Name: in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase
Uploaded: 2021-11-05T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

אנו מודים לד"ר באקנר על שסיפק בחביבות את הפלסמיד pLacZ. עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, Ministerio de Ciencia e Innovación Productiva מארגנטינה (PICT2016-0439, PICT2019-0526, PICT2019-4212), ומועצת המחקר של בריטניה [MR/P027989/1]. אמנות רפואית Servier שימשה ליצירת איור 1 (https://smart.servier.com).

הערה: סקירה כללית של כל התכנון הניסיוני מתוארת באיור 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63210/63210fig01.jpg"> איור 1: סקירה כללית של בדיקת הסינון במבחנה של קו Tripanosoma cruzi Dm28c/pLacZ תוך שימוש ב-CPRG כמצע לתגובה הקולורימטרית.</stro...

<ol>
	<li>Rassi, A., Rassi, A., Rassi, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictors+of+mortality+in+chronic+Chagas+disease:+a+systematic+review+of+observational+studies.">Predictors of mortality in chronic Chagas disease: a systematic review of observational studies.</a> Circulation. 115 (9), 1101-1108 (2007).</li><li>P&#233;rez-Molina, J. A., Molina, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas+disease.">Chagas disease.</a> The Lancet. 391 (10115), 82-94 (2018).</li><li>Messenger, L. A., Miles, M. A., Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Between+a+bug+and+a+hard+place:+Trypanosoma+cruzi+genetic+diversity+and+the+clinical+outcomes+of+Chagas+disease.">Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (8), 995-1029 (2015).</li><li>Steverding, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+history+of+Chagas+disease.">The history of Chagas disease.</a> Parasites &amp; Vectors. 7, 317 (2014).</li><li>Viotti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+paradigm+shift+in+the+treatment+of+chronic+Chagas+disease.">Towards a paradigm shift in the treatment of chronic Chagas disease.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (2), 635-639 (2014).</li><li>Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chagas’+Disease.">Chagas’ Disease.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (19), 1882 (2015).</li><li>Bustamante, J. M., Tarleton, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methodological+advances+in+drug+discovery+for+Chagas+disease.">Methodological advances in drug discovery for Chagas disease.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 6 (6), 653-661 (2011).</li><li>Buckner, F. S., Verlinde, C. L., La Flamme, A. C., Van Voorhis, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+technique+for+screening+drugs+for+activity+against+Trypanosoma+cruzi+using+parasites+expressing+beta-galactosidase.">Efficient technique for screening drugs for activity against Trypanosoma cruzi using parasites expressing beta-galactosidase.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 40 (11), 2592-2597 (1996).</li><li>Vega, C., Rol&#243;n, M., Mart&#237;nez-Fern&#225;ndez, A. R., Escario, J. A., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+pharmacological+screening+assay+with+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes+expressing+beta-galactosidase.">A new pharmacological screening assay with Trypanosoma cruzi epimastigotes expressing beta-galactosidase.</a> Parasitology Research. 95 (4), 296-298 (2005).</li><li>Bettiol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+three+classes+of+heteroaromatic+compounds+with+activity+against+intracellular+Trypanosoma+cruzi+by+chemical+library+screening.">Identification of three classes of heteroaromatic compounds with activity against intracellular Trypanosoma cruzi by chemical library screening.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 3 (2), 384 (2009).</li><li>Gulin, J. E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+biological+validation+of+an+in+vitro+assay+using+the+transfected+Dm28c/pLacZ+Trypanosoma+cruzi+strain.">Optimization and biological validation of an in vitro assay using the transfected Dm28c/pLacZ Trypanosoma cruzi strain.</a> Biology Methods and Protocols. 