Name: high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells
Uploaded: 2022-04-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

Denna forskning stöddes delvis av Intramural Research Program vid National Center for Advanceing Translational Sciences, NIH. Naval Research Laboratory tillhandahöll finansiering via sitt interna nanovetenskapliga institut. Reagensberedningen stöddes via BASFONDEN NRL COVID-19.

Hek293T-cellinjen som används i denna studie är en odödlig cellinje. Inga försökspersoner på människa eller djur användes i denna studie.
1. Cellodling och sådd
<ol><li>Inuti ett sterilt biosäkerhetsskåp, med personlig skyddsutrustning (inklusive labbhandskar, labbrock och skyddsglasögon), förbered cellodlingsmedium genom att komplettera Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% fetalt bovinserum (FBS), 1% penicillin / streptomycin (P /S) och 250 μg / mL G...

<ol>
	<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+Lysosomes+in+Live+Cells+with+LysoTracker.">Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).</li><li>Mehta, S., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+activity+architectures+visualized-using+genetically+encoded+fluorescent+biosensors+to+map+the+spatial+boundaries+of+signaling+compartments.">Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments.</a> Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).</li><li>Barroso, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dots+in+cell+biology.">Quantum dots in cell biology.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).</li><li>Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACE2:+Evidence+of+role+as+entry+receptor+for+SARS-CoV-2+and+implications+in+comorbidities.">ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities.</a> eLife. 9, 61390 (2020).</li><li>Shang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+entry+mechanisms+of+SARS-CoV-2.">Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).</li><li>Ghosh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Coronaviruses+use+lysosomes+for+egress+instead+of+the+biosynthetic+secretory+pathway.">&#946;-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway.</a> Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).</li><li>Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+development+guidelines+for+image-based+high+content+screening,+high+content+analysis+and+high+content+imaging.">Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging.</a> Assay Guidance Manual. , (2012).</li><li>Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+profiling+for+drug+discovery:+due+for+a+machine-learning+upgrade.">Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).</li><li>Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+properties+of+SARS-CoV-2+spike+protein:+potential+antivirus+drug+development+for+COVID-19.">Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).</li><li>Gao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+spike+protein+interacts+with+multiple+innate+immune+receptors.">SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors.</a> bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+assists+SARS-CoV-2+in+cell+entry+and+can+be+targeted+by+approved+drugs+in+vitro.">Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro.</a> Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).</li><li>Hoffmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+cell+entry+depends+on+ACE2+and+TMPRSS2+and+Is+blocked+by+a+clinically+proven+protease+inhibitor.">SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor.</a> Cell. 181 (2), 271-280 (2020).</li><li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+conformational+states+of+SARS-CoV-2+spike+protein.">Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein.</a> Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).</li><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meta-analysis+of+cellular+toxicity+for+cadmium-containing+quantum+dots.">Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots.</a> Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).</li><li>Gorshkov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantum+dot-conjugated+SARS-CoV-2+spike+pseudo-virions+enable+tracking+of+angiotensin+Converting+enzyme+2+binding+and+endocytosis.">Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis.</a> ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).</li><li>Narayanan, S. S., Pal, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregated+CdS+quantum+dots:+Host+of+biomolecular+ligands.">Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+of+the+receptor-binding+domain+of+SARS-CoV+spike+protein+together+with+virus+receptor+ACE2.">Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2.</a> Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).</li><li>Hildebrandt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+transfer+with+semiconductor+quantum+dot+bioconjugates:+A+versatile+platform+for+biosensing,+energy+harvesting,+and+other+developing+applications.">Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications.</a> Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).</li></ol>

Metoden som beskrivs i den här artikeln ger de nödvändiga stegen för avbildning funktionella QDs i mänskliga celler med hjälp av hög-genomströmning confocal mikroskopi. Denna metod är bäst lämpad för celler där endocytos är huvudvägen för viral inmatning snarare än aktiviteten hos TMPRSS2 och membranfusion, eftersom det möjliggör studier av SARS-CoV-2 Spike och hACE2 endocytos. På grund av QD-modellens natur och C-terminalen His-tag på den kommersiellt tillgängliga Spike-trimern skulle alla TMPRSS2-...

