Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

Denne forskningen ble delvis støttet av Intramural Research Program ved National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Naval Research Laboratory ga støtte via sitt interne Nanoscience Institute. Reagensforberedelse ble støttet via NRL COVID-19 basisfond.

HEK293T-cellelinjen som brukes i denne studien er en udødeliggjort cellelinje. Ingen personer eller dyrepersoner ble brukt i denne studien.
1. Cellekultur og såing
<ol><li>Inne i et sterilt biosikkerhetsskap, iført personlig verneutstyr (inkludert labhansker, labfrakk og vernebriller), klargjør cellekulturmediet ved å supplere Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% fosterbovint serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin (P/S) og 250 μg/ml G418.<ol>
<li>For 500 ml ...

<ol>
	<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Lysosomes+in+Live+Cells+with+LysoTracker.">Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments.">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li><li>Barroso, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots+in+cell+biology.">Quantum dots in cell biology.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).</li><li>Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACE2:+Evidence+of+role+as+entry+receptor+for+SARS-CoV-2+and+implications+in+comorbidities.">ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities.</a> eLife. 9, 61390 (2020).</li><li>Shang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+mechanisms+of+SARS-CoV-2.">Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).</li><li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Coronaviruses+use+lysosomes+for+egress+instead+of+the+biosynthetic+secretory+pathway.">&#946;-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway.</a> Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).</li><li>Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+guidelines+for+image-based+high+content+screening,+high+content+analysis+and+high+content+imaging.">Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+profiling+for+drug+discovery:+due+for+a+machine-learning+upgrade.">Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).</li><li>Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+properties+of+SARS-CoV-2+spike+protein:+potential+antivirus+drug+development+for+COVID-19.">Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+spike+protein+interacts+with+multiple+innate+immune+receptors.">SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors.</a> bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+assists+SARS-CoV-2+in+cell+entry+and+can+be+targeted+by+approved+drugs+in+vitro.">Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro.</a> Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+Is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+conformational+states+of+SARS-CoV-2+spike+protein.">Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein.</a> Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).</li><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+cellular+toxicity+for+cadmium-containing+quantum+dots.">Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots.</a> Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).</li><li>Gorshkov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-conjugated+SARS-CoV-2+spike+pseudo-virions+enable+tracking+of+angiotensin+Converting+enzyme+2+binding+and+endocytosis.">Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis.</a> ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).</li><li>Narayanan, S. S., Pal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+CdS+quantum+dots:+Host+of+biomolecular+ligands.">Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+together+with+virus+receptor+ACE2.">Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2.</a> Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).</li><li>Hildebrandt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer+with+semiconductor+quantum+dot+bioconjugates:+A+versatile+platform+for+biosensing,+energy+harvesting,+and+other+developing+applications.">Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications.</a> Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).</li></ol>

Metoden som er beskrevet i denne artikkelen, inneholder de nødvendige trinnene for avbildning av funksjonaliserte QDer i humane celler ved hjelp av konfektmikroskopi med høy gjennomstrømning. Denne metoden er best egnet for celler der endokytose er hovedveien for viral oppføring i stedet for aktiviteten til TMPRSS2 og membranfusjon, da den muliggjør studiet av SARS-CoV-2 Spike og hACE2 endokytose. På grunn av arten av QD-modellen og C-terminalen His-tag på den kommersielt tilgjengelige Spike trimer, vil enhver TMP...