6 (1), 004 (2021).</li><li>da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., Dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Leishmania+cell+lines+expressing+high+levels+of+beta-galactosidase+as+alternative+tools+for+the+evaluation+of+anti-leishmanial+drug+activity.">Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity.</a> Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).</li><li>McFadden, D. C., Seeber, F., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Toxoplasma+gondii+expressing+beta-galactosidase+for+colorimetric+assessment+of+drug+activity+in+vitro.">Use of Toxoplasma gondii expressing beta-galactosidase for colorimetric assessment of drug activity in vitro.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 41 (9), 1849-1853 (1997).</li><li>Moreno-Viguri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+anti-Trypanosoma+cruzi+activity+of+new+arylamine+Mannich+base-type+derivatives.">In vitro and in vivo anti-Trypanosoma cruzi activity of new arylamine Mannich base-type derivatives.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59 (24), 10929-10945 (2016).</li><li>Garc&#237;a, P., Alonso, V. L., Serra, E., Escalante, A. M., Furlan, R. L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+biologically+active+bromodomain+inhibitor+by+target-directed+dynamic+combinatorial+chemistry.">Discovery of a biologically active bromodomain inhibitor by target-directed dynamic combinatorial chemistry.</a> ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (10), 1002-1006 (2018).</li><li>Vela, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+susceptibility+of+Trypanosoma+cruzi+discrete+typing+units+(DTUs)+to+benznidazole:+A+systematic+review+and+meta-analysis.">In vitro susceptibility of Trypanosoma cruzi discrete typing units (DTUs) to benznidazole: A systematic review and meta-analysis.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009269 (2021).</li><li>Alonso-Padilla, J., Rodr&#237;guez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+for+anti-Trypanosoma+cruzi+drug+discovery.">High throughput screening for anti-Trypanosoma cruzi drug discovery.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (12), 3259 (2014).</li><li>Martinez-Peinado, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amaryllidaceae+alkaloids+with+anti-Trypanosoma+cruzi+activity.">Amaryllidaceae alkaloids with anti-Trypanosoma cruzi activity.</a> Parasites &amp; Vectors. 13 (1), 299 (2020).</li><li>Puente, V., Demaria, A., Frank, F. M., Batlle, A., Lombardo, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-parasitic+effect+of+vitamin+C+alone+and+in+combination+with+benznidazole+against+Trypanosoma+cruzi.">Anti-parasitic effect of vitamin C alone and in combination with benznidazole against Trypanosoma cruzi.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006764 (2018).</li><li>Muelas-Serrano, S., Nogal-Ruiz, J. J., G&#243;mez-Barrio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+of+a+colorimetric+method+to+determine+the+viability+of+Trypanosoma+cruzi+epimastigotes.">Setting of a colorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes.</a> Parasitology Research. 86 (12), 999-1002 (2000).</li></ol>

מאמר זה מתאר בדיקה המבוססת על קביעת הפעילות הציטופלסמית β-גלקטוזידאז ששוחררה עקב תזה של T. cruzi epimastigotes, טריפומסטיגוטים, או תאים נגועים עם amastigotes בנוכחות המצע CPRG. השתמשנו בטפילי T. cruzi Dm28c/pLacZ, זן טפיל יציב המתקבל לאחר טרנספקציה עם פלסמיד נושא β-גלקטוזידאז שנבנה על ידי באקנר ומחבריו המ?...

מחלת צ'אגאס (ChD), או טריפנוסומיאזיס אמריקאית, היא מחלה טפילית הנגרמת על ידי הפרוטוזואן המופלג, טריפנוסומה קרוזי (T. cruzi). ChD מתחיל עם שלב אקוטי אסימפטומטי או אוליגוסימפטומטי שבדרך כלל אינו מאובחן, ואחריו שלב כרוני לכל החיים. בכרוניות, כ-30% מהחולים מתגלים עשרות שנים לאחר ההדבקה - מגוון מצבים מתישים, כולל שריר הלב, תסמונות מגה-עיכוליות או שניהם, עם שיעור תמותה שנע בין 0.2% ל-20%1,2,3. חולים כרוניים אסימפטומטיים עשויים להיות ללא סימנים קליניים, אך הם נשארים סרופוסיטיים לאורך כל חייהם.
