Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

Wij danken Dr. Buckner voor het vriendelijk verstrekken van de pLacZ plasmide. Dit werk werd ondersteund door Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva uit Argentinië (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) en Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art werd gebruikt om Figuur 1 (https://smart.servier.com) te produceren.

OPMERKING: Een overzicht van het gehele experimentele ontwerp is weergegeven in figuur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van de in vitro screening assay van Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ lijn met CPRG als substraat voor de colorimetrische reactie. De test bestaat uit het zaaien van de parasieten...

<ol>
	<li>Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+mortality+in+chronic+Chagas+disease:+a+systematic+review+of+observational+studies.">Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies.</a> Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).</li><li>P&#233;rez-Molina, J. A., Molina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).</li><li>Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+a+bug+and+a+hard+place:+Trypanosoma+cruzi+genetic+diversity+and+the+clinical+outcomes+of+Chagas+disease.">Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).</li><li>Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Chagas+disease.">The history of Chagas disease.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 317 (2014).</li><li>Viotti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+paradigm+shift+in+the+treatment+of+chronic+Chagas+disease.">Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).</li><li>Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas’+Disease.">Chagas’ Disease.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).</li><li>Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+drug+discovery+for+Chagas+disease.">Methodological advances in drug discovery for Chagas disease.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).</li><li>Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+technique+for+screening+drugs+for+activity+against+Trypanosoma+cruzi+using+parasites+expressing+beta-galactosidase.">Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).</li><li>Vega, C., Rol&#243;n, M., Mart&#237;nez-Fern&#225;ndez, A. R., Escario, J. A., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+pharmacological+screening+assay+with+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+expressing+beta-galactosidase.">A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase.</a> Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).</li><li>Bettiol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+classes+of+heteroaromatic+compounds+with+activity+against+intracellular+Trypanosoma+cruzi+by+chemical+library+screening.">Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).</li><li>Gulin, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+biological+validation+of+an+in+vitro+assay+using+the+transfected+Dm28c/pLacZ+Trypanosoma+cruzi+strain.">Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain.</a> Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).</li><li>da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Leishmania+cell+lines+expressing+high+levels+of+beta-galactosidase+as+alternative+tools+for+the+evaluation+of+anti-leishmanial+drug+activity.">Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity.</a> Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).</li><li>McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Moreno-Viguri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+anti-Trypanosoma+cruzi+activity+of+new+arylamine+Mannich+base-type+derivatives.">In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).</li><li>Garc&#237;a, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

Dit artikel beschrijft een test op basis van het bepalen van de cytoplasmatische β-galactosidase-activiteit die vrijkomt als gevolg van membraanlysis van T. cruzi-epimastigoten, trypomastigoten of geïnfecteerde cellen met amastigoten in aanwezigheid van het substraat CPRG. We gebruikten T. cruzi Dm28c/pLacZ parasieten, een stabiele parasiestam verkregen na transfectie met een β-galactosidase-dragend plasmide geconstrueerd door Buckner en co-auteurs10. Deze test is gebruikt om ...

