Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

이 연구는 NIH 국립 번역 과학 발전 센터의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 해군 연구소는 내부 나노 과학 연구소를 통해 자금을 제공했습니다. 시약 준비는 NRL COVID-19 기본 기금을 통해 지원되었습니다.

본 연구에 사용된 HEK293T 세포주는 불멸화 세포주이다. 이 연구에서는 인간 또는 동물 피험자가 사용되지 않았다.
1. 세포 배양 및 파종
<ol><li>멸균 생물 안전 캐비닛 내부에는 개인 보호 장비 (실험실 장갑, 실험실 코트 및 안전 안경 포함)를 착용하고 Dulbecco의 변형 이글 배지 (DMEM)에 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S) 및 250 μg / mL G418을 ?...

<ol>
	<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Lysosomes+in+Live+Cells+with+LysoTracker.">Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments.">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li><li>Barroso, M. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+properties+of+SARS-CoV-2+spike+protein:+potential+antivirus+drug+development+for+COVID-19.">Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+spike+protein+interacts+with+multiple+innate+immune+receptors.">SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors.</a> bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+assists+SARS-CoV-2+in+cell+entry+and+can+be+targeted+by+approved+drugs+in+vitro.">Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro.</a> Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+Is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+conformational+states+of+SARS-CoV-2+spike+protein.">Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein.</a> Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).</li><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+cellular+toxicity+for+cadmium-containing+quantum+dots.">Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots.</a> Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).</li><li>Gorshkov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-conjugated+SARS-CoV-2+spike+pseudo-virions+enable+tracking+of+angiotensin+Converting+enzyme+2+binding+and+endocytosis.">Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis.</a> ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).</li><li>Narayanan, S. S., Pal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+CdS+quantum+dots:+Host+of+biomolecular+ligands.">Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+together+with+virus+receptor+ACE2.">Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2.</a> Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).</li><li>Hildebrandt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer+with+semiconductor+quantum+dot+bioconjugates:+A+versatile+platform+for+biosensing,+energy+harvesting,+and+other+developing+applications.">Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications.</a> Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).</li></ol>

이 기사에 설명 된 방법은 고처리량 공초점 현미경을 사용하여 인간 세포에서 기능화 된 QD를 이미징하는 데 필요한 단계를 제공합니다. 이 방법은 SARS-CoV-2 스파이크 및 hACE2 엔도사이토시스에 대한 연구를 가능하게 하기 때문에 TMPRSS2 및 막 융합의 활성보다는 엔도사이토시스가 바이러스 진입의 주요 경로인 세포에 가장 적합합니다. QD 모델 및 상업적으로 입수가능한 스파이크 삼량체 상의 C-말단...

