プレートを画像化するか、後でイメージング用のプレートシーラーを使用してシールします。プレートを摂氏 4 度で保管します。イメージングプラットフォーム用のソフトウェアを起動します。イメージングプラットフォームにログインした後、96ウォール透明底イメージングプレートとしてプレートタイプを選択して新しい取得プロトコルを作成し、焦点と倍率を40倍の水浸漬として行った光学モードを選択し、ビニングを1つとして選択します。ハイコントラストなどのデジタル顔コントラストのモードを選択して、明確に定義された細胞体を生成します。スナップショットを撮って、画像ウィンドウに表示されるこの見出しが適切であることを確認し、ACE2-GFP細胞株で使用する適合Cチャネルを選択して、細胞内のACE2トラフィッキングを視覚化します。カスタムQDチャンネルを作成するには、三角形のドロップダウンメニューを選択し、608ナノメートルの範囲の発光で405ナノメートルの範囲の励起を選択し、堅牢な細胞質QD信号を持つ井戸を選択して、露光時間、レーザーパワー、Z高さ位置を設定します。デフォルトの高さで、目的の焦点面内のセルのイメージが生成されるかどうかを確認します。Z位置は、原形質膜に対するZ位置よりもエンドサイトース穿刺の方が低くなるであろう。通常、100 ~ 300 ミリ秒の露光時間を選択して、背景信号の少なくとも 3 倍のグレーレベルの明るい画像を生成します。20ナノモルでは、グレーレベルは約6,000原子単位で、露光時間は200ミリ秒で、レーザー出力は80%です。各チャンネルのスナップショット機能で生成された画像を右クリックして[強度を表示]を選択し、目的のオブジェクトまたは背景を左クリックしてそのピクセルのグレーレベルを表示し、レーザー出力を調整して目的のオブジェクトの強度を微調整します。取得プロトコルを保存し、実験の実行に切り替えてプレート名を入力し、実験を実行します。QDおよびACE2の両方の転座を、蛍光顕微鏡法およびACE2−GFP発現細胞株を用いて可視化した。画像セグメンテーションとその後の分析を行い、スポットカウントなどの関連パラメータを抽出しました。まず、核マーカーチャネルから核をセグメント化してROI集団を作成した。次に、ACE2−GFPチャネルを用いてセグメント化して細胞を輪郭を描くROI領域を作製する。最後に、QD 608スパイクスポットは、細胞ROI領域からセグメント化され、インターナライズされたQDおよびACE2シグナルは、強い共局在を示した。6つの異なる濃度のQDスパイクを用いた濃度応答実験を、HEK 293T細胞において実施した。QDの光学濃度を決定する場合、QDSは2.22ナノモルまで低く使用できますが、堅牢な応答を確保するために10ナノモル以上の濃度を使用することをお勧めします。QDタンパク質へのコンジュゲーション中に凝集が起こり得る。凝集体を、明るい凝集沈殿物およびHEK 293T細胞としてQD溶液中にスポットし、QDsを細胞に添加する前にマイクロリットル当たり30マイクログラムで開始する中和抗体と共にインキュベートし、これらの抗体が結合インターナリゼーションをブロックし、QDのみで処理した細胞と比較してスポット数の減少を引き起こした。このエッセイは、ハイスループットスクリーニング、中和抗体の評価をリードして、ブロックウイルスの侵入に対する抗ウイルス薬を同定し、新たに出現するバリアントの研究に適応させることもできます。

Research

JoVE Journal

Biology

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A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ

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High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

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Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

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