Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do Centro Nacional de Promoção de Ciências Translacionais, NIH. O Laboratório de Pesquisa Naval forneceu financiamento através de seu Instituto interno de Nanociências. A preparação do reagente foi apoiada através do fundo base NRL COVID-19.

A linha celular HEK293T usada neste estudo é uma linha celular imortalizada. Não foram utilizados indivíduos humanos ou animais neste estudo.
1. Cultivo de células e semeadura
<ol><li>Dentro de um armário de biossegurança estéril, usando equipamentos de proteção individual (incluindo luvas de laboratório, jaleco e óculos de segurança), prepare o meio de cultura celular suplementando o Meio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco com 10% de soro bovino fetal (FBS), p...

<ol>
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O método descrito neste artigo fornece as etapas necessárias para a imagem de QDs funcionalizados em células humanas usando microscopia confocal de alta produtividade. Este método é mais adequado para células onde a endocitose é a principal rota de entrada viral em vez da atividade de TMPRSS2 e fusão de membrana, pois permite o estudo do SarS-CoV-2 Spike e hACE2 endocitose. Devido à natureza do modelo QD e da tag C-terminal No aparador spike comercialmente disponível, qualquer decote TMPRSS2 dos domínios Spike...

A microscopia de fluorescência permite que os pesquisadores espiem o funcionamento interno da célula usando corantes especializados1, proteínas fluorescentes geneticamente codificadas2 e nanopartículas fluorescentes na forma de pontos quânticos (QDs)3. Para a síndrome respiratória aguda grave coronavírus de 2019 (SARS-CoV-2) pandemia global, pesquisadores têm usado microscopia de fluorescência para entender como o vírus interage com a célula tanto na membrana plasmática quanto no citoplasma. Por exemplo, os pesquisadores têm sido capazes de obter insights sobre a ligação da proteína SARS-CoV-2 Spike na superfície do virion à enzima conversor de angiotensina humana 2 (hACE2) na superfície das células humanas, internalização subsequente via fusão na membrana plasmática e endocitose do complexo de proteína Spike:hACE24,5. Grandes insights também foram obtidos na saída do SARS-CoV-2 das células através do lisosome usando imagens de fluorescência celular, uma característica única de coronavírus previamente pensados para ocorrer através da vesícula tradicional brotando do Golgi, como é com muitos outros vírus6. Um dos pilares de quase todos os aspectos da pesquisa biológica, a técnica de microscopia de fluorescência celular tem necessariamente avançado em sua amplitude e escopo de aplicações desde imagens de super-resolução de animais inteiros até imagens multi-paramétricas automatizadas de alto conteúdo para triagem de medicamentos. Aqui, a microscopia confocal automatizada de alto conteúdo é aplicada ao estudo da entrada de células SARS-CoV-2 usando QDs fluorescentes conjugados à proteína do pico viral.
A análise de alto teor de imagens geradas por plataformas de imagem biológica permite maior extração de insights biológicos valiosos do que parâmetros únicos, como a intensidade de todo-poço, que se obteria usando um leitor de placas multimodal7. Ao separar os objetos em um campo de visão usando algoritmos automatizados de segmentação, cada objeto ou uma população de objetos pode ser analisado para parâmetros como intensidade, área e textura em cada canal de fluorescência disponível8. Combinar muitas medidas em conjuntos de dados multivariados é uma abordagem útil para perfis fenotípicos. Quando o fenótipo desejado é conhecido, como a internalização de QD na forma de puncta, pode-se usar as medidas relacionadas a puncta, como tamanho, número e intensidade para avaliar a eficácia de um tratamento.
O software de análise de imagens de alto conteúdo baseado em nuvem pode acomodar uma grande variedade de saídas de dados de instrumentos, incluindo a plataforma de imagem de alto conteúdo. Usando um servidor baseado em nuvem para armazenamento de imagens e análise on-line, o usuário é capaz de carregar seus dados do instrumento de imagem ou da unidade de rede onde os dados são armazenados. A parte de análise do protocolo é conduzida dentro do ambiente de software em nuvem, e os dados podem ser exportados em uma variedade de formatos de arquivo para visualização de dados a jusante.
O vírus SARS-CoV-2 é composto por proteínas não estruturais e estruturais que auxiliam em sua montagem e replicação. O pico SARS-CoV-2 possui dois domínios chamados S1 e S2, com S1 contendo o domínio de ligação receptor responsável pelas interações hACE2 na membrana plasmática9. O pico também foi encontrado para interagir com outras moléculas na membrana plasmática que podem atuar como co-receptores, além de hACE210,11. Ao longo da sequência de proteína de pico e particularmente na interface S1/S2, existem locais de decote protease que permitem fusão na membrana após a protease de serina transmembrana 2 (TMPRSS2)12. Várias proteínas sars-cov-2 spike recombinantes foram produzidas a partir de domínios individuais de ligação de receptores, para S1, S2, S1 com S2, e aparadores de pico inteiros de vários fornecedores comerciais para uso em atividades de pesquisa13.
Neste trabalho, a superfície dos QDs foi funcionalizada com aparadores de espigão recombinantes que contêm uma tag histidina (QD-Spike). Os QDs produzidos pela Seção de Nanomateriais Ópticos do Laboratório de Pesquisa Naval contêm um núcleo de selenida de cádmio e um shell de sulfeto de zinco14,15. O zinco na superfície QD coordena os resíduos de histidina dentro da proteína recombinante para formar um QD funcionalizado que se assemelha a uma partícula viral SARS-CoV-2 em forma e função. A geração das nanopartículas e conjugação de proteínas foi descrita anteriormente usando o domínio de ligação do receptor conjugado QD15. Este método descreve as preparações de cultura celular, tratamento de QD, aquisição de imagens e protocolo de análise de dados que podem orientar um pesquisador no estudo da atividade sars-cov-2 no contexto fisiológico de uma célula humana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