형광 현미경을 통해 연구원은 특수 염료1, 유전적으로 인코딩된 형광 단백질2 및 양자점(QD) 형태의 형광 나노입자를 사용하여 세포의 내부 작용을 조사할 수 있습니다3. 2019 년 심각한 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 (SARS-CoV-2) 세계적인 유행병의 경우, 연구자들은 바이러스가 원형질막과 세포질에서 세포와 어떻게 상호 작용하는지 이해하기 위해 형광 현미경을 사용했습니다. 예를 들어, 연구자들은 비리온 표면의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과 인간 세포 표면의 인간 안지오텐신 전환 효소 2 (hACE2)의 결합, 원형질막에서의 융합을 통한 후속 내재화 및 스파이크 : hACE2 단백질 복합체의 내시세포증4,5에 대한 통찰력을 얻을 수있었습니다. 또한 세포 형광 이미징을 사용하여 리소좀을 통해 세포로부터 SARS-CoV-2 유출 에 대한 훌륭한 통찰력을 얻었는데, 이는 이전에 골지에서 싹트는 전통적인 소포를 통해 발생하는 것으로 생각되었던 코로나 바이러스의 독특한 특징입니다6 다른 많은 바이러스와 마찬가지로. 생물학적 연구의 거의 모든 측면의 주류 인 세포 형광 현미경 검사 기술은 전체 동물의 초해상도 이미징에서 약물 스크리닝을위한 자동화 된 고함량 다중 파라 메트릭 이미징에 이르기까지 광범위한 응용 분야에서 필연적으로 발전해 왔습니다. 여기서, 자동화된 고함량 공초점 현미경은 바이러스 스파이크 단백질에 접합된 형광 QDs를 사용하는 SARS-CoV-2 세포 진입의 연구에 적용된다.
생물학적 이미징 플랫폼에 의해 생성된 이미지의 고함량 분석은 다중 모드 플레이트 리더를 사용하여 얻을 수 있는 전체 웰 강도와 같은 단일 파라미터보다 귀중한 생물학적 통찰력을 더 크게 추출할 수 있게 해줍니다7. 자동화된 세분화 알고리즘을 사용하여 시야에서 객체를 분리함으로써, 각각의 오브젝트 또는 오브젝트 집단은 각각의 이용가능한 형광 채널8에서 강도, 면적 및 텍스처와 같은 파라미터에 대해 분석될 수 있다. 많은 측정값을 다변량 데이터 세트에 결합하는 것은 표현형 프로파일링에 유용한 접근 방식입니다. 원하는 표현형, 예를 들어 누점 형태의 QD 내재화가 알려져 있는 경우, 치료의 효능을 평가하기 위해 크기, 수 및 강도와 같은 누자와 관련된 측정을 사용할 수 있다.
클라우드 기반 고콘텐츠 이미징 분석 소프트웨어는 고콘텐츠 이미징 플랫폼을 포함한 다양한 계측기 데이터 출력을 수용할 수 있습니다. 이미지 저장 및 온라인 분석을 위해 클라우드 기반 서버를 사용함으로써 사용자는 이미징 장비 또는 데이터가 저장된 네트워크 드라이브에서 데이터를 업로드 할 수 있습니다. 프로토콜의 분석 부분은 클라우드 소프트웨어 환경 내에서 수행되며 다운스트림 데이터 시각화를 위해 다양한 파일 형식으로 데이터를 내보낼 수 있습니다.
SARS-CoV-2 바이러스는 조립 및 복제를 돕는 비구조 및 구조 단백질로 구성됩니다. SARS-CoV-2 스파이크는 S1과 S2라는 두 개의 도메인을 가지고 있으며, S1은 원형질막에서 hACE2 상호 작용을 담당하는 수용체 결합 도메인을 포함합니다9. 스파이크는 또한 hACE210,11 이외에 공동-수용체로서 작용할 수 있는 원형질막에서 다른 분자들과 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 스파이크 단백질 서열 전체에서, 특히 S1/S2 계면에서, 막횡단 세린 프로테아제 2 (TMPRSS2)12 이후 막에서 융합을 가능하게 하는 프로테아제 절단 부위가 존재한다. 다양한 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 단백질은 개별 수용체 결합 도메인으로부터 S1, S2, S1 및 S2를 갖는 S2 및 전체 스파이크 트리머로부터 연구 활동에 사용하기 위해 여러 상업 벤더로부터 생산되었다13.
이 작업에서, QDs의 표면은 히스티딘 태그 (QD-Spike)를 포함하는 재조합 스파이크 트리머로 기능화되었다. 해군 연구소 광학 나노 물질 섹션에서 생산 한 QD에는 카드뮴 셀레나이드 코어와 황화아연 쉘14,15가 포함되어 있습니다. QD 표면 상의 아연은 재조합 단백질 내의 히스티딘 잔기를 좌표화하여 형태와 기능면에서 SARS-CoV-2 바이러스 입자와 유사한 기능화된 QD를 형성한다. 나노입자의 생성과 컨쥬게이션된 단백질은 QD 컨쥬게이션된 수용체 결합 도메인15를 사용하여 이전에 기술되었다. 이 방법은 인간 세포의 생리적 맥락에서 SARS-CoV-2 스파이크 활성을 연구하는 연구자를 안내 할 수있는 세포 배양 준비, QD 치료, 이미지 수집 및 데이터 분석 프로토콜을 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

세포 형광 현미경 검사를위한 새로운 기술의 개발은 약물 발견을위한 고처리량 스크리닝 방법을 촉진했습니다. 양자점은 밝고 안정적인 광발광뿐만 아니라 좁은 발광 대역으로 스며든 우수한 광물리학적 특성을 가진 형광 나노입자입니다. 양자점은 구형이며, 표면 화학의 적절한 변형과 함께, 세포 응용을 위해 생체분자를 접합하는데 사용될 수 있다. 이러한 광학 특성은 생체 분자로 기능화 할 수있는 능력과 결합하여 수용체 - 리간드 상호 작용 및 세포 밀매를 조사하기위한 훌륭한 도구입니다. 여기에서는 양자점을 사용하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 결합 및 엔도사이토시스를 추적하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 양자점을 활용하여 세포 생리학의 맥락에서 단백질-단백질 상호작용 및 인신매매를 연구하고자 하는 실험가들을 위한 가이드로 사용될 수 있다.

