Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada en parte por el Programa de Investigación Intramuros del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, NIH. El Laboratorio de Investigación Naval proporcionó fondos a través de su Instituto de Nanociencia interno. La preparación de reactivos se apoyó a través del fondo base NRL COVID-19.

La línea celular HEK293T utilizada en este estudio es una línea celular inmortalizada. No se utilizaron sujetos humanos o animales en este estudio.
1. Cultivo y siembra celular
<ol><li>Dentro de un gabinete de bioseguridad estéril, usando equipo de protección personal (incluidos guantes de laboratorio, bata de laboratorio y gafas de seguridad), prepare el medio de cultivo celular complementando el Medio Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco con suero bovino fetal (FBS) a...

<ol>
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S., Pal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+CdS+quantum+dots:+Host+of+biomolecular+ligands.">Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+together+with+virus+receptor+ACE2.">Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2.</a> Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).</li><li>Hildebrandt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer+with+semiconductor+quantum+dot+bioconjugates:+A+versatile+platform+for+biosensing,+energy+harvesting,+and+other+developing+applications.">Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications.</a> Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).</li></ol>

El método descrito en este artículo proporciona los pasos necesarios para obtener imágenes de QD funcionalizados en células humanas mediante microscopía confocal de alto rendimiento. Este método es más adecuado para las células donde la endocitosis es la principal vía de entrada viral en lugar de la actividad de TMPRSS2 y la fusión de membrana, ya que permite el estudio de la endocitosis del pico del SARS-CoV-2 y la endocitosis hACE2. Debido a la naturaleza del modelo QD y la etiqueta C-terminal His-tag en el t...

La microscopía de fluorescencia permite a los investigadores observar el funcionamiento interno de la célula utilizando colorantes especializados1, proteínas fluorescentes codificadas genéticamente2 y nanopartículas fluorescentes en forma de puntos cuánticos (QD)3. Para la pandemia mundial del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo de 2019 (SARS-CoV-2), los investigadores han empleado la microscopía de fluorescencia para comprender cómo el virus interactúa con la célula tanto en la membrana plasmática como en el citoplasma. Por ejemplo, los investigadores han podido obtener información sobre la unión de la proteína Espiga del SARS-CoV-2 en la superficie del virión a la enzima convertidora de angiotensina humana 2 (hACE2) en la superficie de las células humanas, la internalización posterior a través de la fusión en la membrana plasmática y la endocitosis del complejo proteico Spike:hACE24,5. También se han obtenido grandes conocimientos sobre la salida del SARS-CoV-2 de las células a través del lisosoma utilizando imágenes de fluorescencia celular, una característica única de los coronavirus que anteriormente se pensaba que ocurrían a través de la vesícula tradicional que brota del Golgi, como ocurre con muchos otros virus6. Un pilar de casi todos los aspectos de la investigación biológica, la técnica de microscopía de fluorescencia celular ha avanzado necesariamente en su amplitud y alcance de aplicaciones, desde imágenes de superresolución de animales enteros hasta imágenes multiparamétricas automatizadas de alto contenido para la detección de drogas. Aquí, la microscopía confocal automatizada de alto contenido se aplica al estudio de la entrada de células del SARS-CoV-2 utilizando QD fluorescentes conjugados con la proteína espiga viral.
El análisis de alto contenido de las imágenes generadas por las plataformas de imágenes biológicas permite una mayor extracción de valiosos conocimientos biológicos que los parámetros individuales, como la intensidad de todo el pozo, que se obtendría utilizando un lector de placas multimodal7. Al separar los objetos en un campo de visión utilizando algoritmos de segmentación automatizados, cada objeto o una población de objetos se puede analizar en busca de parámetros como la intensidad, el área y la textura en cada canal de fluorescencia disponible8. La combinación de muchas mediciones en conjuntos de datos multivariados es un enfoque útil para la elaboración de perfiles fenotípicos. Cuando se conoce el fenotipo deseado, como la internalización de QD en forma de puntcta, se pueden usar las mediciones relacionadas con puncta como el tamaño, el número y la intensidad para evaluar la eficacia de un tratamiento.
El software de análisis de imágenes de alto contenido basado en la nube puede acomodar una gran variedad de salidas de datos de instrumentos, incluida la plataforma de imágenes de alto contenido. Mediante el uso de un servidor basado en la nube para el almacenamiento de imágenes y el análisis en línea, el usuario puede cargar sus datos desde el instrumento de imágenes o desde la unidad de red donde se almacenan los datos. La parte de análisis del protocolo se lleva a cabo dentro del entorno de software en la nube, y los datos se pueden exportar en una variedad de formatos de archivo para la visualización de datos posteriores.
El virus SARS-CoV-2 está compuesto por proteínas no estructurales y no estructurales que ayudan en su ensamblaje y replicación. El pico del SARS-CoV-2 tiene dos dominios llamados S1 y S2, con S1 que contiene el dominio de unión al receptor responsable de las interacciones hACE2 en la membrana plasmática9. También se ha encontrado que Spike interactúa con otras moléculas en la membrana plasmática que pueden actuar como co-receptores además de hACE210,11. A lo largo de la secuencia de proteínas espiga y particularmente en la interfaz S1/S2, hay sitios de escisión de la proteasa que permiten la fusión en la membrana después de la serina proteasa transmembrana 2 (TMPRSS2)12. Se han producido varias proteínas recombinantes de pico de SARS-CoV-2 a partir de dominios de unión a receptores individuales, a S1, S2, S1 con S2 y trímeros de pico enteros de múltiples proveedores comerciales para su uso en actividades de investigación13.
En este trabajo, la superficie de los QD se funcionalizó con trímeros de pico recombinantes que contienen una etiqueta de histidina (QD-Spike). Los QD producidos por la Sección de Nanomateriales Ópticos del Laboratorio de Investigación Naval contienen un núcleo de seleniuro de cadmio y una carcasa de sulfuro de zinc14,15. El zinc en la superficie QD coordina los residuos de histidina dentro de la proteína recombinante para formar un QD funcionalizado que se asemeja a una partícula viral del SARS-CoV-2 en forma y función. La generación de las nanopartículas y la conjugación de proteínas se describió previamente utilizando el dominio de unión al receptor conjugado QD15. Este método describe las preparaciones de cultivo celular, el tratamiento QD, la adquisición de imágenes y el protocolo de análisis de datos que pueden guiar a un investigador en el estudio de la actividad del pico del SARS-CoV-2 en el contexto fisiológico de una célula humana.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