O desenvolvimento de novas tecnologias para microscopia de fluorescência celular facilitou métodos de triagem de alto rendimento para a descoberta de drogas. Pontos quânticos são nanopartículas fluorescentes com excelentes propriedades fotofísicas imbuídas de fotoluminescência brilhante e estável, bem como faixas de emissão estreitas. Os pontos quânticos são esféricos em forma, e com a modificação adequada da química da superfície, podem ser usados para conjugar biomoléculas para aplicações celulares. Essas propriedades ópticas, combinadas com a capacidade de funcionalizá-las com biomoléculas, as tornam uma excelente ferramenta para investigar interações receptor-ligantes e tráfico celular. Aqui, apresentamos um método que usa pontos quânticos para rastrear a ligação e a endocitose da proteína de pico SARS-CoV-2. Este protocolo pode ser usado como um guia para experimentalistas que procuram utilizar pontos quânticos para estudar interações proteína-proteína e tráfico no contexto da fisiologia celular.

Após o tratamento, os QDs serão internalizados, pois a nanopartícula se ligará ao ACE2 na membrana plasmática e induzirá a endocitose. Usando uma linha celular de expressão ACE2-GFP, a translocação de QDs e ACE2 pode ser visualizada usando microscopia de fluorescência. Uma vez internalizados, os dois sinais QD e ACE2 mostram forte colocalização. A partir dessas imagens, a segmentação de imagens e a análise subsequente podem ser realizadas para extrair parâmetros relevantes, como contagem de pontos (<stron...

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High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

Neste protocolo, os pontos quânticos conjugados ao pico SARS-CoV-2 recombinante permitem que ensaios baseados em células monitorem a ligação de espigão para hACE2 na membrana plasmática e a endocitose subsequente das proteínas ligadas ao citoplasma.

Imagem confocal de alta taxa de imagem confocal de sars-cov-2 trimers de pico conjugados de alta throughput para rastrear a vinculação e a endocitose em células HEK293T