Fluorescensmikroskopi gjør det mulig for forskere å kikke inn i cellens indre arbeid ved hjelp av spesialiserte fargestoffer1, genetisk kodede fluorescerende proteiner2 og fluorescerende nanopartikler i form av kvanteprikker (QDs)3. For det alvorlige akutte respiratoriske syndromet coronavirus i 2019 (SARS-CoV-2) global pandemi, har forskere brukt fluorescensmikroskopi for å forstå hvordan viruset samhandler med cellen både ved plasmamembranen og i cytoplasma. For eksempel har forskere vært i stand til å få innsikt i bindingen av SARS-CoV-2 Spike-proteinet på virionens overflate til menneskelig angiotensinkonverterende enzym 2 (hACE2) på overflaten av menneskelige celler, etterfølgende internalisering via fusjon ved plasmamembranen og endokytose av Spike:hACE2 proteinkomplekset4,5. Stor innsikt har også blitt oppnådd i SARS-CoV-2-utgående fra celler via lysosomet ved hjelp av cellulær fluorescensavbildning, et unikt trekk ved koronavirus som tidligere ble antatt å oppstå via tradisjonell vesicle spirende fra Golgi, som det er med mange andre virus6. En bærebjelke i nesten alle aspekter av biologisk forskning, den cellulære fluorescensmikroskopiteknikken har nødvendigvis avansert i bredden og omfanget av applikasjoner fra superoppløselig avbildning av hele dyr til automatisert multiparametrisk bildebehandling med høyt innhold for narkotikascreening. Her brukes automatisert konfektmikroskopi med høyt innhold på studiet av SARS-CoV-2-celleinngang ved hjelp av fluorescerende QDer som er konjugert til det virale piggproteinet.
Høyinnholdsanalyse av bilder generert av biologiske bildeplattformer gir større utvinning av verdifull biologisk innsikt enn enkeltparametere som hel brønnintensitet, som man vil oppnå ved hjelp av en multimodal plateleser7. Ved å skille objektene i et synsfelt ved hjelp av automatiserte segmenteringsalgoritmer, kan hvert objekt eller en populasjon av objekter analyseres for parametere som intensitet, område og tekstur i hver tilgjengelige fluorescenskanal8. Å kombinere mange målinger i multivariate datasett er en nyttig tilnærming for fenotypisk profilering. Når ønsket fenotype er kjent, for eksempel QD internalisering i form av puncta, kan man bruke målingene relatert til puncta som størrelse, antall og intensitet for å vurdere effekten av en behandling.
Skybasert programvare for bildebehandling med høyt innhold kan romme et stort utvalg av instrumentdatautganger, inkludert bildeplattformen med høyt innhold. Ved å bruke en skybasert server for bildelagring og online analyse, kan brukeren laste opp dataene sine fra enten bildeinstrumentet eller fra nettverksstasjonen der dataene er lagret. Analysedelen av protokollen utføres i skyprogramvaremiljøet, og data kan eksporteres i en rekke filformater for nedstrøms datavisualisering.
SARS-CoV-2-viruset består av ikke-strukturelle og strukturelle proteiner som hjelper til med montering og replikering. SARS-CoV-2 spike har to domener kalt S1 og S2, med S1 som inneholder reseptorbindingsdomenet som er ansvarlig for hACE2-interaksjoner ved plasmamembranen9. Spike har også vist seg å samhandle med andre molekyler ved plasmamembranen som kan fungere som koreseptorer i tillegg til hACE210,11. Gjennom piggproteinsekvensen og spesielt ved S1/S2-grensesnittet er det protease spaltingssteder som muliggjør fusjon ved membranen etter transmembrane serinprotease 2 (TMPRSS2)12. Ulike rekombinante SARS-CoV-2 Spike-proteiner er produsert fra individuelle reseptorbindingsdomener, til S1, S2, S1 med S2 og hele spike trimers fra flere kommersielle leverandører for bruk i forskningsaktiviteter13.
I dette arbeidet ble overflaten av QDs funksjonalisert med rekombinante spike trimers som inneholder en histidin tag (QD-Spike). QD-ene produsert av Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section inneholder en kadmium selenidkjerne og et sinksulfidskall14,15. Sinken på QD-overflaten koordinerer histidinrester i det rekombinante proteinet for å danne en funksjonalisert QD som ligner en SARS-CoV-2 viral partikkel i form og funksjon. Genereringen av nanopartikler og proteinkonjugering ble tidligere beskrevet ved hjelp av QD-konjugert reseptorbindingsdomene15. Denne metoden beskriver cellekulturpreparatene, QD-behandling, bildeinnhenting og dataanalyseprotokoll som kan veilede en forsker i å studere SARS-CoV-2 Spike-aktivitet i den fysiologiske konteksten til en menneskelig celle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