ההערכות מצביעות על כך שכ-7 מיליון בני אדם נדבקו ברחבי העולם, רובם מאמריקה הלטינית, שם ChD אנדמי. במדינות אלה, T. cruzi מועבר בעיקר באמצעות חרקי טריאטומין מוצצי דם נגועים (העברה הנישאת על ידי וקטורים) ופחות על ידי העברה דרך הפה דרך בליעה של מזון מזוהם בצואה triatomine המכילה את הטפילים2. בנוסף, הטפיל יכול להיות מועבר דרך השליה מאמהות chagasic לילודים, באמצעות עירויי דם, או במהלך השתלת איברים. דרכים בלתי תלויות וקטורים אלה לרכישת הזיהום וההגירה האנושית תרמו להתפשטות העולמית של המחלה, עדות למספר גדל והולך של מקרים בצפון אמריקה, אירופה, ובכמה מדינות אפריקאיות, מזרח ים תיכוניות ומערב האוקיינוס השקט4. ChD נחשבת למחלה מוזנחת שכן העברה הנישאת על ידי וקטורים קשורה קשר הדוק לעוני והיא נושא מוביל לבריאות הציבור, במיוחד במדינות בעלות הכנסה נמוכה באמריקה הלטינית. למרות שישנם טיפולים זמינים, התמותה עקב ChD באמריקה הלטינית היא הגבוהה ביותר בקרב מחלות טפיליות, כולל מלריה2.
ישנן שתי תרופות רשומות לטיפול ChD שהוצגו בסוף שנות ה-60 ותחילת שנות ה-70 של המאה ה-20: ניפורטימוקס ובנזנידזול5. שתי התרופות יעילות בשלב החריף של המחלה במבוגרים, ילדים ותינוקות נגועים מולדת, כמו גם בילדים עם זיהום כרוני, שם בדרך כלל מושגת תרופה. עם זאת, רק אנשים מעטים מאובחנים מוקדם מספיק כדי להיות מטופלים בזמן. על פי הניסויים הקליניים האחרונים, לשתי התרופות יש מגבלות חשובות במבוגרים והן לא היו יעילות בהפחתת הסימפטומים אצל אנשים עם מחלות כרוניות; לפיכך, השימוש בהם בשלב זה שנוי במחלוקת. חסרונות אחרים הם תקופות הטיפול הממושכות הנדרשות (60-90 יום) ותופעות הלוואי השכיחות והחמורות שנצפו, המובילות להפסקת הטיפול אצל חלק מהאנשים הנגועים 6,7. ההערכה היא כי פחות מ -10% מהאנשים עם ChD אובחנו, ועוד פחות מהם יש גישה לטיפול, שכן אנשים מושפעים רבים חיים באזורים כפריים ללא גישה או גישה נדירה לשירותי בריאות8. עובדות אלה מדגישות את הצורך הדחוף במציאת תרופות חדשות נגד T. cruzi כדי לאפשר טיפולים יעילים, בטוחים וישימים יותר בשטח, במיוחד עבור השלב הכרוני. בהקשר זה, אתגר נוסף בפיתוח תרכובות יעילות יותר הוא הגבלת המערכות להערכת יעילות התרופה במבחנה וב-in vivo9.
אף על פי שביולוגיה כימית וגישות גנומיות לזיהוי מטרות פוטנציאליות של תרופות שימשו בטפילים קינטופלסטיים, הכלים הגנומיים הזמינים ב- T. cruzi מוגבלים בניגוד ל - T. brucei או Leishmania. לפיכך, סינון של תרכובות עם פעילות טריפנוצידלית הוא עדיין הגישה הנפוצה ביותר בחיפוש אחר מועמדים חדשים לתרופות כימותרפיות נגד ChD. בדרך כלל, גילוי תרופות ב - T. cruzi חייב להתחיל בבדיקת ההשפעות של תרופה חדשה בבדיקה חוץ גופית נגד שלב האפימסטיגוטה. במשך עשרות שנים, הדרך היחידה למדוד את ההשפעות המעכבות של תרכובות מועמדות על T. cruzi הייתה ספירה מיקרוסקופית ידנית, שהיא מייגעת, גוזלת זמן ותלויה במפעיל. יתר על כן, גישה זו מתאימה לבדיקת מספר קטן של תרכובות, אך אינה מקובלת על סינון בתפוקה גבוהה של ספריות תרכובות גדולות. כיום, מחקרים רבים מתחילים בניתוח של מספר עצום של תרכובות ממקורות שונים שנבדקו במבחנה, ובודקים את יכולתם לעכב את צמיחת הטפילים. הן שיטות קולורימטריות והן שיטות פלואורומטריות פותחו כדי להגדיל את התפוקה במבחנים אלה, לשפר את האובייקטיביות של ההקרנה ולהפוך את התהליך כולו לפחות מייגע9.
