Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

نشكر الدكتور باكنر على التكرم بتوفير بلازميد pLacZ. وقد تم دعم هذا العمل من قبل الوكالة الوطنية للترويج العلمي والتكنولوجي ووزارة العلوم والابتكار من الأرجنتين (PICT2016-0439، PICT2019-0526، PICT2019-4212)، ومجلس البحوث في المملكة المتحدة [MR/P027989/1]. تم استخدام فن سيرفييه الطبي لإنتاج الشكل 1 (https://smart.servier.com).

ملاحظة: يبين الشكل 1 نظرة عامة على التصميم التجريبي بأكمله.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة على فحص الفحص في المختبر لخط Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ باستخدام CPRG كركيزة للتفاعل اللوني. ...

<ol>
	<li>Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+mortality+in+chronic+Chagas+disease:+a+systematic+review+of+observational+studies.">Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies.</a> Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).</li><li>P&#233;rez-Molina, J. A., Molina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).</li><li>Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+a+bug+and+a+hard+place:+Trypanosoma+cruzi+genetic+diversity+and+the+clinical+outcomes+of+Chagas+disease.">Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).</li><li>Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Chagas+disease.">The history of Chagas disease.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 317 (2014).</li><li>Viotti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+paradigm+shift+in+the+treatment+of+chronic+Chagas+disease.">Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).</li><li>Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas’+Disease.">Chagas’ Disease.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).</li><li>Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+drug+discovery+for+Chagas+disease.">Methodological advances in drug discovery for Chagas disease.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).</li><li>Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+technique+for+screening+drugs+for+activity+against+Trypanosoma+cruzi+using+parasites+expressing+beta-galactosidase.">Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).</li><li>Vega, C., Rol&#243;n, M., Mart&#237;nez-Fern&#225;ndez, A. R., Escario, J. A., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+pharmacological+screening+assay+with+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+expressing+beta-galactosidase.">A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase.</a> Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).</li><li>Bettiol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+classes+of+heteroaromatic+compounds+with+activity+against+intracellular+Trypanosoma+cruzi+by+chemical+library+screening.">Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).</li><li>Gulin, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+biological+validation+of+an+in+vitro+assay+using+the+transfected+Dm28c/pLacZ+Trypanosoma+cruzi+strain.">Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain.</a> Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).</li><li>da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Leishmania+cell+lines+expressing+high+levels+of+beta-galactosidase+as+alternative+tools+for+the+evaluation+of+anti-leishmanial+drug+activity.">Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity.</a> Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).</li><li>McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Moreno-Viguri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+anti-Trypanosoma+cruzi+activity+of+new+arylamine+Mannich+base-type+derivatives.">In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).</li><li>Garc&#237;a, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

تصف هذه الورقة فحصا يعتمد على تحديد نشاط β-galactosidase السيتوبلازمي الذي تم إطلاقه بسبب التحلل الغشائي ل T. cruzi epimastigotes أو trypomastigotes أو الخلايا المصابة ب amastigotes في وجود CPRG الركيزة. استخدمنا طفيليات T. cruzi Dm28c / pLacZ ، وهي سلالة طفيليات مستقرة تم الحصول عليها بعد النقل باستخدام بلازميد حامل β ?...

