Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
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Wir danken Dr. Buckner für die freundliche Bereitstellung des pLacZ-Plasmids. Diese Arbeit wurde von der Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, dem Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva aus Argentinien (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212) und dem Research Council United Kingdom [MR/P027989/1] unterstützt. Servier Medical Art wurde verwendet, um Abbildung 1 (https://smart.servier.com) zu erstellen.

HINWEIS: Ein Überblick über das gesamte Versuchsdesign ist in Abbildung 1 dargestellt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> Abbildung 1: Überblick über den in vitro Screening-Assay der Trypanosoma cruzi Dm28c/pLacZ-Linie unter Verwendung von CPRG als Substrat für die kolorimetrische Reaktion. Der Assay besteht aus d...

<ol>
	<li>Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+mortality+in+chronic+Chagas+disease:+a+systematic+review+of+observational+studies.">Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies.</a> Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).</li><li>P&#233;rez-Molina, J. A., Molina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).</li><li>Messenger, L. A., Miles, M. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+biological+validation+of+an+in+vitro+assay+using+the+transfected+Dm28c/pLacZ+Trypanosoma+cruzi+strain.">Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain.</a> Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).</li><li>da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Leishmania+cell+lines+expressing+high+levels+of+beta-galactosidase+as+alternative+tools+for+the+evaluation+of+anti-leishmanial+drug+activity.">Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity.</a> Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).</li><li>McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Moreno-Viguri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+anti-Trypanosoma+cruzi+activity+of+new+arylamine+Mannich+base-type+derivatives.">In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).</li><li>Garc&#237;a, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

Dieses Papier beschreibt einen Assay, der auf der Bestimmung der zytoplasmatischen β-Galactosidase-Aktivität basiert, die aufgrund der Membranlyse von T. cruzi epimastigotes, Trypomastigotes oder infizierten Zellen mit Amastigotes in Gegenwart des Substrats CPRG freigesetzt wird. Wir verwendeten T. cruzi Dm28c/pLacZ-Parasiten, einen stabilen Parasitenstamm, der nach Transfektion mit einem β-Galactosidase-tragenden Plasmid erhalten wurde, das von Buckner und Co-Autoren10 konstr...

