Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

Это исследование было частично поддержано Программой внутренних исследований Национального центра продвижения трансляционных наук, NIH. Военно-морская исследовательская лаборатория предоставила финансирование через свой внутренний Институт нанонауки. Препарат реагентов поддерживался через базовый фонд NRL COVID-19.

Клеточная линия HEK293T, используемая в этом исследовании, является увековеченной клеточной линией. В этом исследовании не использовались ни люди, ни животные.
1. Культивирование и посев клеток
<ol><li>Внутри кабинета стерильной биобезопасности, в средствах индивиду?...

<ol>
	<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Lysosomes+in+Live+Cells+with+LysoTracker.">Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments.">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li><li>Barroso, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots+in+cell+biology.">Quantum dots in cell biology.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).</li><li>Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACE2:+Evidence+of+role+as+entry+receptor+for+SARS-CoV-2+and+implications+in+comorbidities.">ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities.</a> eLife. 9, 61390 (2020).</li><li>Shang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+mechanisms+of+SARS-CoV-2.">Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).</li><li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Coronaviruses+use+lysosomes+for+egress+instead+of+the+biosynthetic+secretory+pathway.">&#946;-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway.</a> Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).</li><li>Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+guidelines+for+image-based+high+content+screening,+high+content+analysis+and+high+content+imaging.">Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+profiling+for+drug+discovery:+due+for+a+machine-learning+upgrade.">Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).</li><li>Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+properties+of+SARS-CoV-2+spike+protein:+potential+antivirus+drug+development+for+COVID-19.">Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+spike+protein+interacts+with+multiple+innate+immune+receptors.">SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors.</a> bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+assists+SARS-CoV-2+in+cell+entry+and+can+be+targeted+by+approved+drugs+in+vitro.">Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro.</a> Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+Is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+conformational+states+of+SARS-CoV-2+spike+protein.">Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein.</a> Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).</li><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+cellular+toxicity+for+cadmium-containing+quantum+dots.">Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots.</a> Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).</li><li>Gorshkov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-conjugated+SARS-CoV-2+spike+pseudo-virions+enable+tracking+of+angiotensin+Converting+enzyme+2+binding+and+endocytosis.">Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis.</a> ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).</li><li>Narayanan, S. S., Pal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+CdS+quantum+dots:+Host+of+biomolecular+ligands.">Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+together+with+virus+receptor+ACE2.">Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2.</a> Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).</li><li>Hildebrandt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer+with+semiconductor+quantum+dot+bioconjugates:+A+versatile+platform+for+biosensing,+energy+harvesting,+and+other+developing+applications.">Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications.</a> Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).</li></ol>

Метод, описанный в этой статье, обеспечивает необходимые шаги для визуализации функционализированных QD в клетках человека с использованием высокопроизводительной конфокальной микроскопии. Этот метод лучше всего подходит для клеток, где эндоцитоз является основным путем проникновен...