مرض شاغاس (ChD) ، أو داء المثقبيات الأمريكي ، هو مرض طفيلي تسببه البروتوزوان السوطية ، Trypanosoma cruzi (T. cruzi). يبدأ ChD بمرحلة حادة بدون أعراض أو قليلة الأعراض لا يتم تشخيصها عادة ، تليها مرحلة مزمنة مدى الحياة. في المزمنة ، ~ 30 ٪ من المرضى يظهرون بعد عقود من العدوى - مجموعة متنوعة من الحالات الموهنة ، بما في ذلك اعتلال عضلة القلب ، ومتلازمات الجهاز الهضمي الضخمة ، أو كليهما ، مع معدل وفيات يتراوح بين 0.2 ٪ إلى 20 ٪ 1،2،3. قد لا يكون لدى المرضى المزمنين الذين لا تظهر عليهم أعراض أي علامات سريرية ولكنهم يظلون إيجابيين مصليا طوال حياتهم.
تشير التقديرات إلى أن حوالي 7 ملايين شخص مصابون في جميع أنحاء العالم ، معظمهم من أمريكا اللاتينية ، حيث يتوطن ChD. وفي هذه البلدان، ينتقل T. cruzi أساسا عن طريق حشرات الترياتومين المصابة بالدم (الانتقال عن طريق النواقل) وأقل تواترا عن طريق الانتقال عن طريق الفم عن طريق تناول الأغذية الملوثة ببراز الترياتومين المحتوي على الطفيليات2. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن ينتقل الطفيلي عبر المشيمة من الأمهات الشاغاسيات إلى الأطفال حديثي الولادة ، أو من خلال عمليات نقل الدم ، أو أثناء زراعة الأعضاء. وقد ساهمت هذه الطرق المستقلة عن النواقل للحصول على العدوى والهجرة البشرية في انتشار المرض في جميع أنحاء العالم، ويتضح ذلك من خلال عدد متزايد من الحالات في أمريكا الشمالية وأوروبا وبعض البلدان الأفريقية وشرق البحر الأبيض المتوسط وغرب المحيط الهادئ4. ويعتبر مرض الأمراض المزمنة مرضا مهملا لأن انتقال العدوى المنقولة بالنواقل يرتبط ارتباطا وثيقا بالفقر وهو قضية صحية عمومية رئيسية، ولا سيما في بلدان أمريكا اللاتينية المنخفضة الدخل. وعلى الرغم من توافر العلاجات، فإن معدل الوفيات الناجمة عن أمراض الكلى المزمنة في أمريكا اللاتينية هو الأعلى بين الأمراض الطفيلية، بما في ذلك الملاريا2.
هناك نوعان من الأدوية المسجلة لعلاج ChD أدخلت في أواخر 1960s وأوائل 1970s: nifurtimox و benznidazole5. كلا العقارين فعالان في المرحلة الحادة من المرض لدى البالغين والأطفال وحديثي الولادة المصابين خلقيا ، وكذلك في الأطفال المصابين بعدوى مزمنة ، حيث يتم تحقيق الشفاء عادة. ومع ذلك ، يتم تشخيص عدد قليل فقط من الأشخاص في وقت مبكر بما يكفي ليتم علاجهم في الوقت المناسب. وفقا لأحدث التجارب السريرية ، فإن كلا العقارين لهما قيود مهمة لدى البالغين ولم يكونا فعالين في تقليل الأعراض لدى الأشخاص الذين يعانون من أمراض مزمنة. وبالتالي ، فإن استخدامها في هذه المرحلة مثير للجدل. العيوب الأخرى هي فترات العلاج المطولة المطلوبة (60-90 يوما) والآثار الضارة المتكررة والشديدة التي لوحظت ، والتي تؤدي إلى التوقف عن العلاج في نسبة من المصابين 6,7. وتشير التقديرات إلى أن أقل من 10٪ من الأشخاص المصابين بأمراض القلب المزمنة قد تم تشخيصهم، بل إن عددا أقل منهم يمكنهم الحصول على العلاج، حيث يعيش العديد من الأفراد المتضررين في المناطق الريفية دون الحصولعلى الرعاية الصحية أو ندرة الوصول إليها8. تسلط هذه الحقائق الضوء على الحاجة الملحة لإيجاد أدوية جديدة ضد T. cruzi للسماح بعلاجات أكثر كفاءة وأمانا وقابلة للتطبيق في الميدان ، خاصة بالنسبة للمرحلة المزمنة. وفي هذا الصدد، هناك تحد آخر يواجه تطوير مركبات أكثر فعالية يتمثل في الحد من نظم تقييم فعالية الأدوية في المختبر وفي الجسم الحي9.