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Estabelecemos uma tecnologia de plataforma para SARS COVID 2 que pode ser aplicável a outros vírus com reconhecimento celular mediado de Spike e entrada como o primeiro passo na infecção viral celular. Os pontos quânticos são brilhantes, estáveis, e sua superfície pode ser funcionalizada para uma variedade de aplicações celulares. Usando este método, podemos visualizar e medir a internalização do Spike nas células.Para preparar 0,1%BSA. Adicione 130 microliters de 7,5% BSA a 10 mililitros de mídia de imagem em mistura. Para uma diluição serial de 6,1 a três e triplicado adicione 14,26 microliters de QD Spike a 285,74 microliters do BSA de 0,1% para fazer a maior concentração de 20 nanomole.Em seguida, adicione 100 microliters de 20 nanomole ou QD Spike a 200 microliters de 0,1%BSA para fazer a segunda ilusão de 6,67 nanomole QD Spike. Remova todas as mídias gastas de cada poço com um aspirador multicanal, lave uma vez com uma pipeta multicanal com 100 microliters de mídia de imagem por poço, depois aspire 100 microliters da mídia de imagem. Adicione 50 microliters de solução QD Spike por poço e incubar a placa por três horas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono.Usando equipamentos de proteção, prepare 4%PFA e 0,1% DE MÍDIA DE IMAGEM PSA dentro de um gabinete de bio segurança estéril, aspire 50 microliters de QD Spike de cada poço e adicione 100 microliters de 4%PFA por poço com uma pipeta multicanal automatizada para evitar a secagem dos poços. Incubar por 15 minutos à temperatura ambiente, depois lavar três vezes com PBS, preparar o corante nuclear vermelho profundo diluindo a solução de estoque de cinco milímetros em um a 1000 em PBS, aspirar o PBS e adicionar de volta 50 microliters de corante nuclear diluído por poço. Incubar por 30 minutos à temperatura ambiente e depois lavar três vezes com PBS, imagear a placa ou selá-la usando um selador de placas para imagem posteriormente.Guarde a placa a quatro graus Celsius. Inicie o software para a plataforma de imagem. Depois de fazer login na plataforma de imagem criar um novo protocolo de aquisição selecionando o tipo de placa como uma placa de imagem inferior transparente de parede 96, selecione o modo óptico se tornou focal e ampliação como 40 vezes imersão em água, selecione binning como um.Selecione o modo para contrastes faciais digitais, como alto contraste para produzir corpos celulares bem definidos. Tire um instantâneo para confirmar que este título é apropriado, como visto na janela de imagem, selecione o canal fit C para uso com a linha celular ACE2-GFP para visualizar o tráfico DE ACE2 dentro da célula. Para fazer um canal QD personalizado, selecione o menu suspenso do triângulo e escolha a excitação na faixa de 405 nanômetros na faixa de 608 nanômetros, selecione um poço com um robusto sinal QD citoplasmico para definir o tempo de exposição, a potência do laser e a posição de altura Z.Verifique se a altura padrão produz uma imagem das células no plano focal desejado. A posição Z será menor para a puncta de endócitose do que a posição Z para a membrana plasmática. Escolha um tempo de exposição, tipicamente entre 100 e 300 milissegundos que produz uma imagem brilhante com níveis cinzentos, pelo menos três vezes maior que o sinal de fundo.A 20 nanomole os níveis cinzentos devem ser aproximadamente 6.000 unidades atômicas com 200 milissegundos de tempo de exposição e 80% de potência laser. Verifique os níveis cinzentos clicando à direita na imagem produzida com o recurso de instantâneo em cada canal e selecionando a intensidade do show, em seguida, clique no objeto de interesse ou plano de fundo para ver o nível cinza para esse pixel, ajuste a potência laser para ajustar a intensidade dos objetos de interesse. Salve o protocolo de aquisição, mude para executar o experimento e digite o nome da placa, execute o experimento.A translocação de QDs e ACE2 foi visualizada utilizando microscopia de fluorescência e uma linha celular expressa de ACE2-GFP. A segmentação de imagens e análises subsequentes foram realizadas para extrair parâmetros relevantes, como contagem de manchas. Primeiro, os núcleos foram segmentados a partir do canal de marcadores nucleares para criar uma população de ROI.Em seguida, uma região de ROI delineando a célula com segmentação usando o canal ACE2-GFP. Por fim, os pontos de pico QD 608 foram segmentados a partir da região do ROI celular, os sinais de QD internalizado e ACE2 mostraram forte co-localização. Um experimento de resposta de concentração com seis concentrações diferentes de QD Spike foi realizado em células HEK 293T.Determinando concentrações ópticas de QD, QDS pode ser usado tão baixo quanto 2,22 nanomole, no entanto, recomenda-se usar concentrações de 10 nanomole ou superior para garantir uma resposta robusta. Durante a conjugação para a agregação de proteína qd pode ocorrer. Agregados foram detectados na solução QD como precipitados brilhantes e células HEK 293T, QDs foram incubados com anticorpos neutralizados a partir de 30 microgramas por microliter antes da adição às células, esses anticorpos bloquearam a internalização de ligação e causaram uma redução na contagem de manchas em comparação com células tratadas apenas com QD.Este ensaio também pode ser usado para triagem de alto rendimento, avaliação de chumbo de anticorpos neutralizantes para identificar antivirais de trocadilhos para a entrada viral do bloco e ser adaptado para estudar variantes recém-emergentes.

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