Флуоресцентная микроскопия позволяет исследователям заглянуть во внутреннюю работу клетки, используя специализированные красители1, генетически закодированные флуоресцентные белки2 и флуоресцентные наночастицы в виде квантовых точек (QD)3. Для глобальной пандемии коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома 2019 года (SARS-CoV-2) исследователи использовали флуоресцентную микроскопию, чтобы понять, как вирус взаимодействует с клеткой как на плазматической мембране, так и в цитоплазме. Например, исследователи смогли получить представление о связывании белка SARS-CoV-2 Spike на поверхности вириона с человеческим ангиотензинпревращающим ферментом 2 (hACE2) на поверхности клеток человека, последующей интернализацией через слияние на плазматической мембране и эндоцитозом белкового комплекса Spike: hACE24,5. Также было получено большое понимание выхода SARS-CoV-2 из клеток через лизосому с использованием клеточной флуоресцентной визуализации, уникальной особенности коронавирусов, которые, как ранее считалось, происходят через традиционное пузырьковое почкование из Гольджи, как и со многими другими вирусами6. Являясь основой почти всех аспектов биологических исследований, метод клеточной флуоресцентной микроскопии обязательно продвинулся в своей широте и области применения от визуализации со сверхвысоким разрешением целых животных до автоматизированной многопараметрической визуализации с высоким содержанием для скрининга лекарств. Здесь автоматизированная конфокальная микроскопия с высоким содержанием применяется для исследования проникновения в клетки SARS-CoV-2 с использованием флуоресцентных QD, конъюгированных с вирусным спайковым белком.
Анализ изображений с высоким содержанием, генерируемых платформами биологической визуализации, позволяет получить большую ценную биологическую информацию, чем отдельные параметры, такие как интенсивность всей скважины, которые можно было бы получить с помощью мультимодального считывателя пластин7. Разделяя объекты в поле зрения с помощью автоматизированных алгоритмов сегментации, каждый объект или совокупность объектов могут быть проанализированы по таким параметрам, как интенсивность, площадь и текстура в каждом доступном флуоресцентном канале8. Объединение многих измерений в многомерные наборы данных является полезным подходом для фенотипического профилирования. Когда желаемый фенотип известен, например, интернализация QD в форме пункты, можно использовать измерения, связанные с пунктой, такие как размер, количество и интенсивность, для оценки эффективности лечения.
Облачное программное обеспечение для анализа изображений с высоким содержанием может вместить большое разнообразие выходных данных приборов, включая платформу обработки изображений с высоким содержанием. Используя облачный сервер для хранения изображений и онлайн-анализа, пользователь может загружать свои данные либо с инструмента обработки изображений, либо с сетевого диска, на котором хранятся данные. Аналитическая часть протокола проводится в облачной программной среде, и данные могут быть экспортированы в различные форматы файлов для последующей визуализации данных.
Вирус SARS-CoV-2 состоит из неструктурных и структурных белков, которые помогают в его сборке и репликации. Спайк SARS-CoV-2 имеет два домена, называемых S1 и S2, причем S1 содержит рецептор-связывающий домен, ответственный за взаимодействия hACE2 в плазматической мембране9. Также было обнаружено, что Спайк взаимодействует с другими молекулами плазматической мембраны, которые могут действовать как корецепторы в дополнение к hACE210,11. По всей последовательности спайкового белка и особенно на границе раздела S1/S2 существуют участки расщепления протеазы, которые позволяют сращиваться на мембране после трансмембранной сериновой протеазы 2 (TMPRSS2)12. Различные рекомбинантные белки SARS-CoV-2 Spike были получены из отдельных рецепторсвязывающих доменов до S1, S2, S1 с S2 и целых тримеров шипов от нескольких коммерческих поставщиков для использования в исследовательской деятельности13.
В этой работе поверхность QD была функционализирована рекомбинантными шиповыми тримерами, которые содержат гистидиновую метку (QD-Spike). QD, производимые Отделом оптических наноматериалов Военно-морской исследовательской лаборатории, содержат ядро селенида кадмия и оболочку сульфида цинка14,15. Цинк на поверхности QD координирует остатки гистидина в рекомбинантном белке, образуя функционализированный QD, который по форме и функции напоминает вирусную частицу SARS-CoV-2. Генерация наночастиц и конъюгация белка были ранее описаны с использованием QD-конъюгированного рецепторсвязывающего домена15. Этот метод описывает препараты клеточной культуры, лечение QD, сбор изображений и протокол анализа данных, которые могут направлять исследователя в изучении активности SARS-CoV-2 Spike в физиологическом контексте клетки человека.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

Разработка новых технологий клеточной флуоресцентной микроскопии облегчила высокопроизводительные методы скрининга для открытия лекарств. Квантовые точки представляют собой флуоресцентные наночастицы с отличными фотофизическими свойствами, проникнутыми яркой и стабильной фотолюминесценцией, а также узкими эмиссионными полосами. Квантовые точки имеют сферическую форму и при правильной модификации химического состава поверхности могут использоваться для сопряжения биомолекул для клеточных применений. Эти оптические свойства в сочетании со способностью функционализировать их с биомолекулами делают их отличным инструментом для исследования рецептор-лигандных взаимодействий и клеточного трафика. Здесь мы представляем метод, который использует квантовые точки для отслеживания связывания и эндоцитоза спайкового белка SARS-CoV-2. Этот протокол может быть использован в качестве руководства для экспериментаторов, желающих использовать квантовые точки для изучения белково-белковых взаимодействий и торговли в контексте клеточной физиологии.