على الرغم من أن البيولوجيا الكيميائية والنهج الجينومية لتحديد أهداف الأدوية المحتملة قد استخدمت في طفيليات kinetoplastid ، فإن الأدوات الجينومية المتاحة في T. cruzi محدودة على النقيض من T. brucei أو Leishmania. وبالتالي ، فإن فحص المركبات ذات النشاط المبيد للمثقبيات لا يزال هو النهج الأكثر استخداما في البحث عن مرشحات جديدة للعلاج الكيميائي ضد ChD. عادة ، يجب أن يبدأ اكتشاف الدواء في T. cruzi باختبار آثار دواء جديد في فحص في المختبر ضد مرحلة epimastigote. لعقود من الزمان ، كانت الطريقة الوحيدة لقياس التأثيرات المثبطة للمركبات المرشحة على T. cruzi هي العد المجهري اليدوي ، وهو أمر شاق ومستهلك للوقت ويعتمد على المشغل. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النهج مناسب لفحص عدد صغير من المركبات ولكنه غير مقبول بالنسبة للفحص عالي الإنتاجية للمكتبات المركبة الكبيرة. في الوقت الحاضر ، تبدأ العديد من التحقيقات بتحليل عدد كبير من المركبات من أصول مختلفة يتم فحصها في المختبر ، واختبار قدرتها على تثبيط نمو الطفيليات. تم تطوير كل من طرق قياس الألوان والفلورومترات لزيادة الإنتاجية في هذه الفحوصات ، وتحسين موضوعية الفحص وجعل العملية برمتها أقل مملة9.
تعتمد إحدى طرق قياس الألوان الأكثر استخداما على نشاط β-galactosidase للطفيليات المنقولة التي وصفها Bucknet والمتعاونون معها لأول مرة10. يقوم إنزيم β-galactosidase الذي تعبر عنه الطفيليات المؤتلفة بتحلل الركيزة اللونية ، الكلوروفينول الأحمر β-D-galactopyranoside (CPRG) ، إلى الكلوروفينول الأحمر ، والذي يمكن قياسه بسهولة بالألوان باستخدام مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة. وبالتالي ، يمكن تقييم نمو الطفيليات في وجود مجموعة متنوعة من المركبات في وقت واحد وتحديدها كميا في لوحات microtiter. تم تطبيق هذه الطريقة لاختبار الأدوية في أشكال epimastigote (الموجودة في ناقل الحشرات) ، trypomastigotes ، و amastigotes داخل الخلايا ، المراحل الثديية للطفيلي. علاوة على ذلك ، تتوفر بالفعل العديد من سلالات T. cruzi المؤتلفة المنقولة باستخدام بلازميد pBS:CL-Neo-01 / BC-X-10 (pLacZ)10 للتعبير عن إنزيم الإشريكية القولونية β-galactosidase (ويمكن بناء أخرى جديدة) ، مما يسمح بتقييم الطفيليات من وحدات الكتابة المنفصلة المختلفة (DTUs) التي قد لا تتصرف بالتساوي تجاه نفس المركبات10,11,12,13 . وقد استخدمت هذه الطريقة بالفعل بنجاح لتقييم المركبات للنشاط ضد T. cruzi في فحص الإنتاجية المنخفضة والعالية12,13. كما تم استخدام نهج مماثلة في طفيليات أولية أخرى ، بما في ذلك التوكسوبلازما غوندي والليشمانيا المكسيكية14،15.
تصف هذه الورقة وتبين طريقة مفصلة لفحص المخدرات في المختبر ضد جميع مراحل دورة حياة T. cruzi باستخدام الطفيليات التي تعبر عن β-galactosidase. تم إجراء الفحوصات المعروضة هنا باستخدام خط T. cruzi المعبر عن β-galactosidase الذي تم الحصول عليه عن طريق نقل سلالة T. cruzi Dm28c من DTU I13 مع بلازميد pLacZ (Dm28c / pLacZ). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف نفس البروتوكول بسهولة مع السلالات الأخرى لمقارنة الأداء بين المركبات وبين سلالات T. cruzi أو DTUs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