Utviklingen av ny teknologi for cellulær fluorescensmikroskopi har lagt til rette for screeningmetoder med høy gjennomstrømning for narkotikaoppdagelse. Kvanteprikker er fluorescerende nanopartikler med utmerkede fotofysiske egenskaper gjennomsyret av lys og stabil fotoluminescens samt smale utslippsbånd. Kvanteprikke er sfæriske i form, og med riktig modifikasjon av overflatekjemien kan brukes til å konjugere biomolekyler for cellulære applikasjoner. Disse optiske egenskapene, kombinert med evnen til å funksjonalisere dem med biomolekyler, gjør dem til et utmerket verktøy for å undersøke reseptor-ligand interaksjoner og cellulær menneskehandel. Her presenterer vi en metode som bruker kvanteprikker for å spore binding og endokytose av SARS-CoV-2 spike protein. Denne protokollen kan brukes som en veiledning for eksperimentalister som ønsker å bruke kvanteprikkene til å studere proteinproteininteraksjoner og menneskehandel i sammenheng med cellulær fysiologi.

Ved behandling vil QDene bli internalisert da nanopartikkelen vil binde seg til ACE2 på plasmamembranen og indusere endokytose. Ved hjelp av en ACE2-GFP som uttrykker cellelinje, kan translokasjon av både QDs og ACE2 visualiseres ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Når de er internalisert, viser de to QD- og ACE2-signalene sterk colokalisering. Fra disse bildene kan bildesegmentering og etterfølgende analyse utføres for å trekke ut relevante parametere som spotantall (figur 1, <strong ...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

I denne protokollen, kvanteprikker konjugert til rekombinant SARS-CoV-2 spike aktivere cellebaserte analyser for å overvåke spike binding til hACE2 ved plasmamembranen og påfølgende endokytose av de bundne proteiner i cytoplasma.

Konfektavbildning av Quantum Dot-Konjugert SARS-CoV-2 spike trimers for å spore binding og endokytose i HEK293T-celler