Die Chagas-Krankheit (ChD) oder amerikanische Trypanosomiasis ist eine parasitäre Erkrankung, die durch den geißelten Protozoen Trypanosoma cruzi (T. cruzi) verursacht wird. ChD beginnt mit einer asymptomatischen oder oligosymptomatischen akuten Phase, die normalerweise nicht diagnostiziert wird, gefolgt von einer lebenslangen chronischen Phase. In der Chronizität manifestieren ~ 30% der Patienten Jahrzehnte nach der Infektion eine Vielzahl von schwächenden Zuständen, einschließlich Myokardiopathie, Mega-Verdauungssyndrome oder beides, mit einer Sterblichkeitsrate von 0,2% bis 20%1,2,3. Asymptomatische chronische Patienten haben möglicherweise keine klinischen Symptome, bleiben aber ihr ganzes Leben lang seropositiv.
Schätzungen zufolge sind weltweit ~ 7 Millionen Menschen infiziert, hauptsächlich aus Lateinamerika, wo ChD endemisch ist. In diesen Ländern wird T. cruzi hauptsächlich durch infizierte blutsaugende Triatomin-Käfer (vektorübertragene Übertragung) und seltener durch orale Übertragung durch die Aufnahme von Lebensmitteln übertragen, die mit Triatomin-Kot kontaminiert sind, der die Parasiten enthält2. Darüber hinaus kann der Parasit über die Plazenta von chagasischen Müttern auf Neugeborene, durch Bluttransfusionen oder während der Organtransplantation übertragen werden. Diese vektorunabhängigen Wege, die Infektion und die menschliche Migration zu erfassen, haben zur weltweiten Ausbreitung der Krankheit beigetragen, was sich in einer zunehmenden Zahl von Fällen in Nordamerika, Europa und einigen Ländern Afrikas, des östlichen Mittelmeerraums und des westlichen Pazifiks zeigt4. ChD gilt als vernachlässigte Krankheit, da die vektorübertragene Übertragung eng mit Armut verbunden ist und ein führendes Problem der öffentlichen Gesundheit ist, insbesondere in lateinamerikanischen Ländern mit niedrigem Einkommen. Obwohl es verfügbare Behandlungen gibt, ist die Mortalität aufgrund von ChD in Lateinamerika die höchste unter den parasitären Krankheiten, einschließlich Malaria2.
Es gibt zwei registrierte Medikamente für die ChD-Behandlung, die in den späten 1960er und frühen 1970er Jahren eingeführt wurden: Nifurtimox und Benznidazol5. Beide Medikamente sind in der akuten Phase der Erkrankung bei Erwachsenen, Kindern und angeborenen Neugeborenen sowie bei Kindern mit chronischer Infektion, bei denen die Heilung normalerweise erreicht wird, wirksam. Allerdings werden nur wenige Menschen früh genug diagnostiziert, um rechtzeitig behandelt zu werden. Nach den neuesten klinischen Studien haben beide Medikamente bei Erwachsenen erhebliche Einschränkungen und waren bei der Verringerung der Symptome bei Menschen mit chronischen Erkrankungen unwirksam; Daher ist ihre Verwendung in diesem Stadium umstritten. Weitere Nachteile sind die verlängerten Behandlungszeiten (60-90 Tage) und die häufigen, schwerwiegenden Nebenwirkungen, die bei einem Anteil der Infizierten 6,7 zum Absetzen der Therapie führen. Es wird geschätzt, dass weniger als 10% der Menschen mit ChD diagnostiziert wurden, und noch weniger haben Zugang zu Behandlung, da viele betroffene Personen in ländlichen Gebieten ohne oder mit knappem Zugang zur Gesundheitsversorgung leben8. Diese Tatsachen unterstreichen die dringende Notwendigkeit, neue Medikamente gegen T. cruzi zu finden, um effizientere, sicherere und auf das Feld anwendbare Behandlungen zu ermöglichen, insbesondere für die chronische Phase. In diesem Zusammenhang ist eine weitere Herausforderung bei der Entwicklung wirksamerer Verbindungen die Einschränkung von Systemen zur Bewertung der Wirksamkeit von Arzneimitteln in vitro und in vivo9.
Obwohl chemische Biologie und genomische Ansätze zur Identifizierung potenzieller Wirkstoffziele in Kinetoplastid-Parasiten verwendet wurden, sind die verfügbaren genomischen Werkzeuge in T. cruzi im Gegensatz zu T. brucei oder Leishmania begrenzt. Daher ist das Screening von Verbindungen mit trypanozidaler Aktivität immer noch der am häufigsten verwendete Ansatz bei der Suche nach neuen chemotherapeutischen Arzneimittelkandidaten gegen ChD. Normalerweise muss die Arzneimittelentdeckung in T. cruzi mit der Prüfung der Wirkungen eines neuen Arzneimittels in einem In-vitro-Assay gegen das Epimastigote-Stadium beginnen. Jahrzehntelang war die einzige Möglichkeit, die hemmenden Wirkungen von Kandidatenverbindungen auf T. cruzi zu messen, die manuelle mikroskopische Zählung, die mühsam, zeitaufwendig und bedienerabhängig ist. Darüber hinaus eignet sich dieser Ansatz für die Untersuchung einer kleinen Anzahl von Verbindungen, ist jedoch für das Hochdurchsatz-Screening großer Verbindungsbibliotheken inakzeptabel. Heutzutage beginnen viele Untersuchungen mit der Analyse einer großen Anzahl von Verbindungen unterschiedlicher Herkunft, die in vitro untersucht werden, um ihre Fähigkeit zur Hemmung des Parasitenwachstums zu testen. Sowohl kolorimetrische als auch fluorometrische Methoden wurden entwickelt, um den Durchsatz in diesen Assays zu erhöhen, die Objektivität des Screenings zu verbessern und den gesamten Prozess weniger langwierigzu machen 9.
