Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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Nous remercions le Dr Buckner d’avoir aimablement fourni le plasmide pLacZ. Ce travail a été soutenu par Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva d’Argentine (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) et Research Council United Kingdom [MR/P027989/1]. Servier Medical Art a été utilisé pour produire la figure 1 (https://smart.servier.com).

REMARQUE : La figure 1 donne un aperçu de l’ensemble de la conception expérimentale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> Figure 1 : Vue d’ensemble du test de dépistage in vitro de la lignée Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ utilisant le CPRG comme substrat pour la réaction colorimétrique. Le test consiste à ensem...

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	<li>Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+mortality+in+chronic+Chagas+disease:+a+systematic+review+of+observational+studies.">Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies.</a> Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).</li><li>P&#233;rez-Molina, J. A., Molina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).</li><li>Messenger, L. A., Miles, M. 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M., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+drug+discovery+for+Chagas+disease.">Methodological advances in drug discovery for Chagas disease.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).</li><li>Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+technique+for+screening+drugs+for+activity+against+Trypanosoma+cruzi+using+parasites+expressing+beta-galactosidase.">Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).</li><li>Vega, C., Rol&#243;n, M., Mart&#237;nez-Fern&#225;ndez, A. R., Escario, J. A., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+pharmacological+screening+assay+with+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+expressing+beta-galactosidase.">A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase.</a> Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).</li><li>Bettiol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+classes+of+heteroaromatic+compounds+with+activity+against+intracellular+Trypanosoma+cruzi+by+chemical+library+screening.">Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).</li><li>Gulin, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+biological+validation+of+an+in+vitro+assay+using+the+transfected+Dm28c/pLacZ+Trypanosoma+cruzi+strain.">Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain.</a> Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).</li><li>da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Leishmania+cell+lines+expressing+high+levels+of+beta-galactosidase+as+alternative+tools+for+the+evaluation+of+anti-leishmanial+drug+activity.">Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity.</a> Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).</li><li>McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Moreno-Viguri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+anti-Trypanosoma+cruzi+activity+of+new+arylamine+Mannich+base-type+derivatives.">In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).</li><li>Garc&#237;a, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

Cet article décrit un test basé sur la détermination de l’activité cytoplasmique de la β-galactosidase libérée par la lyse membranaire des épimastigotes de T. cruzi, des trypomastigotes ou des cellules infectées par des amastigotes en présence du substrat CPRG. Nous avons utilisé des parasites T. cruzi Dm28c/pLacZ, une souche parasitaire stable obtenue après transfection avec un plasmide contenant de la β-galactosidase construit par Buckner et les co-auteurs10. Ce ...