El desarrollo de nuevas tecnologías para la microscopía de fluorescencia celular ha facilitado métodos de detección de alto rendimiento para el descubrimiento de fármacos. Los puntos cuánticos son nanopartículas fluorescentes con excelentes propiedades fotofísicas imbuidas de fotoluminiscencia brillante y estable, así como de bandas de emisión estrechas. Los puntos cuánticos son de forma esférica, y con la modificación adecuada de la química de la superficie, se pueden utilizar para conjugar biomoléculas para aplicaciones celulares. Estas propiedades ópticas, combinadas con la capacidad de funcionalizarlas con biomoléculas, las convierten en una excelente herramienta para investigar las interacciones receptor-ligando y el tráfico celular. Aquí, presentamos un método que utiliza puntos cuánticos para rastrear la unión y endocitosis de la proteína espiga del SARS-CoV-2. Este protocolo se puede utilizar como una guía para los experimentalistas que buscan utilizar puntos cuánticos para estudiar las interacciones proteína-proteína y el tráfico en el contexto de la fisiología celular.

Tras el tratamiento, los QD se internalizarán ya que la nanopartícula se unirá a ACE2 en la membrana plasmática e inducirá endocitosis. Utilizando una línea celular que expresa ACE2-GFP, la translocación de QDs y ACE2 se puede visualizar utilizando microscopía de fluorescencia. Una vez internalizadas, las dos señales QD y ACE2 muestran una fuerte colocalización. A partir de estas imágenes, se puede realizar la segmentación de imágenes y el análisis posterior para extraer parámetros relevantes como el recue...

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High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

En este protocolo, los puntos cuánticos conjugados con el pico recombinante del SARS-CoV-2 permiten que los ensayos basados en células monitoreen la unión del pico a hACE2 en la membrana plasmática y la posterior endocitosis de las proteínas unidas al citoplasma.

Imágenes confocales de alto rendimiento de trímeros de púas de SARS-CoV-2 conjugados con puntos cuánticos para rastrear la unión y la endocitosis en células HEK293T