Eine der am weitesten verbreiteten kolorimetrischen Methoden basiert auf der β-Galactosidase-Aktivität transfizierter Parasiten, die erstmals von Bucknet und Mitarbeiternbeschrieben wurde 10. Das von den rekombinanten Parasiten exprimierte β-Galactosidase-Enzym hydrolysiert das chromogene Substrat, Chlorphenolrot β-D-Galactopyranosid (CPRG), zu Chlorphenolrot, das mit einem Mikroplattenspektralphotometer leicht kolorimetrisch gemessen werden kann. So kann das Parasitenwachstum in Gegenwart einer Vielzahl von Verbindungen gleichzeitig bewertet und in Mikrotiterplatten quantifiziert werden. Diese Methode wurde angewendet, um Medikamente in Epimastigot-Formen (im Insektenvektor vorhanden), Trypomastigotes und intrazellulären Amastigotes, den Säugetierstadien des Parasiten, zu testen. Darüber hinaus sind bereits mehrere rekombinante T. cruzi-Stämme verfügbar, die mit dem pBS:CL-Neo-01/BC-X-10-Plasmid (pLacZ)10 transfiziert wurden, um das Escherichia coli-β-Galactosidase-Enzym zu exprimieren (und neue können konstruiert werden), was die Bewertung von Parasiten aus verschiedenen diskreten Typisierungseinheiten (DTUs) ermöglicht, die sich möglicherweise nicht gleichmäßig gegenüber denselben Verbindungen verhalten 10,11,12,13 . Diese Methode wurde bereits erfolgreich zur Bewertung von Verbindungen auf Aktivität gegen T. cruzi im Niedrig- und Hochdurchsatz-Screening12,13 eingesetzt. Ähnliche Ansätze wurden auch bei anderen Protozoenparasiten verwendet, darunter Toxoplasma gondii und Leishmania mexicana14,15.
Dieses Papier beschreibt und zeigt eine detaillierte Methode für ein In-vitro-Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von T. cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren. Die hier vorgestellten Assays wurden mit einer β-Galactosidase-exprimierenden T. cruzi-Linie durchgeführt, die durch Transfektion von T. cruzi Dm28c-Stamm aus DTU I13 mit pLacZ-Plasmid (Dm28c/pLacZ) erhalten wurde. Darüber hinaus könnte das gleiche Protokoll leicht an andere Stämme angepasst werden, um die Leistung zwischen Verbindungen und zwischen T. cruzi-Stämmen oder DTUs zu vergleichen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi ist der Erreger der Chagas-Krankheit (ChD), einer endemischen Krankheit von Bedeutung für die öffentliche Gesundheit in Lateinamerika, die aufgrund der Zunahme der Migration auch viele nicht-endemische Länder betrifft. Diese Krankheit betrifft fast 8 Millionen Menschen, wobei neue Fälle auf 50.000 pro Jahr geschätzt werden. In den 1960er und 70er Jahren wurden zwei Medikamente zur ChD-Behandlung eingeführt: Nifurtimox und Benznidazol (BZN). Beide sind wirksam bei Neugeborenen und während der akuten Phase der Krankheit, aber nicht in der chronischen Phase, und ihre Verwendung ist mit wichtigen Nebenwirkungen verbunden. Diese Tatsachen unterstreichen die dringende Notwendigkeit, die Suche nach neuen Medikamenten gegen T. cruzi zu intensivieren.
T. cruzi wird durch hämatophage Insektenvektoren der Familien Reduviidae und Hemiptera übertragen. Einmal im Säugetierwirt, multipliziert es sich intrazellulär als die nicht geißelte amastigote Form und differenziert sich in die Trypomastigote, die nicht-replizierende infektiöse Form des Blutkreislaufs. Innerhalb des Insektenvektors wandeln sich Trypomastigoten in das Epimastigote-Stadium um und vermehren sich durch binäre Spaltung.
Diese Arbeit beschreibt einen Assay, der auf der Messung der Aktivität der zytoplasmatischen β-Galactosidase, die aufgrund der Parasitenlyse in die Kultur freigesetzt wird, unter Verwendung des Substrats Chlorphenolrot β-D-Galactopyranosid (CPRG) basiert. Zu diesem Zweck wurde der T. cruzi Dm28c-Stamm mit einem β-Galactosidase-überexprimierenden Plasmid transfiziert und für das pharmakologische In-vitro-Screening in Epimastigote-, Trypomastigote- und Amastigote-Stadien verwendet. Dieses Papier beschreibt auch, wie man die enzymatische Aktivität in kultivierten Epimastigoten, infizierten Vero-Zellen mit Amastigoten und Trypomastigotes, die aus den kultivierten Zellen freigesetzt werden, am Beispiel des Referenzarzneimittels, Benznidazol, messen kann. Dieser kolorimetrische Assay ist einfach durchzuführen und kann auf ein Hochdurchsatzformat skaliert und auf andere T. cruzi-Stämme angewendet werden.