المثقبيات كروزي هي العامل المسبب لمرض شاغاس (ChD) ، وهو مرض متوطن له أهمية في مجال الصحة العامة في أمريكا اللاتينية ويؤثر أيضا على العديد من البلدان غير الموبوءة بسبب الزيادة في الهجرة. يصيب هذا المرض ما يقرب من 8 ملايين شخص ، مع حالات جديدة تقدر ب 50،000 حالة سنويا. في 1960s و 70s ، تم إدخال اثنين من الأدوية لعلاج ChD: nifurtimox و benznidazole (BZN). كلاهما فعال في الأطفال حديثي الولادة وخلال المرحلة الحادة من المرض ولكن ليس في المرحلة المزمنة ، ويرتبط استخدامهما بآثار جانبية مهمة. وتؤكد هذه الحقائق الحاجة الملحة إلى تكثيف البحث عن عقاقير جديدة ضد ت. كروزي.
ينتقل T. cruzi من خلال ناقلات الحشرات الدموية من عائلتي Reduviidae و Hemiptera. بمجرد وصوله إلى مضيف الثدييات ، فإنه يتكاثر داخل الخلايا كشكل amastigote غير السوط ويتمايز في trypomastigote ، وهو الشكل المعدي غير التكراري في مجرى الدم. داخل ناقل الحشرات ، تتحول المثقبيات إلى مرحلة epimastigote وتتكاثر من خلال الانشطار الثنائي.
تصف هذه الورقة مقايسة تعتمد على قياس نشاط السيتوبلازم β-galactosidase المنبعث في الثقافة بسبب تحلل الطفيليات باستخدام الركيزة ، الكلوروفينول الأحمر β-D-galactopyranoside (CPRG). لهذا ، تم نقل سلالة T. cruzi Dm28c مع بلازميد مفرط التعبير عن β-galactosidase واستخدامه في الفحص الدوائي في المختبر في مراحل epimastigote و trypomastigote و amastigote. تصف هذه الورقة أيضا كيفية قياس النشاط الأنزيمي في الظواهر المستزرعة ، وخلايا فيرو المصابة بالأماسيغوت ، والتريبومستيجوت المنبعثة من الخلايا المستزرعة باستخدام الدواء المرجعي ، البنزنيدازول ، كمثال. يتم إجراء هذا الفحص اللوني بسهولة ويمكن تحجيمه إلى تنسيق عالي الإنتاجية وتطبيقه على سلالات T. cruzi الأخرى.