La maladie de Chagas (ChD), ou trypanosomiase américaine, est une maladie parasitaire causée par le protozoaire flagellé, Trypanosoma cruzi (T. cruzi). La maladie coronarienne commence par une phase aiguë asymptomatique ou oligosymptomatique qui n’est généralement pas diagnostiquée, suivie d’une phase chronique à vie. Dans la chronicité, ~ 30% des patients manifestent - des décennies après l’infection - une variété de conditions débilitantes, y compris la myocardiopathie, les méga-syndromes digestifs, ou les deux, avec un taux de mortalité allant de 0,2% à 20%1,2,3. Les patients chroniques asymptomatiques peuvent ne présenter aucun signe clinique, mais rester séropositifs tout au long de leur vie.
Les estimations suggèrent qu’environ 7 millions de personnes sont infectées dans le monde, principalement en Provenance d’Amérique latine, où la maladie coronarienne est endémique. Dans ces pays, T. cruzi est principalement transmis par des punaises triatomines hématophages infectées (transmission à transmission vectorielle) et moins fréquemment par transmission orale par l’ingestion d’aliments contaminés par des excréments de triatomines contenant les parasites2. De plus, le parasite peut être transmis par le placenta des mères chagasiques aux nouveau-nés, par transfusion sanguine ou lors d’une transplantation d’organe. Ces moyens indépendants du vecteur de contracter l’infection et la migration humaine ont contribué à la propagation mondiale de la maladie, comme en témoigne un nombre croissant de cas en Amérique du Nord, en Europe et dans certains pays d’Afrique, de la Méditerranée orientale et du Pacifique occidental4. La maladie coronarienne est considérée comme une maladie négligée, car la transmission à transmission vectorielle est étroitement associée à la pauvreté et constitue un problème de santé publique majeur, en particulier dans les pays à faible revenu d’Amérique latine. Bien qu’il existe des traitements disponibles, la mortalité due à la maladie coronarienne en Amérique latine est la plus élevée parmi les maladies parasitaires, y compris le paludisme2.
Il existe deux médicaments homologués pour le traitement de la coronaropathie introduits à la fin des années 1960 et au début des années 1970 : le nifurtimox et le benznidazole5. Les deux médicaments sont efficaces dans la phase aiguë de la maladie chez les adultes, les enfants et les nouveau-nés infectés congénitalement, ainsi que chez les enfants atteints d’une infection chronique, où la guérison est généralement obtenue. Cependant, seules quelques personnes sont diagnostiquées assez tôt pour être traitées à temps. Selon les derniers essais cliniques, les deux médicaments ont des limites importantes chez les adultes et étaient inefficaces pour réduire les symptômes chez les personnes atteintes de maladies chroniques; par conséquent, leur utilisation à ce stade est controversée. D’autres inconvénients sont les périodes de traitement prolongées requises (60-90 jours) et les effets indésirables fréquents et graves observés, qui conduisent à l’arrêt du traitement chez une proportion de personnes infectées 6,7. On estime que moins de 10 % des personnes atteintes de coronaropathie ont été diagnostiquées, et encore moins ont accès à un traitement, car de nombreuses personnes touchées vivent dans des zones rurales où l’accès aux soins de santé est inexistant ou rare8. Ces faits soulignent le besoin urgent de trouver de nouveaux médicaments contre T. cruzi pour permettre des traitements plus efficaces, sûrs et applicables sur le terrain, en particulier pour la phase chronique. À cet égard, un autre défi dans le développement de composés plus efficaces est la limitation des systèmes d’évaluation de l’efficacité des médicaments in vitro et in vivo9.
Bien que la biologie chimique et les approches génomiques pour l’identification de cibles médicamenteuses potentielles aient été utilisées chez les parasites kinétoplastes, les outils génomiques disponibles chez T. cruzi sont limités contrairement à T. brucei ou Leishmania. Ainsi, le criblage des composés ayant une activité trypanocide reste l’approche la plus utilisée dans la recherche de nouveaux candidats médicaments chimiothérapeutiques contre la maladie de Huntington. Habituellement, la découverte de médicaments chez T. cruzi doit commencer par tester les effets d’un nouveau médicament dans un essai in vitro contre le stade épimastigote. Pendant des décennies, la seule façon de mesurer les effets inhibiteurs des composés candidats sur T. cruzi était le comptage microscopique manuel, qui est laborieux, long et dépendant de l’opérateur. De plus, cette approche convient pour l’analyse d’un petit nombre de composés, mais est inacceptable pour le criblage à haut débit de grandes bibliothèques de composés. De nos jours, de nombreuses recherches commencent par l’analyse d’un grand nombre de composés de différentes origines qui sont testés in vitro, testant leur capacité à inhiber la croissance des parasites. Des méthodes colorimétriques et fluorométriques ont été développées pour augmenter le débit dans ces essais, améliorant l’objectivité du criblage et rendant l’ensemble du processus moins fastidieux9.