Nach dem oben beschriebenen Protokoll wurden β-Galactosidase-exprimierende Dm28c-Epimastigoten mit 6 Konzentrationen von BZN (2,5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (oder interessanten Verbindungen) für 72 h inkubiert. Nach dieser Zeit wurde CPRG-Reagenz zusammen mit Reinigungsmittel hinzugefügt, das die Zellen lysiert und β-Galactosidase freisetzt. CPRG wird durch die β-Galactosidase gespalten, um Chlorphenolrot zu erzeugen, was zu einer Farbänderung von gelb zu rötlich führt (Abbildung 2A). C...

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In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

Wir beschreiben einen kolorimetrischen Hochdurchsatz-Assay zur Messung der β-Galactosidase-Aktivität in drei Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi, dem Erreger der Chagas-Krankheit. Dieser Assay kann verwendet werden, um trypanozide Verbindungen auf einfache, schnelle und reproduzierbare Weise zu identifizieren.

In vitro Arzneimittelscreening gegen alle Lebenszyklusstadien von Trypanosoma cruzi unter Verwendung von Parasiten, die β-Galactosidase exprimieren

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Dieses Protokoll beschreibt einen kolorimetrischen Hochdurchsatz-Assay in den drei Lebenszyklusphasen von Trypanosoma cruzi zur Identifizierung neuer Arzneimittelkandidaten für die Chagas-Krankheit. Dies kann verwendet werden, um trypanozide Verbindungen auf einfache, schnelle und reproduzierbare Weise zu identifizieren. Das Verfahren wird von Romina Manarin, einer Laborzellkulturtechnikerin aus dem Labor von Pamela crib, demonstriert.Beginnen Sie mit der Kultivierung von Beta-Galactosidase, die Trypanosoma cruzi epimastigotes in einem T-25-Gewebekulturkolben exprimieren, und inkubieren Sie bei 28 Grad Celsius, um sie axenisch zu züchten. Quantifizieren Sie mit einer Neubauer-Kammer das Parasitenwachstum, bevor Sie subkultivieren. Um die Kulturen in einer logarithmischen Phase zu halten, subkulturieren Sie alle 48 bis 72 Stunden in fünf Millilitern LIT-Medium, ergänzt mit 10% FCS und Geneticin in Sulfat bei einer Endkonzentration von 200 Mikrogramm pro Milliliter.Schließen Sie dann die Kappe sicher, bevor Sie bei 28 Grad Celsius in vertikaler Position inkubieren. Aus der Log-Phase-Kultur wird eine Suspension von Epimastigot in LIT-Medium hergestellt, die mit Geneticin und Sulfat in der Endkonzentration von 200.000 Zellen pro Milliliter Epimastigot pro Milliliter ergänzt wird. Nach der Abgabe von 100 Mikrolitern Suspension pro Vertiefung einer 96-Well-Platte, Make-up-Endvolumen von gut 200 Mikroliter mit Medium.Machen Sie die Vero-Zellsuspension in DMEM ergänzt mit 2% FCS bei der Endkonzentration von 100.000 Zellen pro Milliliter. Samen Sie 100 Mikroliter der Suspension pro Vertiefung in eine 96-Well-Gewebekulturplatte. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht für die Anhaftung und am nächsten Tag beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop.Am nächsten Tag spülen Sie die Vero-Zell-Monoschicht dreimal mit 100 Mikrolitern sterilem PBS ab. Fügen Sie zuvor erhaltene metazyklische Trypomastigotes hinzu. Fügen Sie eine Vielzahl von Infektionen oder MOI von 10-1 in 100 Mikrolitern DMEM hinzu, die mit 2% FCS pro Vertiefung ergänzt werden, und inkubieren Sie sechs Stunden lang, wie zuvor gezeigt.Waschen Sie die Platte am Ende der Inkubation zweimal mit PBS und fügen Sie 100 Mikroliter DMEM ohne Phenolrot hinzu, ergänzt mit 2% FCS. Nach der Herstellung der Vero-Zellsuspension in DMEM fügen Sie die Endkonzentration von 1 Million Zellen pro Milliliter hinzu. Samen Sie 800.000 Zellen in fünf Millilitern des Mediums in T-25-Kolben und inkubieren Sie über Nacht für die Zelladhärenz.Sobald der Kolben mit PBS gespült ist, fügen Sie Trypomastigotes hinzu, fügen Sie ein MOI von 10-1 in fünf Millilitern DMEM hinzu, das mit 2% FCS ergänzt wird, und inkubieren Sie über Nacht, wie zuvor gezeigt. Waschen Sie den Kolben am Ende der Inkubation zweimal mit PBS. Fügen Sie fünf Milliliter frisches DMEM hinzu, das mit 2% FCS ergänzt wird, und inkubieren Sie vier Tage lang.Am Ende der Inkubation, nach der Beobachtung des Überstands für Trypomastigotes Anwesenheit unter einem optischen Mikroskop. Quantifizieren Sie die Trypomastigoten mit einer Neubauer-Kammer. Sammeln Sie den Überstand in einem 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 7.000 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Dann entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in DMEM ohne Phenolrot, ergänzt mit 2% FCS, um eine Konzentration von 1 Million Trypomastigoten pro Milliliter zu erhalten. Samen