De ziekte van Chagas (ChD), of Amerikaanse trypanosomiasis, is een parasitaire ziekte veroorzaakt door de flagellated protozoa, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). ChD begint met een asymptomatische of oligosymptomatische acute fase die meestal niet gediagnosticeerd is, gevolgd door een levenslange chronische fase. In de chroniciteit manifesteert ~ 30% van de patiënten zich - decennia na de infectie - een verscheidenheid aan slopende aandoeningen, waaronder myocardiopathie, mega-spijsverteringssyndromen of beide, met een sterftecijfer variërend van 0,2% tot 20% 1,2,3. Asymptomatische chronische patiënten kunnen geen klinische symptomen hebben, maar blijven hun hele leven seropositief.
Schattingen suggereren dat ~ 7 miljoen mensen wereldwijd besmet zijn, meestal uit Latijns-Amerika, waar ChD endemisch is. In deze landen wordt T. cruzi voornamelijk overgedragen door geïnfecteerde bloedzuigende triatomine-insecten (vectoroverdracht) en minder vaak door orale overdracht door de inname van voedsel dat besmet is met triatomine-uitwerpselen die de parasieten bevatten2. Bovendien kan de parasiet via de placenta worden overgedragen van chagasische moeders op pasgeborenen, via bloedtransfusies of tijdens orgaantransplantatie. Deze vectoronafhankelijke manieren om de infectie en menselijke migratie te verwerven, hebben bijgedragen aan de wereldwijde verspreiding van de ziekte, wat blijkt uit een toenemend aantal gevallen in Noord-Amerika, Europa en sommige Afrikaanse, oostelijke mediterrane en westelijke Pacifische landen4. ChD wordt beschouwd als een verwaarloosde ziekte omdat vectoroverdracht nauw verbonden is met armoede en een toonaangevend volksgezondheidsprobleem is, vooral in Latijns-Amerikaanse lage-inkomenslanden. Hoewel er beschikbare behandelingen zijn, is de mortaliteit als gevolg van ChD in Latijns-Amerika de hoogste onder parasitaire ziekten, waaronder malaria2.
Er zijn twee geregistreerde geneesmiddelen voor ChD-behandeling geïntroduceerd in de late jaren 1960 en vroege jaren 1970: nifurtimox en benznidazol5. Beide geneesmiddelen zijn effectief in de acute fase van de ziekte bij volwassenen, kinderen en aangeboren geïnfecteerde pasgeborenen, evenals bij kinderen met een chronische infectie, waar genezing meestal wordt bereikt. Slechts een paar mensen worden echter vroeg genoeg gediagnosticeerd om op tijd te worden behandeld. Volgens de laatste klinische onderzoeken hebben beide geneesmiddelen belangrijke beperkingen bij volwassenen en waren ze niet effectief in het verminderen van symptomen bij mensen met een chronische ziekte; vandaar dat het gebruik ervan in deze fase controversieel is. Andere nadelen zijn de verlengde behandelingsperioden die nodig zijn (60-90 dagen) en de frequente, ernstige bijwerkingen die worden waargenomen, die leiden tot stopzetting van de behandeling bij een deel van de geïnfecteerde mensen 6,7. Geschat wordt dat minder dan 10% van de mensen met ChD is gediagnosticeerd en nog minder hebben toegang tot behandeling, omdat veel getroffen personen op het platteland wonen met geen of nauwelijks toegang tot gezondheidszorg8. Deze feiten benadrukken de dringende noodzaak om nieuwe geneesmiddelen tegen T. cruzi te vinden om efficiëntere, veiligere en op het veld toepasbare behandelingen mogelijk te maken, vooral voor de chronische fase. In dit verband is een andere uitdaging bij de ontwikkeling van effectievere verbindingen de beperking van systemen voor het beoordelen van de werkzaamheid van geneesmiddelen in vitro en in vivo9.
Hoewel chemische biologie en genomische benaderingen voor de identificatie van potentiële geneesmiddeldoelen zijn gebruikt bij kinetoplastide parasieten, zijn de beschikbare genomische hulpmiddelen in T. cruzi beperkt in tegenstelling tot T. brucei of Leishmania. De screening van verbindingen met trypanocidale activiteit is dus nog steeds de meest gebruikte benadering in de zoektocht naar nieuwe chemotherapeutische kandidaat-geneesmiddelen tegen ChD. Gewoonlijk moet de ontdekking van geneesmiddelen in T. cruzi beginnen met het testen van de effecten van een nieuw geneesmiddel in een in vitro test tegen het epimastigotenstadium. Decennialang was de enige manier om de remmende effecten van kandidaat-verbindingen op T. cruzi te meten handmatig microscopisch tellen, wat arbeidsintensief, tijdrovend en operatorafhankelijk is. Bovendien is deze aanpak geschikt voor het testen van een klein aantal verbindingen, maar is onaanvaardbaar voor high-throughput screening van grote samengestelde bibliotheken. Tegenwoordig beginnen veel onderzoeken met de analyse van een groot aantal verbindingen van verschillende oorsprong die in vitro worden getest, waarbij hun vermogen om de groei van parasieten te remmen wordt getest. Zowel colorimetrische als fluorometrische methoden zijn ontwikkeld om de doorvoer in deze testen te verhogen, de objectiviteit van de screening te verbeteren en het hele proces minder vervelend te maken9.