Fluorescensmikroskopi gör det möjligt för forskare att kika in i cellens inre funktion med hjälp av specialiserade färgämnen1, genetiskt kodade fluorescerande proteiner2 och fluorescerande nanopartiklar i form av kvantprickar (QDs)3. För den allvarliga akuta respiratoriska syndromet coronaviruset 2019 (SARS-CoV-2) global pandemi har forskare använt fluorescensmikroskopi för att förstå hur viruset interagerar med cellen både vid plasmamembranet och i cytoplasman. Till exempel har forskare kunnat få insikter om bindningen av SARS-CoV-2 Spike-proteinet på virions yta till humant angiotensinkonverteringsenzym 2 (hACE2) på ytan av mänskliga celler, efterföljande internalisering via fusion vid plasmamembranet och endocytos av Spike:hACE2 proteinkomplex4,5. Stora insikter har också erhållits i SARS-CoV-2 utgående från celler via lysosomen med hjälp av cellulär fluorescensavbildning, en unik egenskap hos coronavirus som tidigare troddes inträffa via traditionell vesikel spirande från Golgi, som det är med många andra virus6. Den cellulära fluorescensmikroskopitekniken är en stöttepelare i nästan alla aspekter av biologisk forskning och har nödvändigtvis avancerat i sin bredd och omfattning av tillämpningar från superupplösningsavbildning av hela djur till automatiserad multiparmetrisk avbildning med högt innehåll för läkemedelsscreening. Här tillämpas automatiserad konfokal mikroskopi med högt innehåll på studien av SARS-CoV-2-cellinmatning med fluorescerande QDs konjugerade till virusspikproteinet.
Analys med högt innehåll av bilder som genereras av biologiska bildplattformar möjliggör större extraktion av värdefulla biologiska insikter än enskilda parametrar som hel brunnsintensitet, som man skulle få med hjälp av en multimodal plattläsare7. Genom att separera objekten i ett synfält med hjälp av automatiserade segmenteringsalgoritmer kan varje objekt eller en population av objekt analyseras för parametrar som intensitet, område och textur i varje tillgänglig fluorescenskanal8. Att kombinera många mätningar i multivariata data uppsättningar är en användbar metod för fenotypisk profilering. När den önskade fenotypen är känd, såsom QD internalisering i form av punkta, kan man använda mätningarna relaterade till punktera såsom storlek, antal och intensitet för att bedöma effekten av en behandling.
Molnbaserad programvara för bildanalys med högt innehåll kan rymma ett stort antal instrumentdatautgångar, inklusive plattformen för bildbehandling med högt innehåll. Genom att använda en molnbaserad server för bildlagring och onlineanalys kan användaren ladda upp sina data från antingen bildinstrumentet eller från nätverksenheten där data lagras. Analysdelen av protokollet utförs i moln program miljön och data kan exporteras i en mängd olika fil format för nedströms data visualisering.
SARS-CoV-2-viruset består av icke-strukturella och strukturella proteiner som hjälper till i dess sammansättning och replikering. SARS-CoV-2 spike har två domäner som kallas S1 och S2, där S1 innehåller den receptorbindande domänen som ansvarar för hACE2-interaktioner vid plasmamembranet9. Spike har också visat sig interagera med andra molekyler vid plasmamembranet som kan fungera som co-receptorer utöver hACE210,11. Genom hela spikproteinsekvensen och särskilt vid S1/S2-gränssnittet finns det proteasklyvningsplatser som möjliggör fusion vid membranet efter transmembran serinproteas 2 (TMPRSS2)12. Olika rekombinanta SARS-CoV-2 Spike proteiner har producerats från enskilda receptor bindande domäner, till S1, S2, S1 med S2, och hela spik trimers från flera kommersiella leverantörer för användning i forskningsverksamhet13.
I detta arbete, ytan av QDs funktionaliserades med rekombinanta spik trimers som innehåller en histidin tagg (QD-Spike). QDs som produceras av Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section innehåller en kadmium selenidkärna och ett zinksulfidskal14,15. Zinken på QD-ytan koordinerar histidinresterna i det rekombinanta proteinet för att bilda en funktionaliserad QD som liknar en SARS-CoV-2 viruspartikel i form och funktion. Genereringen av nanopartiklar och proteinkonjugation beskrevs tidigare med hjälp av QD-konjugerade receptorbindningsdomänen15. Denna metod beskriver cellodlingspreparat, QD-behandling, bildförvärv och dataanalysprotokoll som kan vägleda en forskare i att studera SARS-CoV-2 Spike aktivitet i det fysiologiska sammanhanget för en mänsklig cell.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td>Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% 
			Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260-037</td>
			<td>Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acridine Orange / Propidium Iodide Stain</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>F23001</td>
			<td>Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655946</td>
			<td>Used to support cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Characterized Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva/HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Columbus Analyzer</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ5 (5 mM)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>62252</td>
			<td>Basal media for HEK293T cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-gn-5</td>
			<td>Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK293T hACE2-GFP</td>
			<td>Codex Biosolutions</td>
			<td>CB-97100-203</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for fluorescence cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna Cell Counting Slides</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L12001</td>
			<td>High-content imaging platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opera Phenix</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NA</td>
			<td>Imaging media, used for incubating cells with quantum dots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11058-021</td>
			<td>Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS -/-</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike)</td>
			<td>custom made by Naval Research Laboratory</td>
			<td></td>
			<td>Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td>
			<td>Sino Biological</td>
			<td>40592-MM57</td>
			<td>Used to dissociate cells from flask during passaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput confocal imaging of quantum dot-conjugated sars-cov-2 spike trimers to track binding and endocytosis in hek293t cells