처리시, QDs는 나노입자가 원형질막 상의 ACE2에 결합하고 엔도사이토시스를 유도할 것이기 때문에 내재화될 것이다. ACE2-GFP 발현 세포주를 사용하여, QD 및 ACE2 둘 다의 전좌는 형광 현미경을 사용하여 시각화될 수 있다. 일단 내부화되면, 두 개의 QD 및 ACE2 신호는 강력한 공동 로컬라이제이션을 보여준다. 이러한 이미지로부터 이미지 세분화 및 후속 분석을 수행하여 스폿 카운트와 같은 관련 파라?...

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High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

이 프로토콜에서, 재조합 SARS-CoV-2 스파이크에 접합된 양자점은 세포-기반 분석을 가능하게 하여 원형질막에서 hACE2에 대한 스파이크 결합 및 세포질 내로의 결합된 단백질의 후속 엔도사이토시스를 모니터링한다.

HEK293T 세포에서 결합 및 엔도사이토시스를 추적하기 위한 양자점 접합 SARS-CoV-2 스파이크 삼량체의 고처리량 공초점 이미징

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

우리는 세포 바이러스 감염의 첫 번째 단계로 스파이크 매개 세포 인식 및 진입으로 다른 바이러스에 적용 할 수있는 SARS COVID 2를위한 플랫폼 기술을 수립했습니다. 양자점은 밝고 안정적이며 그 표면은 다양한 세포 응용을 위해 기능화 될 수 있습니다. 이 방법을 사용하여 스파이크 내재화를 시각화하고 세포로 측정 할 수 있습니다.0.1 % BSA를 준비하십시오. 130 마이크로 리터의 7.5 % BSA를 10 밀리리터의 이미징 매체에 혼합하십시오. 6.1 내지 3개의 연속 희석 및 삼중의 경우 14.26 마이크로리터의 QD 스파이크를 0.1%BSA의 285.74 마이크로리터에 첨가하여 20나노몰의 최고 농도를 만든다.그런 다음 20 나노 몰 또는 QD 스파이크 100 마이크로 리터를 0.1 % BSA의 200 마이크로 리터에 추가하여 6.67 나노 몰 QD 스파이크의 두 번째 망상을 만듭니다. 다중 채널 흡입기로 각 웰에서 사용 된 모든 미디어를 제거하고 웰 당 100 마이크로 리터의 이미징 미디어가있는 다중 채널 피펫으로 한 번 씻은 다음 이미징 미디어 100 마이크로 리터를 흡인하십시오. 웰 당 50 마이크로리터의 QD 스파이크 용액을 다시 첨가하고, 플레이트를 섭씨 37도의 가습 인큐베이터에서 5% 이산화탄소로 3시간 동안 인큐베이션한다.보호 장비를 착용하고 멸균 된 바이오 안전 캐비닛 내부에 4 % PFA 및 0.1 % PSA 이미징 미디어를 준비하고 각 웰에서 50 마이크로 리터의 QD 스파이크를 흡인하고 웰 당 4 % PFA 100 마이크로 리터를 자동 다중 채널 피펫으로 추가하여 웰이 건조되지 않도록하십시오. 실온에서 15분 동안 배양한 다음, PBS로 3회 세척한 후, PBS에 5밀리미터 원액을 1000 내지 1000으로 희석하여 딥 레드 핵 염료를 제조하고, PBS를 흡인하고, 웰 당 희석된 핵 염료 50 마이크로리터를 다시 첨가한다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, PBS로 3회 세척하고, 플레이트를 이미지화하거나 추후 이미징을 위해 플레이트 실러를 사용하여 밀봉한다.접시를 섭씨 네 도에 보관하십시오. 이미징 플랫폼용 소프트웨어를 시작합니다. 이미징 플랫폼에 로그인한 후 96 벽면 투명 바닥 이미징 플레이트로서 플레이트 타입을 선택하여 새로운 획득 프로토콜을 생성하고, 광학 모드를 선택하여 초점과 배율을 40배 수침수로 한 후, 비닝을 하나로 선택한다.고대비와 같은 디지털 얼굴 대비 모드를 선택하여 잘 정의된 세포체를 생성합니다. 스냅샷을 찍어 이 제목이 이미지 윈도우에 표시된 대로 적절한지 확인하고, ACE2-GFP 세포주와 함께 사용할 적합 C 채널을 선택하여 셀 내에서 ACE2 트래피킹을 시각화합니다. 사용자 정의 QD 채널을 만들려면 삼각형 드롭 다운 메뉴를 선택하고 608 나노 미터 범위에서 방출되는 405 나노 미터 범위의 여기를 선택하고 강력한 세포질 QD 신호가있는 우물을 선택하여 노출 시간, 레이저 전력 및 Z 높이 위치를 설정하십시오.기본 높이가 원하는 초점 평면에서 셀의 이미지를 생성하는지 확인합니다. Z 위치는 원형질막에 대한 Z 위치보다 엔도사이토오스 누자에 대해 더 낮을 것이다. 