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Hemos establecido una tecnología de plataforma para SARS COVID 2 que puede ser aplicable a otros virus con el reconocimiento y la entrada de células mediadas por Spike como el primer paso en la infección viral celular. Los puntos cuánticos son brillantes, estables y su superficie se puede funcionalizar para una variedad de aplicaciones celulares. Usando este método, podemos visualizar y medir la internalización de Spike en las células.Preparar 0.1%BSA. Agregue 130 microlitros de 7.5% BSA a 10 mililitros de medios de imagen en mezcla. Para una dilución en serie de 6.1 a tres y triplicado, agregue 14.26 microlitros de QD Spike a 285.74 microlitros del 0.1% BSA para hacer la concentración más alta de 20 nanomoles.Luego agregue 100 microlitros de 20 nanomoles o QD Spike a 200 microlitros de 0.1% BSA para hacer el segundo engaño de 6.67 nanomoles QD Spike. Retire todos los medios gastados de cada pozo con un aspirador multicanal, lave una vez con una pipeta multicanal con 100 microlitros de medios de imagen por pozo, luego aspire 100 microlitros del medio de imagen. Agregue 50 microlitros de solución QD Spike por pozo e incube la placa durante tres horas en una incubadora humidificada a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.Usando equipo de protección, prepare medios de imágenes 4% PFA y 0.1% PSA dentro de un gabinete de bioseguridad estéril, aspire 50 microlitros de QD Spike de cada pozo y agregue 100 microlitros de 4% PFA por pozo con una pipeta multicanal automatizada para evitar el secado de los pozos. Incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente, luego lavar tres veces con PBS, preparar el tinte nuclear de color rojo intenso diluyendo la solución madre de cinco milímetros de uno a 1000 en PBS, aspirar el PBS y agregar 50 microlitros de tinte nuclear diluido por pozo. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego lavar tres veces con PBS, obtener una imagen de la placa o sellarla con un sellador de placas para obtener imágenes más tarde.Guarde el plato a cuatro grados centígrados. Inicie el software para la plataforma de imágenes. Después de iniciar sesión en la plataforma de imágenes, cree un nuevo protocolo de adquisición seleccionando el tipo de placa como una placa de imagen inferior transparente de 96 paredes, el modo óptico seleccionado se ha centrado y la ampliación como 40 veces la inmersión en agua, seleccione el binning como uno.Seleccione el modo para contrastes faciales digitales, como alto contraste, para producir cuerpos celulares bien definidos. Tome una instantánea para confirmar que este encabezado es apropiado como se ve en la ventana de la imagen, seleccione el canal C adecuado para usar con la línea celular ACE2-GFP para visualizar el tráfico ace2 dentro de la celda. Para hacer un canal QD personalizado, seleccione el menú desplegable del triángulo y elija la excitación en el rango de 405 nanómetros en emisión en el rango de 608 nanómetros, seleccione un pozo con una señal QD citoplasmática robusta para establecer el tiempo de exposición, la potencia del láser y la posición de altura Z.Compruebe si la altura predeterminada produce una imagen de las celdas en el plano focal deseado. La posición Z será más baja para la endocita puntiaguda que la posición Z para la membrana plasmática. Elija un tiempo de exposición, generalmente entre 100 y 300 milisegundos que produzca una imagen brillante con niveles de gris, al menos tres veces mayores que la señal de fondo.A 20 nanomoles, los niveles de gris deben ser de aproximadamente 6.000 unidades atómicas con un tiempo de exposición de 200 milisegundos y una potencia láser del 80%. Verifique los niveles de gris haciendo clic derecho en la imagen producida con la función de instantánea en cada canal y seleccionando la intensidad del espectáculo, luego haga clic izquierdo en el objeto de interés o fondo para ver el nivel de gris de ese píxel, ajuste la potencia del láser para ajustar la intensidad de los objetos de interés. Guarde el protocolo de adquisición, cambie para ejecutar el experimento e ingrese el nombre de la placa, ejecute el experimento.La translocación tanto de QDs como de ACE2 se visualizó mediante microscopía de fluorescencia y una línea celular de expresión de ACE2-GFP. Se realizó segmentación de imágenes y posterior análisis para extraer parámetros relevantes como el conteo de puntos. Primero, los núcleos se segmentaron del canal de marcadores nucleares para crear una población de ROI.A continuación, una región de ROI que describe la celda con segmentado utilizando el canal ACE2-GFP. Por último, los puntos de pico QD 608 se segmentaron de la región de ROI celular, las señales QD y ACE2 internalizadas mostraron una fuerte colocalización. Se realizó un experimento de respuesta de concentración con seis concentraciones diferentes de QD Spike en células HEK 293T.Al determinar las concentraciones ópticas de QD, QDS se puede usar tan bajo como 2.22 nanomoles, sin embargo, se recomienda usar concentraciones de 10 nanomoles o más para garantizar una respuesta robusta. Durante la conjugación a la agregación de proteínas QD puede ocurrir. Los agregados se detectaron en la solución de QD como precipitados agrupados brillantes y células HEK 293T, los QD se incubaron con anticuerpos neutralizados a partir de 30 microgramos por microlitro antes de la adición a las células, estos anticuerpos bloquearon la internalización de la unión y causaron una reducción en el recuento de puntos en comparación con las células tratadas solo con QD.Este ensayo también se puede utilizar para el cribado de alto rendimiento, la evaluación principal de anticuerpos neutralizantes para identificar antivirales de juego de palabras para bloquear la entrada viral y adaptarse para estudiar nuevas variantes emergentes.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

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Investigación

Biología

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High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

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Aplicaciones de pHluorin para cuantitativa, cinética y de alto rendimiento Análisis de la endocitosis de levadura en ciernes

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

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Explotando en la proyección de imagen a los núcleos de la pista durante la fusión y diferenciación de mioblastos

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