Sie 100 Mikroliter der Trypomastigot-Suspension pro Well in einer 96-Well-Platte. Fügen Sie Benznidazollösung zu Epimastigoten, Vero-Zellen mit Amastigoten oder Trypomastigotes hinzu, wie im Textmanuskript beschrieben.Dann inkubieren Sie die Epimastigotes, setzen Sie 28 Grad Celsius für 72 Stunden und die Trypomastigotes oder infizierten Vero-Zellen mit Amastigotes für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Für den farbmetrischen Assay richten Sie die leeren Vertiefungen ein, indem Sie 100 Mikroliter PBS oder das entsprechende Medium hinzufügen. Als nächstes fügen Sie 40 Mikroliter CPRG-Substratlösung und 10 Mikroliter der Reinigungsmittellösung zu jeder Vertiefung hinzu, um eine Endkonzentration von 200 mikromolaren CPRG und 0,1% Reinigungsmittel in einem Endvolumen von 250 Mikrolitern in jeder Vertiefung zu erhalten.Nach der Inkubation messen Sie bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden die Absorption bei 595 Nanometern mit einem Mikroplatten-Spektralphotometer. Erstellen Sie in der Software ein neues Protokoll, indem Sie Absorption als Erkennungsmethode und Endpunkt als Lesetyp auswählen, und klicken Sie dann auf OK. Fügen Sie als Nächstes einen Leseschritt hinzu.Geben Sie die ausgewählte Wellenlänge ein und klicken Sie auf OK. Markieren Sie im Abschnitt Plattenlayout die zu lesenden Vertiefungen, klicken Sie auf OK und klicken Sie auf Platte lesen, warten Sie, bis die Werte auf dem Bildschirm angezeigt werden, und exportieren Sie sie in eine Tabelle, um die Ergebnisse zu analysieren und die Absorptionswerte mit Subtraktion zu berechnen, wie im Manuskript beschrieben. Zeichnen Sie in einer statistischen Analysesoftware die Konzentration von BZN im Vergleich zur Absorption bei 595 Nanometern in der XY-Tabelle auf.Transformieren Sie die BZN-Konzentrationen in logarithmische Werte, indem Sie auf Analysieren klicken, die Option Transformieren auswählen und auf OK klicken. Um IC50-Werte zu erhalten, klicken Sie auf Analysieren, wählen Sie in der Liste XY-Analyse die Option Nichtlineare Regressionskurvenanpassung aus, und klicken Sie dann auf OK. Gehen Sie als Nächstes zum Parameterfenster, gehen Sie auf der Registerkarte Modell zur Dosis-Wirkungs-Hemmungsgruppe der integrierten Gleichungen, wählen Sie log inhibitor versus response variable slope für Parameter, während die Dosis-Wirkungs-Methode alle anderen Registerkarten auf Standardwerten belässt und dann auf okay klickt.Klicken Sie auf den Ergebnisabschnitt, um den IC50-Wert, den SD und die Güte der Passform zu finden. Klicken Sie auf den Diagrammabschnitt, um das XY-Diagramm der logarithmischen Konzentration des Arzneimittels im Vergleich zu den Absorptionswerten zu finden und sicherzustellen, dass die Kurvenanpassung auch in einer anderen Farbe grafisch dargestellt wird. In der vorliegenden Studie betrug der für Epimastigotes erhaltene IC50-Wert etwa 20 Mikromolaren, ähnlich wie in früheren Studien.Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse eine Liner-beta-Galactosidase-Aktivität der Epimastigoten im Laufe der Zeit. Es ist sehr wichtig, mindestens Replikationen jedes getesteten Zustands durchzuführen und Fehler im Volume-Management zu minimieren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Schnelle Ein-Schritt-enzymatische Synthese und All-wässrige Reinigung von Trehalose Analogen

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

Forschung

Biochemie

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Ein kolorimetrischen Verfahren zur Messung der Eisengehalt in Pflanzen

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Quantifizierung der Hypopigmentation Aktivität In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Rekonstitution des Zellzyklus Schwingungen in Mikroemulsionen zellfreie Xenopus Ei Extrakte

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolierung der F1-ATPase aus der parasitären protiste Trypanosomen Trypanosomen

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

Verwendung von hohen Gehalt Imaging zu Target Engagement in adhärenten Zellen zu quantifizieren

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

Kinetisches Screening der Nuklease-Aktivität mit Nukleinsäuresonden

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening auf Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitoren

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Screening auf Phytoöstrogene mit einem Zell-basierten Östrogen-Rezeptor β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Ableitung von Proteinkristallen mit I3C mit Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...