일반적으로 배경 신호보다 3배 이상 큰 회색 레벨의 밝은 이미지를 생성하는 노출 시간을 100밀리초에서 300밀리초 사이로 선택합니다.20 나노 몰에서 회색 수준은 약 6, 000 원자 단위이어야하며 노출 시간은 200 밀리 초이고 레이저 파워는 80 %입니다. 각 채널의 스냅 샷 기능으로 생성 된 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 강도 표시를 선택한 다음 관심있는 객체 또는 배경을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 해당 픽셀의 회색 레벨을 확인하고 레이저 파워를 조정하여 관심있는 물체의 강도를 미세 조정하십시오. 획득 프로토콜을 저장하고 실험을 실행하도록 전환하고 플레이트 이름을 입력하고 실험을 실행하십시오.QD 및 ACE2 둘 다의 전좌는 형광 현미경 및 ACE2-GFP 발현 세포주를 사용하여 시각화하였다. 이미지 세분화 및 후속 분석을 수행하여 스팟 카운트와 같은 관련 파라미터를 추출하였다. 첫째, 핵을 핵 마커 채널로부터 분할하여 ROI 집단을 생성하였다.그런 다음 ACE2-GFP 채널을 사용하여 세그먼트화하여 셀을 윤곽을 그리는 ROI 영역. 마지막으로, QD 608 스파이크 스폿은 셀 ROI 영역으로부터 세그먼트화되었고, 내부화된 QD 및 ACE2 신호는 강한 공동 국재화를 보였다. 여섯 가지 상이한 농도의 QD 스파이크를 사용한 농도 반응 실험을 HEK 293T 세포에서 수행하였다.QD의 광학 농도를 결정할 때 QDS는 2.22 나노 몰만큼 낮게 사용할 수 있지만 강력한 반응을 보장하기 위해 10 나노 몰 이상의 농도를 사용하는 것이 좋습니다. QD에 컨쥬게이션 동안 단백질 응집이 발생할 수 있다. 응집체는 밝은 응집된 침전물 및 HEK 293T 세포로서 QD 용액에서 발견되었고, QDs는 세포에 첨가되기 전에 마이크로리터당 30 마이크로그램에서 시작하는 중화된 항체와 함께 인큐베이션되었고, 이들 항체는 결합 내재화를 차단하고 QD만으로 처리된 세포에 비해 스팟 카운트의 감소를 야기하였다.이 에세이는 또한 높은 처리량 스크리닝, 중화 항체의 리드 평가에 사용될 수 있으며, 바이러스 진입을 차단하기 위해 말장난 항 바이러스제를 확인하고 새로 떠오르는 변종을 연구하기 위해 적응 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

연구

생물학

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

펩티드 에피토프의 정량 분석​​을위한 높은 처리량 MHC II 결합 분석

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

후 전사적으로 규제 유전자의 화학 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

신진 효모의 세포 내 이입의 양적, 운동 및 높은 처리량 분석을위한 pHluorin의 응용 프로그램

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

악용 Myoblast 분화와 융합 하는 동안 트랙 핵에 라이브 영상

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

성장과 유전자 발현의 이질성을 측정하는 마이크로콜로니의 높은 처리량 라이브 이미징

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

SARS-CoV-2 검출 및 정량화를 위한 2단계 역전사 액적 디지털 PCR 프로토콜

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

도시 환경 면봉 - 환경 저수지에서 SARS-CoV-2의 샘플링 및 검출을 위한 파이프라인

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

오가노이드의 배양 및 3D 이미징을 위한 고처리량 플랫폼

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

In Vitro Zinc Transport Assay를 사용한 포유류 아연 수송체 특성 분석

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...