Utvecklingen av ny teknik för cellulär fluorescensmikroskopi har underlättat screeningmetoder med hög genomströmning för läkemedelsupptäckt. Kvantprickar är fluorescerande nanopartiklar med utmärkta fotofysiska egenskaper genomsyrade av ljus och stabil fotoluminescens samt smala emissionsband. Kvantprickar är sfäriska i form, och med rätt modifiering av ytkemin kan användas för att konjugera biomolekyler för cellulära applikationer. Dessa optiska egenskaper, i kombination med förmågan att funktionalisera dem med biomolekyler, gör dem till ett utmärkt verktyg för att undersöka receptor-ligand interaktioner och cellulär handel. Här presenterar vi en metod som använder kvantprickar för att spåra bindning och endocytos av SARS-CoV-2 spike protein. Detta protokoll kan användas som en guide för experimentalister som vill använda kvantprickar för att studera protein-proteininteraktioner och trafficking i samband med cellulär fysiologi.

Vid behandling kommer QDs att internaliseras eftersom nanopartikeln binder till ACE2 på plasmamembranet och inducerar endocytos. Med hjälp av en ACE2-GFP-uttryckscell kan flyttning av både QDs och ACE2 visualiseras med fluorescensmikroskopi. När de två QD- och ACE2-signalerna har internaliserats visar de en stark colocalisering. Från dessa bilder kan bildsegmentering och efterföljande analys utföras för att extrahera relevanta parametrar som dekorantal (figur 1, <strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells at JoVE.com

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

I detta protokoll, kvantprickar konjugerade till rekombinanta SARS-CoV-2 spike gör det möjligt cellbaserade analyser att övervaka spikbindning till hACE2 vid plasmamembranet och efterföljande endocytos av de bundna proteinerna i cytoplasman.

Konfokal avbildning av kvantpunkt-konjugerad SARS-CoV-2 spike trimers för att spåra bindning och endocytos i HEK293T-celler