وعملا بالبروتوكول الموصوف أعلاه، تم احتضان الظواهر المعبرة Dm28c المعبرة عن β-galactosidase ب 6 تركيزات من BZN (2.5 و 5 و 10 و 20 و 40 و 80 ميكرومتر) (أو مركبات ذات أهمية) لمدة 72 ساعة. بعد هذه الفترة ، تمت إضافة كاشف CPRG جنبا إلى جنب مع المنظفات ، التي تحلل الخلايا وتطلق β-galactosidase. يتم شق CPRG بواسطة β-galactosidase لإنتاج ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

نحن نصف مقايسة لونية عالية الإنتاجية تقيس نشاط β-galactosidase في ثلاث مراحل دورة حياة من Trypanosoma cruzi ، العامل المسبب لمرض شاغاس. يمكن استخدام هذا الفحص لتحديد مركبات المثقبيات بطريقة سهلة وسريعة وقابلة للتكرار.

في المختبر فحص المخدرات ضد جميع مراحل دورة حياة المثقبيات الكروزية باستخدام الطفيليات التي تعبر عن β-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

يصف هذا البروتوكول مقايسة قياس الألوان عالية الإنتاجية في مراحل دورة الحياة الثلاث للمثقبيات الكروزي لتحديد الأدوية المرشحة الجديدة لمرض شاغاس. يمكن استخدام هذا لتحديد مركبات المثقبيات بطريقة سهلة وسريعة وقابلة للتكرار. وستشارك في هذا الإجراء رومينا مانارين، وهي فنية في زراعة الخلايا في المختبر من مختبر سرير باميلا.ابدأ بزراعة بيتا غالاكتوزيداز الذي يعبر عن المثقبيات الكروزية في قارورة زراعة الأنسجة T-25 واحتضنها عند 28 درجة مئوية لزراعتها محوريا. باستخدام غرفة نيوباور ، قم بقياس نمو الطفيليات قبل الزراعة الفرعية. للحفاظ على الثقافات في مرحلة السجل ، فإن الزراعة الفرعية كل 48 إلى 72 ساعة في خمسة ملليلتر من وسط LIT تستكمل بنسبة 10٪ FCS و geneticin في الكبريتات بتركيز نهائي قدره 200 ميكروغرام لكل ملليلتر.ثم أغلق الغطاء بإحكام قبل احتضانه عند 28 درجة مئوية في وضع رأسي. من ثقافة مرحلة السجل ، قم بعمل تعليق ل epimastigote في وسط LIT مكمل ب geneticin و sulfate عند التركيز النهائي ل 200،000 خلية لكل ملليلتر epimastigote لكل ملليلتر. بعد توزيع 100 ميكرولتر من التعليق لكل بئر من لوحة بئر 96 ، ماكياج الحجم النهائي من بئر 200 ميكرولتر مع متوسطة.اجعل تعليق خلية Vero في DMEM مكملا ب 2٪ FCS بالتركيز النهائي ل 100،000 خلية لكل ملليلتر. زرع 100 ميكرولتر من التعليق لكل بئر في لوحة زراعة أنسجة البئر 96. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها للالتصاق وفي اليوم التالي ، راقب الخلايا تحت المجهر.في اليوم التالي ، شطف الطبقة الأحادية من خلية Vero ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من PBS المعقمة. إضافة trypomastigotes metacyclic التي تم الحصول عليها مسبقا. إضافة تعدد العدوى أو MOI من 10-1 في 100 ميكرولتر من DMEM تستكمل مع 2٪ FCS لكل بئر واحتضان لمدة ست ساعات كما هو موضح سابقا.في نهاية الحضانة ، اغسل اللوحة مرتين باستخدام PBS وأضف 100 ميكرولتر من DMEM بدون أحمر الفينول مع استكمال 2٪ FCS. بعد جعل تعليق خلايا Vero في DMEM ، أضف التركيز النهائي ل 1 مليون خلية لكل ملليلتر. زرع 800،000 خلية في خمسة ملليلتر من الوسط في قوارير T-25 وحضانت بين عشية وضحاها للالتصاق بالخلايا.بمجرد شطف القارورة باستخدام PBS ، أضف trypomastigotes ، وأضف MOI من 10-1 في خمسة ملليلترات من DMEM مكمل بنسبة 2٪ FCS واحتضنها بين عشية وضحاها كما هو موضح سابقا. في نهاية الحضانة ، اغسل القارورة مرتين باستخدام PBS. أضف خمسة ملليلترات من DMEM الطازج المكمل بنسبة 2٪ FCS واحتضنه لمدة أربعة أيام.في نهاية الحضانة ، بعد مراقبة supernatant لوجود trypomastigotes تحت المجهر البصري. حدد كمية المثقبيات باستخدام غرفة نيوباور. جمع supernatant في أنبوب 15 ملليلتر وأجهزة الطرد المركزي في 7،000 مرات G لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.ثم تخلص من supernatant وأعد تعليق الكريات في DMEM بدون الفينول الأحمر المكمل ب 2٪ FCS للحصول على تركيز 1 مليون trypomastigotes لكل ملليلتر. بذور 100 ميكرولتر من تعليق المثقبيات لكل بئر في لوحة بئر 96. أضف محلول البنزنيدازول إلى الظواهر أو خلايا فيرو مع الأمستيجوت أو المثقبيات كما هو موضح في مخطوطة النص.