Een van de meest gebruikte colorimetrische methoden is gebaseerd op de β-galactosidase-activiteit van getransfecteerde parasieten die voor het eerst werden beschreven door Bucknet en medewerkers10. Het β-galactosidase-enzym dat tot expressie wordt gebracht door de recombinante parasieten hydrolyseert het chromogene substraat, chloorfenolrood β-D-galactopyranoside (CPRG), tot chloorfenolrood, dat gemakkelijk colorimetrisch kan worden gemeten met behulp van een microplaatspectrofotometer. Zo kan parasietgroei in aanwezigheid van een verscheidenheid aan verbindingen tegelijkertijd worden geëvalueerd en gekwantificeerd in microtiterplaten. Deze methode is toegepast om geneesmiddelen te testen in epimastigote vormen (aanwezig in de insectenvector), trypomastigoten en intracellulaire amastigoten, de zoogdierstadia van de parasiet. Verder zijn verschillende recombinante T. cruzi-stammen getransfecteerd met het pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 plasmide (pLacZ)10 om de Escherichia coli-β-galactosidase-enzym tot expressie te brengen al beschikbaar (en er kunnen nieuwe worden geconstrueerd), wat de evaluatie mogelijk maakt van parasieten van verschillende discrete typeringseenheden (DTU's) die zich mogelijk niet gelijk gedragen ten opzichte van dezelfde verbindingen 10,11,12,13 . Deze methode is al met succes gebruikt om verbindingen te evalueren op activiteit tegen T. cruzi in lage en hoge doorvoer screening12,13. Soortgelijke benaderingen zijn ook gebruikt bij andere protozoaire parasieten, waaronder Toxoplasma gondii en Leishmania mexicana14,15.
Dit artikel beschrijft en toont een gedetailleerde methode voor een in vitro medicijnscreening tegen alle levenscyclusstadia van T. cruzi met behulp van parasieten die β-galactosidase tot expressie brengen. De hier gepresenteerde testen zijn uitgevoerd met een β-galactosidase-expresserende T. cruzi-lijn verkregen door transfectie van T. cruzi Dm28c stam van DTU I13 met pLacZ plasmide (Dm28c/pLacZ). Bovendien kan hetzelfde protocol eenvoudig worden aangepast aan andere stammen om de prestaties tussen verbindingen en tussen T. cruzi-stammen of DTU's te vergelijken.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi is de veroorzaker van de ziekte van Chagas (ChD), een endemische ziekte van volksgezondheidsbelang in Latijns-Amerika die ook veel niet-endemische landen treft vanwege de toename van migratie. Deze ziekte treft bijna 8 miljoen mensen, met nieuwe gevallen geschat op 50.000 per jaar. In de jaren 1960 en 70 werden twee geneesmiddelen voor ChD-behandeling geïntroduceerd: nifurtimox en benznidazol (BZN). Beide zijn effectief bij pasgeborenen en tijdens de acute fase van de ziekte, maar niet in de chronische fase, en het gebruik ervan wordt geassocieerd met belangrijke bijwerkingen. Deze feiten onderstrepen de dringende noodzaak om de zoektocht naar nieuwe medicijnen tegen T. cruzi te intensiveren.
T. cruzi wordt overgedragen door hematofagote insectenvectoren van de Reduviidae- en Hemiptera-families. Eenmaal in de gastheer van het zoogdier vermenigvuldigt het zich intracellulair als de niet-flagellaat amastigote vorm en differentieert het in de trypomastigote, de niet-replicatieve infectieuze vorm van de bloedbaan. In de insectenvector transformeren trypomastigoten in het epimastigotenstadium en vermenigvuldigen zich door binaire splijting.
Dit artikel beschrijft een test gebaseerd op het meten van de activiteit van de cytoplasmatische β-galactosidase die in de cultuur wordt vrijgegeven als gevolg van parasyse met behulp van het substraat, chlorofenol rood β-D-galactopyranoside (CPRG). Hiervoor werd de T. cruzi Dm28c-stam getransfecteerd met een β-galactosidase-overexpressie plasmide en gebruikt voor in vitro farmacologische screening in epimastigoten, trypomastigote en amastigote stadia. Dit artikel beschrijft ook hoe de enzymatische activiteit in gekweekte epimastigoten, geïnfecteerde Vero-cellen met amastigoten en trypomastigoten die vrijkomen uit de gekweekte cellen kunnen worden gemeten met behulp van het referentiegeneesmiddel benznidazol als voorbeeld. Deze colorimetrische test is eenvoudig uit te voeren en kan worden geschaald naar een high-throughput formaat en worden toegepast op andere T. cruzi stammen.