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Vi har etablerat en plattformsteknik för SARS COVID 2 som kan tillämpas på andra virus med Spike medierad celligenkänning och inträde som första steg i cellulär virusinfektion. Kvantprickar är ljusa, stabila och deras yta kan funktionaliseras för en mängd olika cellulära applikationer. Med den här metoden kan vi visualisera och mäta Spike internalisering i celler.För att förbereda 0,1%BSA. Tillsätt 130 mikroliter av 7,5%BSA till 10 milliliter bildmedier i mix. För en 6,1 till tre seriell utspädning och tre exemplar tillsätt 14,26 mikroliter QD Spike till 285,74 mikroliter av 0,1%BSA för att göra den högsta koncentrationen av 20 nanomol.Lägg sedan till 100 mikroliter av 20 nanomol eller QD Spike till 200 mikroliter på 0,1%BSA för att göra den andra illusionen av 6,67 nanomol QD Spike. Ta bort alla förbrukade medier från varje brunn med en flerkanalig aspirator, tvätta en gång med en flerkanalig pipett med 100 mikroliter bildmedier per brunn och aspirera sedan 100 mikroliter av bildmediet. Tillsätt tillbaka 50 mikroliter QD Spike-lösning per brunn och inkubera plattan i tre timmar i en fuktad inkubator vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid.Bär skyddsutrustning, förbered 4% PFA och 0,1% PSA bildmedier inuti ett sterilt biosäkerhetsskåp, aspirera 50 mikroliter QD Spike från varje brunn och tillsätt 100 mikroliter av 4% PFA per brunn med en automatiserad flerkanalspipett för att undvika torkning av brunnarna. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur, tvätta sedan tre gånger med PBS, förbered det djupröda kärnämnet genom att späda ut fem millimeters stamlösning vid en till 1000 i PBS, aspirera PBS och tillsätt tillbaka 50 mikroliter utspädd kärnfärg per brunn. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur och tvätta sedan tre gånger med PBS, avbilda plattan eller försegla den med en platttätnings för avbildning senare.Förvara tallriken vid fyra grader Celsius. Starta programvaran för bildplattformen. Efter att ha loggat in bildplattformen skapa ett nytt förvärvsprotokoll genom att välja plåttyp som en 96 vägg transparent bottenbildplatta, välj optiskt läge har gått fokus och förstoring som 40 gånger vatten nedsänkning, välj binning som en.Välj läget för digitala ansiktskontraster som hög kontrast för att skapa väldefinierade cellkroppar. Ta en ögonblicksbild för att bekräfta att den här rubriken är lämplig enligt bildfönstret, välj den lämpliga C-kanalen för användning med ACE2-GFP-cellinjen för att visualisera ACE2-handel i cellen. Om du vill göra en anpassad QD-kanal väljer du rullgardinsmenyn för triangel och väljer excitation i 405 nanometersintervallet i utsläpp i intervallet 608 nanometer, väljer en brunn med en robust cytoplasmisk QD-signal för att ställa in exponeringstiden, lasereffekten och Z-höjdpositionen.Kontrollera om standardhöjden ger en bild av cellerna i önskat fokalplan. Z-positionen kommer att vara lägre för endocytospuncta än Z-positionen för plasmamembranet. Välj en exponeringstid, vanligtvis mellan 100 och 300 millisekunder som ger en ljus bild med grå nivåer, minst tre gånger större än bakgrundssignalen.Vid 20 nanomol bör de grå nivåerna vara cirka 6 000 atomenheter med 200 millisekunders exponeringstid och 80% lasereffekt. Kontrollera grå nivåer genom att högerklicka på bilden som produceras med ögonblicksbildsfunktionen i varje kanal och välja visa intensitet, klicka sedan på objektet av intresse eller bakgrund för att se den grå nivån för den pixeln, justera lasereffekten för att finjustera intensiteten hos de objekt som är av intresse. Spara anskaffningsprotokollet, växla för att köra experimentet och ange plåtnamnet, kör experimentet.Flyttning av både QDs och ACE2 visualiserades med fluorescence mikroskopi och en ACE2-GFP uttrycker cellinje. Bildsegmentering och efterföljande analys utfördes för att extrahera relevanta parametrar som dekorantal. För det första segmenterades atomkärnor från den nukleära markörkanalen för att skapa en ROI-population.Sedan en ROI-region som beskriver cellen med segmenterad med ACE2-GFP-kanalen. Slutligen var QD 608 Spike fläckar segmenterade från cellen ROI regionen, internaliserade QD och ACE2 signaler visade stark samlokalisering. Ett koncentrationssvarsexperiment med sex olika koncentrationer av QD Spike utfördes i HEK 293T-celler.QDS kan användas så lågt som 2,22 nanomol, men det rekommenderas att man använder koncentrationer på 10 nanomol eller högre för att säkerställa ett robust svar. Under konjugation till QD-proteinaggregeringen kan uppstå. Aggregat upptäcktes i QD-lösningen som ljusa klumpade fällningar och HEK 293T-celler, QDs inkuberades med neutraliserade antikroppar från 30 mikrogram per mikroliter före tillägg till celler, dessa antikroppar blockerade bindande internalisering och orsakade en minskning av spotantalet jämfört med celler som endast behandlades med QD.Denna uppsats kan också användas för screening med hög genomströmning, leadutvärdering av neutraliserande antikroppar för att identifiera stick antivirala medel till blockvirusinträdet och anpassas för att studera nya framväxande varianter.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-baserad Mätning av Store-drivs kalcium Entry i levande celler: från odlade Cancer Cell till skelettmuskulatur Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

En hög genomströmning MHC II-bindningsanalys för kvantitativ analys av peptidepitoper

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Applications of pHluorin for Quantitative, Kinetic and High-throughput Analysis of Endocytosis in Budding Yeast

Tillämpningar av pHluorin för kvantitativ, kinetisk och hög kapacitet Analys av Endocytosis i knoppande jäst

Green fluorescent protein (GFP) and its variants are widely used tools for studying protein localization and dynamics of events such as cytoskeletal ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Att utnyttja levande Imaging till spår kärnor under gorgina differentiering och Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...

High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression

Live imaging av mikrokolonier med hög genomströmning för att mäta heterogenitet i tillväxt och genuttryck

Precise measurements of between- and within-strain heterogeneity in microbial growth rates are essential for understanding genetic and environmental ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Tvåstegs omvänd transkriptionsdroppe digitala PCR-protokoll för SARS-CoV-2-detektering och kvantifiering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Swabbing the Urban Environment - En pipeline för provtagning och detektion av sars-cov-2 från miljöreservoarer

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

A High-Throughput Platform for Culture and 3D Imaging of Organoids

En plattform med hög kapacitet för odling och 3D-avbildning av organoider

The characterization of a large number of three-dimensional (3D) organotypic cultures (organoids) at different resolution scales is currently limited by ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

Karakterisering av zinktransportörer hos däggdjur med hjälp av en in vitro zinktransportanalys

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...