L’une des méthodes colorimétriques les plus largement utilisées est basée sur l’activité β-galactosidase des parasites transfectés décrite pour la première fois par Bucknet et ses collaborateurs10. L’enzyme β-galactosidase exprimée par les parasites recombinants hydrolyse le substrat chromogène, le rouge chlorophénol β-D-galactopyranoside (CPRG), en rouge chlorophénol, qui peut être facilement mesuré colorimétriquement à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques. Ainsi, la croissance des parasites en présence d’une variété de composés peut être simultanément évaluée et quantifiée dans des plaques de microtitrage. Cette méthode a été appliquée pour tester des médicaments sous forme d’épimastigote (présents dans l’insecte vecteur), des trypomastigotes et des amastigotes intracellulaires, les stades mammifères du parasite. De plus, plusieurs souches recombinantes de T. cruzi transfectées avec le plasmide pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 (pLacZ)10 pour exprimer l’enzyme Escherichia coli β-galactosidase sont déjà disponibles (et de nouvelles peuvent être construites), ce qui permet d’évaluer les parasites de différentes unités de typage discrètes (DTU) qui peuvent ne pas se comporter également envers les mêmes composés 10,11,12,13 . Cette méthode a déjà été utilisée avec succès pour évaluer l’activité des composés contre T. cruzi dans le criblage à faible et à haut débit12,13. Des approches similaires ont également été utilisées chez d’autres parasites protozoaires, notamment Toxoplasma gondii et Leishmania mexicana14,15.
Cet article décrit et montre une méthode détaillée pour un dépistage in vitro des médicaments contre tous les stades du cycle de vie de T. cruzi en utilisant des parasites exprimant β-galactosidase. Les essais présentés ici ont été réalisés avec une lignée T. cruzi exprimant la β-galactosidase obtenue par transfection de la souche T. cruzi Dm28c du DTU I13 avec du plasmide pLacZ (Dm28c/pLacZ). De plus, le même protocole pourrait être facilement adapté à d’autres souches pour comparer les performances entre les composés et entre les souches de T. cruzi ou DTU.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi est l’agent causal de la maladie de Chagas (ChD), une maladie endémique d’importance pour la santé publique en Amérique latine qui affecte également de nombreux pays non endémiques en raison de l’augmentation de la migration. Cette maladie touche près de 8 millions de personnes, avec de nouveaux cas estimés à 50 000 par an. Dans les années 1960 et 70, deux médicaments pour le traitement de la maladie coronarienne ont été introduits: le nifurtimox et le benznidazole (BZN). Les deux sont efficaces chez les nouveau-nés et pendant la phase aiguë de la maladie, mais pas dans la phase chronique, et leur utilisation est associée à des effets secondaires importants. Ces faits soulignent le besoin urgent d’intensifier la recherche de nouveaux médicaments contre T. cruzi.
T. cruzi est transmis par les insectes vecteurs hématophages des familles Reduviidae et Hemiptera. Une fois dans l’hôte mammifère, il se multiplie intracellulairement sous forme d’amastigote non flagellée et se différencie en trypomastigote, la forme infectieuse non réplicative de la circulation sanguine. À l’intérieur de l’insecte vecteur, les trypomastigotes se transforment au stade de l’épimastigote et se multiplient par fission binaire.
Cet article décrit un essai basé sur la mesure de l’activité de la β-galactosidase cytoplasmique libérée dans la culture en raison de la lyse des parasites en utilisant le substrat, le rouge chlorophénol β-D-galactopyranoside (CPRG). Pour cela, la souche T. cruzi Dm28c a été transfectée avec un plasmide surexprimant la β-galactosidase et utilisée pour le dépistage pharmacologique in vitro dans les stades épimastigote, trypomastigote et amastigote. Cet article décrit également comment mesurer l’activité enzymatique dans les épimastigotes en culture, les cellules Vero infectées avec des amastigotes et les trypomastigotes libérées par les cellules cultivées en utilisant le médicament de référence, le benznidazole, comme exemple. Ce test colorimétrique est facilement effectué et peut être mis à l’échelle à un format à haut débit et appliqué à d’autres souches de T. cruzi .