После лечения QD будут интернализованы, поскольку наночастица будет связываться с ACE2 на плазматической мембране и индуцировать эндоцитоз. Используя ACE2-GFP экспрессирующую клеточную линию, транслокация как QD, так и ACE2 может быть визуализирована с помощью флуоресцентной микроскопии. Посл...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

В этом протоколе квантовые точки, конъюгированные с рекомбинантным всплеском SARS-CoV-2, позволяют клеточным анализам контролировать связывание шипов с hACE2 на плазматической мембране и последующий эндоцитоз связанных белков в цитоплазму.

Высокопроизводительная конфокальная визуализация квантовых точек-конъюгированных пиковых тримеров SARS-CoV-2 для отслеживания связывания и эндоцитоза в клетках HEK293T

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Мы создали технологию платформы для SARS COVID 2, которая может быть применима к другим вирусам с опосредованным Spike распознаванием клеток и проникновением в качестве первого шага в клеточной вирусной инфекции. Квантовые точки яркие, стабильные, и их поверхность может быть функционализирована для различных клеточных применений. Используя этот метод, мы можем визуализировать и измерить интернализацию Спайка в клетках.Приготовить 0,1% BSA. Добавьте 130 микролитров 7,5% BSA к 10 миллилитрам носителей изображений в смеси. Для последовательного разбавления от 6,1 до трех и трех частей добавьте 14,26 микролитров QD Spike к 285,74 микролитрам 0,1% BSA, чтобы получить самую высокую концентрацию 20 наномолей.Затем добавьте 100 микролитров 20 наномолей или QD Spike к 200 микролитрам 0,1% BSA, чтобы сделать второй бред 6,67 наномолей QD Spike. Удалите все отработанные среды из каждой скважины с помощью многоканального аспиратора, промыть один раз многоканальной пипеткой со 100 микролитрами среды визуализации на лунку, затем аспирировать 100 микролитров носителя изображения. Добавьте обратно 50 микролитров раствора QD Spike на лунку и инкубируйте пластину в течение трех часов в увлажненном инкубаторе при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом.Надев защитное снаряжение, подготовьте среду визуализации 4% PFA и 0,1% PSA внутри стерильного шкафа биобезопасности, аспирируйте 50 микролитров QD Spike из каждой скважины и добавьте 100 микролитров 4% PFA на скважину с помощью автоматизированной многоканальной пипетки, чтобы избежать сушки скважин. Инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре, затем трижды промыть PBS, приготовить темно-красный ядерный краситель, разбавив пятимиллиметровый раствор при одном до 1000 в PBS, аспирировать PBS и добавить обратно 50 микролитров разбавленного ядерного красителя на лунку. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, затем трижды промывайте PBS, визуализируйте пластину или запечатывайте ее с помощью герметика пластин для последующего получения изображения.Храните пластину при четырех градусах Цельсия. Запустите программное обеспечение для платформы обработки изображений. После регистрации в платформе визуализации создайте новый протокол сбора, выбрав тип пластины в качестве 96-настенной прозрачной нижней пластины изображения, выберите оптический режим, который стал фокусным, а увеличение в 40 раз - погружением в воду, выберите биннинг как один.Выберите режим для цифровых контрастов лиц, таких как высокая контрастность, чтобы создать четко определенные тела клеток. Сделайте снимок, чтобы убедиться, что этот заголовок подходит, как показано в окне изображения, выберите подходящий канал C для использования с линией ячейки ACE2-GFP, чтобы визуализировать трафик ACE2 внутри ячейки. Чтобы создать пользовательский канал QD, выберите выпадающее меню треугольника и выберите возбуждение в диапазоне излучения 405 нанометров в диапазоне 608 нанометров, выберите скважину с надежным цитоплазматическим сигналом QD, чтобы установить время экспозиции, мощность лазера и положение высоты Z.