Volgens het hierboven beschreven protocol werden β-galactosidase-expresserende Dm28c-epimastigoten geïncubeerd met 6 concentraties BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (of verbindingen van belang) gedurende 72 uur. Na deze periode werd CPRG-reagens toegevoegd samen met wasmiddel, dat de cellen lyseert en β-galactosidase vrijgeeft. CPRG wordt gesplitst door de β-galactosidase om chloorfenolrood te produceren, wat leidt tot een verandering in kleur van geel naar roodachtig (figuur 2A). Chloorf...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

We beschrijven een high-throughput colorimetrische test die β-galactosidase-activiteit meet in drie levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi, de veroorzaker van de ziekte van Chagas. Deze test kan worden gebruikt om trypanocidale verbindingen op een eenvoudige, snelle en reproduceerbare manier te identificeren.

In vitro Drugsscreening tegen alle levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi met behulp van parasieten die β-galactosidase tot expressie brengen

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Dit protocol beschrijft een colorimetrische test met hoge doorvoer in de drie levenscyclusstadia van Trypanosoma cruzi om nieuwe kandidaat-geneesmiddelen voor de ziekte van Chagas te identificeren. Dit kan worden gebruikt om trypanocidale verbindingen op een eenvoudige, snelle en reproduceerbare manier te identificeren. De procedure wordt gedemonstreerd door Romina Manarin, een laboratoriumcelkweektechnicus uit het laboratorium van Pamela crib.Begin met het kweken van bèta galactosidase die Trypanosoma cruzi epimastigoten tot expressie brengt in een T-25 weefselkweekkolf en incubeer bij 28 graden Celsius om ze axenisch te laten groeien. Gebruik een Neubauer-kamer om de groei van parasieten te kwantificeren voordat u subcultureert. Voor het in stand houden van de culturen in een logfase, subcultuur om de 48 tot 72 uur in vijf milliliter LIT-medium aangevuld met 10% FCS en geneticïne in sulfaat bij een uiteindelijke concentratie van 200 microgram per milliliter.Sluit vervolgens de dop goed voordat u in verticale positie bij 28 graden Celsius broedt. Maak van de logfasecultuur een suspensie van epimastigoat in LIT-medium aangevuld met geneticïne en sulfaat in de uiteindelijke concentratie van 200.000 cellen per milliliter epimastigoat per milliliter. Na het doseren van 100 microliter suspensie per put van een 96 putplaat, make-up eindvolume van put 200 microliter met medium.Maak de Vero-celsuspensie in DMEM aangevuld met 2% FCS bij de uiteindelijke concentratie van 100.000 cellen per milliliter. Zaai 100 microliter van de suspensie per put in een weefselkweekplaat van 96 putten. Incubeer de cellen 's nachts voor hechting en observeer de volgende dag de cellen onder de microscoop.Spoel de volgende dag de Vero-celmonolaag drie keer met 100 microliter steriel PBS. Voeg eerder verkregen metacyclische trypomastigoten toe. Voeg een veelvoud aan infectie of MOI van 10-1 toe aan 100 microliter DMEM aangevuld met 2% FCS per put en incubeer gedurende zes uur zoals eerder aangetoond.Was aan het einde van de incubatie de plaat tweemaal met PBS en voeg 100 microliter DMEM toe zonder fenolrood aangevuld met 2% FCS. Voeg na het maken van de Vero-cellen suspensie in DMEM de uiteindelijke concentratie van 1 miljoen cellen per milliliter toe. Zaai 800.000 cellen in vijf milliliter van het medium in T-25 kolven en incubeer 's nachts voor celaanhanging.Zodra de kolf is gespoeld met PBS, voegt u trypomastigoten toe, voegt u een MOI van 10-1 toe in vijf milliliter DMEM aangevuld met 2% FCS en incubeert u 's nachts zoals eerder aangetoond. Was de kolf aan het einde van de incubatie tweemaal met PBS. Voeg vijf milliliter verse DMEM toe aangevuld met 2% FCS en incubeer gedurende vier dagen.Aan het einde van de incubatie, na observatie van het supernatant voor trypomastigoten aanwezigheid onder een optische microscoop. Kwantificeer de trypomastigoten met behulp van een Neubauer-kamer. Verzamel het supernatant in een buis van 15 milliliter en centrifugeer op 7.000 maal G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Gooi vervolgens het supernatant weg en