Suivant le protocole décrit ci-dessus, β-galactosidase exprimant Dm28c épimastigotes ont été incubées avec 6 concentrations de BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (ou composés d’intérêt) pendant 72 h. Après cette période, un réactif CPRG a été ajouté avec un détergent, qui lyse les cellules et libère de la β-galactosidase. Le CPRG est clivé par la β-galactosidase pour produire du rouge chlorophénol, ce qui entraîne un changement de couleur du jaune au rougeâtre (Figure 2A</stron...

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In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

Nous décrivons un test colorimétrique à haut débit mesurant l’activité de la β-galactosidase à trois stades du cycle de vie de Trypanosoma cruzi, l’agent causal de la maladie de Chagas. Ce test peut être utilisé pour identifier les composés trypanocides de manière facile, rapide et reproductible.

In vitro Dépistage médicamenteux contre tous les stades du cycle de vie du trypanosoma cruzi à l’aide de parasites exprimant la β-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Ce protocole décrit un test colorimétrique à haut débit dans les trois étapes du cycle de vie de Trypanosoma cruzi afin d’identifier de nouveaux candidats médicaments pour la maladie de Chagas. Cela peut être utilisé pour identifier les composés trypanocides d’une manière facile, rapide et reproductible. Romina Manarin, technicienne en culture cellulaire de laboratoire du laboratoire de Pamela crib, fera la démonstration de la procédure.Commencez par cultiver la bêta galactosidase exprimant trypanosoma cruzi epimastigotes dans une fiole de culture tissulaire T-25 et incubez à 28 degrés Celsius pour les cultiver axeniquement. À l’aide d’une chambre de Neubauer, quantifiez la croissance du parasite avant de la sous-cultiver. Pour maintenir les cultures dans une phase logarithmique, sous-cultiver toutes les 48 à 72 heures dans cinq millilitres de milieu LIT complété par 10% FCS et de la geneticine dans le sulfate à une concentration finale de 200 microgrammes par millilitre.Ensuite, fermez solidement le capuchon avant d’incuber à 28 degrés Celsius en position verticale. À partir de la culture en phase logarithmique, faire une suspension d’épimastigote dans un milieu LIT complété par de la généticine et du sulfate à la concentration finale de 200 000 cellules par millilitre d’épimastigote par millilitre. Après avoir distribué 100 microlitres de suspension par puits d’une plaque de 96 puits, composez le volume final du puits de 200 microlitres avec un milieu.Fabriquer la suspension de cellules Vero dans du DMEM complété par 2% FCS à la concentration finale de 100 000 cellules par millilitre. Ensemencez 100 microlitres de la suspension par puits dans une plaque de culture tissulaire de 96 puits. Incuber les cellules pendant la nuit pour l’adhérence et le lendemain, observez les cellules au microscope.Le lendemain, rincez trois fois la monocouche de cellules Vero avec 100 microlitres de PBS stérile. Ajouter les trypomastigotes métacycliques précédemment obtenues. Ajouter une multiplicité d’infection ou de MOI de 10-1 dans 100 microlitres de DMEM complété par 2% FCS par puits et incuber pendant six heures comme démontré précédemment.À la fin de l’incubation, laver la plaque deux fois avec du PBS et ajouter 100 microlitres de DMEM sans rouge phénolique complété par 2% FCS. Après avoir fait la suspension des cellules Vero dans DMEM, ajoutez la concentration finale de 1 million de cellules par millilitre. Ensemencez 800 000 cellules dans cinq millilitres du milieu dans des flacons de T-25 et incubez pendant la nuit pour l’adhérence cellulaire.Une fois le ballon rincé avec du PBS, ajouter des trypomastigotes, ajouter un MOI de 10-1 dans cinq millilitres de DMEM complété par 2% FCS et incuber pendant la nuit comme démontré précédemment. À la fin de l’incubation, laver la fiole deux fois avec du PBS. Ajouter cinq millilitres de DMEM frais complété par 2% FCS et incuber pendant quatre jours.À la fin de l’incubation, après avoir observé la présence du surnageant pour les trypomastigotes au microscope optique. Quantifier les trypomastigotes à l’aide d’une chambre de Neubauer. Recueillir le surnageant dans un tube de 15 millilitres et centrifuger à 7 000 fois G pendant 10 minutes à température ambiante.Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension la pastille dans du DMEM sans rouge phénolique complété par 2% FCS pour obtenir une concentration de 1 million de trypomastigotes par millilitre. Ensemencez 100 microlitres de la suspension de trypomastigote par puits dans une plaque de 96 puits. Ajouter une solution de benznidazole aux épimastigotes, aux cellules Vero avec des amastigotes ou aux trypomastigotes comme décrit dans le manuscrit du texte.Ensuite, incubez les épimastigotes, réglez 28 degrés Celsius pendant 72 heures et les trypomastigotes ou cellules Vero infectées avec des amastigotes pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Pour le test colormétrique, configurez les puits vierges en ajoutant 100 microlitres de PBS ou de milieu correspondant. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de solution de substrat CPRG et 10 microlitres de la solution détergente à chaque puits pour obtenir une concentration finale de 200 CPRG micromolaires et 0,1% de détergent dans un volume final de 250 microlitres dans chaque puits.Après l’incubation, à 37 degrés Celsius pendant deux heures, mesurez l’absorbance à 595 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre à microplaques. Dans le logiciel, créez un nouveau protocole en sélectionnant l’absorbance comme méthode de détection et le point de terminaison comme type de lecture, puis cliquez sur OK. Ensuite, ajoutez une étape de lecture.Tapez la longueur d’onde sélectionnée et cliquez sur OK. Dans la section de mise en page de la plaque, marquez les puits à lire, cliquez sur OK, puis cliquez sur la plaque de lecture, attendez que les valeurs apparaissent à l’écran et exportez-les vers une feuille de calcul pour analyser les résultats et calculer les valeurs d’absorbance à l’aide de la soustraction décrite dans le manuscrit. Dans un logiciel d’analyse statistique, tracez la concentration de BZN par rapport à l’absorbance à 595 nanomètres dans le tableau XY.Transformez les concentrations de BZN en valeurs logarithmiques en cliquant sur Analyser, en sélectionnant l’option de transformation, puis en cliquant sur OK. Pour obtenir des valeurs IC50, cliquez sur Analyser, puis dans la liste Analyse XY, sélectionnez Ajustement de la courbe de régression non linéaire, puis cliquez sur OK. Ensuite, allez dans la fenêtre des paramètres, dans l’onglet modèle, allez dans le groupe d’inhibition dose-réponse des équations intégrées, sélectionnez inhibiteur de log par rapport à la pente de la variable de réponse pour les paramètres car la méthode dose-réponse laisse tous les autres onglets aux valeurs par défaut, puis cliquez, d’accord.Cliquez sur la section des résultats pour trouver la valeur IC50, la SD et la qualité de l’ajustement. Cliquez sur la section du graphique pour trouver le graphique XY de la concentration logarithmique du médicament par rapport aux valeurs d’absorbance et assurez-vous que l’ajustement de la courbe est également représenté sous une couleur différente. Dans la présente étude, la valeur de la CI50 obtenue pour les épimastigotes était d’environ 20 micromolaires, similaire aux études précédentes.En outre, les résultats ont indiqué l’activité de la bêta-galactosidase des épimastigotes au fil du temps. Il est très important d’effectuer au moins des réplications de chaque condition testée et de minimiser les erreurs dans la gestion des volumes.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

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Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

Recherche

Biochimie

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