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Vi har etablert en plattformteknologi for SARS COVID 2 som kan brukes på andre virus med Spike mediert cellegjenkjenning og oppføring som det første trinnet i cellulær virusinfeksjon. Kvanteprikke er lyse, stabile, og overflaten kan funksjonaliseres for en rekke cellulære applikasjoner. Ved hjelp av denne metoden kan vi visualisere og måle Spike internalisering i celler.Forbereder 0,1%BSA. Legg til 130 mikroliter med 7,5 % BSA til 10 milliliter bildemedier i blanding. For en 6,1 til tre seriell fortynning og triplikat tilsett 14,26 mikroliter QD Spike til 285,74 mikroliter av 0,1% BSA for å gjøre den høyeste konsentrasjonen av 20 nanomole.Tilsett deretter 100 mikroliter 20 nanomole eller QD Spike til 200 mikroliter 0,1% BSA for å gjøre den andre vrangforestillingen på 6,67 nanomole QD Spike. Fjern alle brukte medier fra hver brønn med en flerkanals aspirator, vask en gang med en flerkanals pipette med 100 mikroliter bildemedier per brønn, og aspirer deretter 100 mikroliter av bildemediet. Tilsett tilbake 50 mikroliter QD Spike-oppløsning per brønn og inkuber platen i tre timer i en fuktet inkubator ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid.Bruk verneutstyr, lag 4% PFA og 0,1% PSA-bildemedier inne i et sterilt biosikkerhetsskap, aspirer 50 mikroliter QD Spike fra hver brønn og tilsett 100 mikroliter 4% PFA per brønn med en automatisert flerkanals pipette for å unngå tørking av brønnene. Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur, vask deretter tre ganger med PBS, forbered det dype røde atomfargen ved å fortynne den fem millimeter lagerløsningen ved en til 1000 i PBS, aspirere PBS og tilsett tilbake 50 mikroliter fortynnet kjernefysisk fargestoff per brønn. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur, vask deretter tre ganger med PBS, bilde platen eller forsegle den ved hjelp av en plateforsegler for avbildning senere.Oppbevar platen på fire grader Celsius. Start programvaren for bildeplattformen. Etter at du har logget på bildeplattformen, oppretter du en ny anskaffelsesprotokoll ved å velge platetype som en 96-vegg gjennomsiktig bunnavbildningsplate, velg optisk modus har gått i fokus og forstørrelse som 40 ganger vanninnlevelse, velg binning som en.Velg modus for digitale ansiktskontraster, for eksempel høykontrast, for å produsere veldefinerte cellekropper. Ta et øyeblikksbilde for å bekrefte at denne overskriften passer som vist i bildevinduet, velg den passende C-kanalen for bruk med ACE2-GFP-cellelinjen for å visualisere ACE2-handel i cellen. For å lage en tilpasset QD-kanal, velg rullegardinmenyen for trekant og velg eksitasjonen i 405 nanometerområdet i utslipp i 608 nanometerområdet, velg en brønn med et robust cytoplasmisk QD-signal for å stille inn eksponeringstid, laserkraft og Z-høydeposisjon.Kontroller om standardhøyden gir et bilde av cellene i ønsket brennplan. Z-posisjonen vil være lavere for endokytose puncta enn Z-posisjonen for plasmamembranen. Velg en eksponeringstid, vanligvis mellom 100 og 300 millisekunder som gir et lyst bilde med gråtoner, minst tre ganger større enn bakgrunnssignalet.Ved 20 nanomole bør de grå nivåene være omtrent 6000 atomenheter med 200 millisekunder eksponeringstid og 80% laserkraft. Kontroller gråtoner ved å høyreklikke på bildet som produseres med øyeblikksbildefunksjonen i hver kanal, og velg vis intensitet, og klikk deretter på objektet av interesse eller bakgrunn for å vise det grå nivået for den pikselen, juster laserkraften for å finjustere intensiteten til objektene av interesse. Lagre anskaffelsesprotokollen, bytt for å kjøre eksperiment og skriv inn platenavnet, kjør eksperimentet.Translokasjon av både QDs og ACE2 ble visualisert ved hjelp av fluorescensmikroskopi og en ACE2-GFP som uttrykker cellelinje. Bildesegmentering og etterfølgende analyse ble utført for å trekke ut relevante parametere som spotantall. For det første ble kjerner segmentert fra kjernefysisk markørkanal for å skape en avkastningspopulasjon.Deretter skisserer et ROI-område cellen med segmentert ved hjelp av ACE2-GFP-kanalen. Til slutt ble QD 608 Spike flekker segmentert fra celle ROI-regionen, internaliserte QD- og ACE2-signaler viste sterk samlokalisering. Et konsentrasjonsresponseksperiment med seks forskjellige konsentrasjoner av QD Spike ble utført i HEK 293T-celler.Ved å bestemme optiske konsentrasjoner av QD, kan QDS brukes så lavt som 2,22 nanomole, men det anbefales å bruke konsentrasjoner på 10 nanomole eller høyere for å sikre en robust respons. Under konjugering til QD protein aggregasjon kan forekomme. Aggregater ble oppdaget i QD-løsningen som lyse klumpede utfellinger og HEK 293T-celler, QD-er ble inkubert med nøytraliserte antistoffer som startet på 30 mikrogram per mikroliter før tillegg til celler, disse antistoffene blokkerte bindingsinter internalisering og forårsaket en reduksjon i spotantallet sammenlignet med celler behandlet bare med QD.Dette essayet kan også brukes til screening med høy gjennomstrømning, blyevaluering av nøytraliserende antistoffer for å identifisere pun antivirale stoffer til blokken viral oppføring og tilpasses for å studere nylig fremvoksende varianter.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-basert Måling av Store-opererte Calcium Entry i levende celler: fra Helstøpt Cancer Cell til Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

En høy gjennomstrømning MHC II Binding Assay for kvantitativ analyse av peptidepitoper

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Høy gjennomstrømming Screening for kjemi modulatorer av Post-transcriptionally Regulerte Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Anvendelser av pHluorin for kvantitativ, Kinetic og High-throughput Analyse av Endocytose i spirende gjær

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Utnytte Live bildebehandling til spor kjerner Myoblast differensiering og Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Live Imaging av mikrokolonier med høy gjennomstrømning for å måle heterogenitet i vekst og genuttrykk

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

To-trinns omvendt transkripsjon dråpe digitale PCR-protokoller for SARS-CoV-2 deteksjon og kvantifisering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Swabbing the Urban Environment - En rørledning for prøvetaking og påvisning av SARS-CoV-2 fra miljøreservoarer

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

En plattform med høy gjennomstrømning for kultur og 3D-avbildning av organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

Karakterisering av pattedyrsinktransportører ved bruk av en in vitro sinktransportanalyse

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...