resuspendeer de pellet in DMEM zonder fenolrood aangevuld met 2% FCS om een concentratie van 1 miljoen trypomastigoten per milliliter te verkrijgen. Zaad 100 microliter van de trypomastigote suspensie per put in een 96 put plaat. Voeg benznidazoloplossing toe aan epimastigoten, Vero-cellen met amastigoten of trypomastigoten zoals beschreven in het tekstmanuscript.Incubeer vervolgens de epimastigoten, zet 28 graden Celsius gedurende 72 uur en de trypomastigoten of geïnfecteerde Vero-cellen met amastigoten gedurende 24 uur op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Stel voor de colormetrische test de lege putten in door 100 microliter PBS of het bijbehorende medium toe te voegen. Voeg vervolgens 40 microliter CPRG-substraatoplossing en 10 microliter van de reinigingsoplossing toe aan elke put voor het verkrijgen van een eindconcentratie van 200 micromolaire CPRG en 0,1% detergent in een eindvolume van 250 microliter in elke put.Na incubatie, bij 37 graden Celsius gedurende twee uur, meet je de absorptie op 595 nanometer met behulp van een microplaatspectrofotometer. Maak in de software een nieuw protocol door absorptie te selecteren als de detectiemethode en eindpunt als het leestype en klik vervolgens op OK. Voeg vervolgens een leesstap toe.Typ de geselecteerde golflengte en klik op OK. Markeer in het gedeelte plaatlay-out de putjes die moeten worden gelezen, klik op OK en klik op leesplaat, wacht tot de waarden op het scherm verschijnen en exporteer ze naar een spreadsheet om de resultaten te analyseren en de absorptiewaarden te berekenen met behulp van aftrekken zoals beschreven in het manuscript. In statistische analysesoftware plot u de concentratie van BZN versus de absorptie op 595 nanometer in de XY-tabel.Transformeer de BZN-concentraties naar logaritmische waarden door op analyseren te klikken, de transformatieoptie te selecteren en op OK te klikken. Voor het verkrijgen van IC50-waarden klikt u op analyseren en selecteert u in de lijst XY-analyse niet-lineaire regressiecurve passen en klikt u vervolgens op OK. Ga vervolgens naar het parametersvenster, ga op het modeltabblad naar de dosisresponsremmingsgroep van ingebouwde vergelijkingen, selecteer logremmer versus responsvariabele helling voor parameters omdat de dosisresponsmethode alle andere tabbladen op standaardwaarden laat staan en klik vervolgens op, ok.Klik op het gedeelte resultaten om de IC50-waarde, de SD en de goedheid van de pasvorm te vinden. Klik op de grafieksectie om de XY-grafiek te vinden van de logaritmische concentratie van het medicijn versus de absorptiewaarden en zorg ervoor dat de curve fit ook in een andere kleur wordt weergegeven. In deze studie was de IC50-waarde verkregen voor epimastigoten ongeveer 20 micromolair, vergelijkbaar met eerdere studies.Bovendien wezen de resultaten op liner beta galactosidase activiteit van de epimastigoten in de loop van de tijd. Het is erg belangrijk om ten minste replica's uit te voeren van elke geteste voorwaarde en geminimaliseerde fouten in volumebeheer.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Rapid One-step enzymatische synthese en All-waterige Zuivering van Trehalose analogen

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Een colorimetrische methode voor het meten van ijzergehalte in planten

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kwantificering van hypopigmentatie activiteit In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstructie van de celcyclus oscillaties in Micro van cel-vrije Xenopus ei extracten

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolatie van F1-ATPase van de parasitaire Protist Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Met behulp van hoog gehalte Imaging om te kwantificeren Target Engagement in Adherente cellen

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetische screening van Nuclease activiteit met behulp van nucleïnezuur sondes

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening op fyto-oestrogenen met behulp van een celgebaseerde oestrogeenreceptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

De afleiding van eiwitkristallen met I3C met behulp van Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...