Проверьте, создает ли высота по умолчанию изображение ячеек в нужной фокальной плоскости. Положение Z будет ниже для эндоцитозной пункты, чем положение Z для плазматической мембраны. Выберите время экспозиции, обычно от 100 до 300 миллисекунд, которое создает яркое изображение с уровнями серого, по крайней мере, в три раза превышающими фоновый сигнал.При 20 наномоле уровни серого должны составлять примерно 6 000 атомных единиц с временем экспозиции 200 миллисекунд и мощностью лазера 80%. Проверьте уровни серого, щелкнув правой кнопкой мыши на изображении, полученном с функцией снимка в каждом канале и выбрав интенсивность шоу, затем щелкните левой кнопкой мыши на интересующем объекте или фоне, чтобы просмотреть уровень серого для этого пикселя, отрегулируйте мощность лазера для точной настройки интенсивности интересующих объектов. Сохраните протокол сбора, переключитесь на запуск эксперимента и введите имя пластины, запустите эксперимент.Транслокация как QD, так и ACE2 была визуализирована с использованием флуоресцентной микроскопии и ACE2-GFP экспрессирующей клеточной линии. Сегментация изображения и последующий анализ выполнялись для извлечения соответствующих параметров, таких как количество пятен. Во-первых, ядра были сегментированы из канала ядерного маркера для создания популяции ROI.Затем область ROI, очерчивающая ячейку с сегментированием с использованием канала ACE2-GFP. Наконец, точки всплеска QD 608 были сегментированы из области ROI клеток, интернализованные сигналы QD и ACE2 показали сильную колокализацию. Эксперимент по концентрационному ответу с шестью различными концентрациями QD Spike проводился в клетках HEK 293T.При определении оптических концентраций QD, QDS можно использовать до 2,22 наномолей, однако рекомендуется использовать концентрации 10 наномолей или выше для обеспечения надежного отклика. Во время конъюгации с QD может произойти агрегация белка. Агрегаты были обнаружены в растворе QD в виде ярких слипшихся осадков и клеток HEK 293T, QD инкубировали с нейтрализованными антителами, начиная с 30 микрограммов на микролитр перед добавлением к клеткам, эти антитела блокировали интернализацию связывания и вызывали снижение количества пятен по сравнению с клетками, обработанными только QD.Это эссе также может быть использовано для высокопроизводительного скрининга, проведения оценки нейтрализующих антител для выявления каламбурных противовирусных препаратов к блоку вирусного проникновения и адаптировано для изучения вновь возникающих вариантов.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Флуоресценции на основе измерения магазин управлением поступления кальция в живых клетках: от искусственного раковых клеток в скелетных мышечных волокон

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Анализ связывания Высокая пропускная МНС II для количественного анализа пептидных эпитопов

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Высокопроизводительный скрининг для химических модуляторов посттранскрипционно регулируемых генов

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Применение pHluorin для количественного, Kinetic и высокой пропускной способностью анализа эндоцитоза у почкующихся дрожжей

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Использование живых изображений для ядер трек во время Myoblast дифференциация и фьюжн

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Высокая пропускная способность Live Imaging микроколоний для измерения неоднородности в росте и экспрессии генов

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Двухэтапные протоколы капельной цифровой ПЦР с обратной транскрипцией для обнаружения и количественного определения SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Анализ городской среды - трубопровод для отбора проб и обнаружения SARS-CoV-2 из экологических резервуаров

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

Высокопроизводительная платформа для культуры и 3D-визуализации органоидов

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

Характеристика переносчиков цинка млекопитающих с помощью анализа транспорта цинка in vitro

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...