ثم احتضن الظواهر ، وحدد 28 درجة مئوية لمدة 72 ساعة والتريبوماستيغوتس أو خلايا فيرو المصابة بالأماسيغوت لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بالنسبة لفحص قياس الألوان ، قم بإعداد الآبار الفارغة بإضافة 100 ميكرولتر من PBS أو الوسط المقابل. بعد ذلك ، أضف 40 ميكرولتر من محلول الركيزة CPRG و 10 ميكرولترات من محلول المنظفات إلى كل بئر للحصول على تركيز نهائي من 200 ميكرومولار CPRG و 0.1٪ من المنظفات في حجم نهائي من 250 ميكرولتر في كل بئر.بعد الحضانة ، عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، قم بقياس الامتصاص عند 595 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي للصفائح الدقيقة. في البرنامج ، قم بإنشاء بروتوكول جديد عن طريق تحديد الامتصاص كطريقة الكشف ونقطة النهاية كنوع القراءة ، ثم انقر فوق موافق. بعد ذلك، أضف خطوة قراءة.اكتب الطول الموجي المحدد وانقر فوق موافق. في قسم تخطيط اللوحة ، ضع علامة على الآبار المراد قراءتها ، وانقر فوق موافق ، وانقر فوق لوحة القراءة ، وانتظر حتى تظهر القيم على الشاشة وقم بتصديرها إلى جدول بيانات لتحليل النتائج وحساب قيم الامتصاص باستخدام الطرح كما هو موضح في المخطوطة. في برنامج التحليل الإحصائي ، ارسم تركيز BZN مقابل الامتصاص عند 595 نانومتر في جدول XY.قم بتحويل تركيزات BZN إلى قيم لوغاريتمية بالنقر فوق تحليل، وتحديد خيار التحويل، والنقر فوق موافق. للحصول على قيم IC50، انقر فوق تحليل، ومن قائمة تحليل XY حدد ملاءمة منحنى الانحدار غير الخطي، ثم انقر فوق موافق. بعد ذلك ، انتقل إلى نافذة المعلمات ، في علامة تبويب النموذج ، انتقل إلى مجموعة تثبيط استجابة الجرعة من المعادلات المضمنة ، وحدد مثبط السجل مقابل منحدر متغير الاستجابة للمعلمات حيث تترك طريقة استجابة الجرعة جميع علامات التبويب الأخرى عند القيم الافتراضية ثم انقر فوق ، حسنا.انقر فوق قسم النتائج للعثور على قيمة IC50 و SD وجودة الملاءمة. انقر فوق قسم الرسم البياني للعثور على الرسم البياني XY للتركيز اللوغاريتمي للدواء مقابل قيم الامتصاص وتأكد من أن ملاءمة المنحنى يتم رسمها بيانيا أيضا بلون مختلف. في هذه الدراسة ، كانت قيمة IC50 التي تم الحصول عليها للظهارة حوالي 20 ميكرومولار ، على غرار الدراسات السابقة.بالإضافة إلى ذلك ، أشارت النتائج إلى نشاط بطانة بيتا غالاكتوزيداز من epimastigotes مع مرور الوقت. من المهم جدا إجراء نسخ متماثلة على الأقل لكل حالة تم اختبارها وتقليلها من الأخطاء في إدارة وحدة التخزين.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

السريع خطوة واحدة الأنزيمية توليف وجميع المائيه تنقية طرهالوز النظائر

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

أسلوب قياس ألوان لقياس محتوى الحديد في النباتات

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

التحديد الكمي لنشاط نقص التصبغ في المختبر

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

إعادة تشكيل ذبذبات دورة الخلية في ميكرومولسيونس مستخرجات البيض خالية من الخلية النمو

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

عزل و1-ATPase من "طلائعيات طفيلية" المثقبيات البروسية

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

استخدام المحتوى العالي من التصوير لقياس الهدف المشاركة في خلايا ملتصقة

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

الفحص الحركي للنشاط النواسي باستخدام مجسات الحمض النووي

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

الفحص الخاص بمثبطات بيروفوسفاتاسي الغشائية المربوطة بغشاء الثموغا

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

فحص Phytoestrogens باستخدام مستقبلات الاستروجين القائم على الخلية β مراسل Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

اشتقاق بلورات البروتين مع I3C باستخدام عشوائي Microseed مصفوفة الفرز

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...