אחת השיטות הקולורימטריות הנפוצות ביותר מבוססת על פעילות β-גלקטוזידאז של טפילים טרנספקטים שתוארו לראשונה על ידי Bucknet ומשתפי פעולה10. האנזים β-גלקטוזידאז המבוטא על ידי הטפילים הרקומביננטיים עושה הידרוליזה של המצע הכרומוגני, כלורופנול אדום β-D-גלקטופירנוזיד (CPRG), לכלורופנול אדום, שניתן למדוד בקלות בצבע באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-פלטה. לפיכך, צמיחת טפיל בנוכחות מגוון של תרכובות ניתן להעריך בו זמנית וכמות בלוחות microtiter. שיטה זו יושמה לבדיקת תרופות בצורות אפימסטיקוטה (הקיימות בווקטור החרקים), טריפומסטיגוטים, ואמאסטיגוטים תוך תאיים, שלבי היונקים של הטפיל. יתר על כן, מספר זני T. cruzi רקומביננטיים שעברו טרנספקטציה עם pBS:CL-Neo-01/BC-X-10 פלסמיד (pLacZ)10 כדי לבטא את האנזים Escherichia coli β-galactosidase כבר זמינים (וניתן לבנות חדשים), המאפשר הערכה של טפילים מיחידות הקלדה נפרדות שונות (DTUs) שאולי לא יתנהגו באופן שווה כלפי אותן תרכובות 10,11,12,13 . שיטה זו כבר שימשה בהצלחה להערכת תרכובות לפעילות מול T. cruzi בסינון בתפוקה נמוכה וגבוהה12,13. גישות דומות שימשו גם בטפילים פרוטוזואנים אחרים, כולל טוקסופלזמה גונדי ולישמניה מקסיקנה14,15.
מאמר זה מתאר ומראה שיטה מפורטת לבדיקת תרופות במבחנה כנגד כל שלבי מחזור החיים של T. cruzi באמצעות טפילים המבטאים β-גלקטוזידאז. הבדיקות המוצגות כאן בוצעו עם קו T. cruzi מבטא β-galactosidase המתקבל על ידי טרנספקציה של זן T. cruzi Dm28c מ- DTU I13 עם פלסמיד pLacZ (Dm28c/ pLacZ). בנוסף, ניתן היה להתאים את אותו פרוטוקול בקלות לזנים אחרים כדי להשוות את הביצועים בין תרכובות ובין זני T. cruzi או DTUs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 L beaker</td>
			<td>Schott Duran</td>
			<td>10005227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP211010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipette sterile</td>
			<td>Jet Biofil</td>
			<td>GSP010005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benznidazole</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>419656</td>
			<td>N-Benzyl-2-nitro-1H-imidazole-1-acetamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafty Cabinet</td>
			<td>Telstar</td>
			<td>Bio II A/P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 15 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tube 50 mL conical bottom sterile</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>546041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-15A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 884308001</td>
			<td>Chlorophenol Red-&#946;-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, High Glucose</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>12100046</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sintorgan</td>
			<td>SIN-061</td>
			<td>Dimethylsulfoxid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Internegocios SA</td>
			<td>FCS FRA 500</td>
			<td>Sterile and heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418 disulphate salt solution</td>
			<td>Roche</td>
			<td>G418-RO</td>
			<td>stock concentration: 50 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose D(+)</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>716214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graduated cylinder</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>3663-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin</td>
			<td>Frontier Scientific</td>
			<td>H651-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>867212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver Infusion</td>
			<td>Difco</td>
			<td>226920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Tarson</td>
			<td>500010-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate Spectrophotometer</td>
			<td>Biotek</td>
			<td>Synergy HTX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>834214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>750214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Boeco</td>
			<td>BOE 01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>Antrace</td>
			<td>NIDP40</td>
			<td>2-[4-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>Graphpad</td>
			<td></td>
			<td>Statistical Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Cicarelli</td>
			<td>929211</td>
			<td>NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Cientific</td>
			<td>75004380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-25 flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1106760500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vero cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1587</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro drug screening against all life cycle stages of trypanosoma cruzi using parasites expressing &#946;-galactosidase

טריפנוזומה קרוזי היא הסוכן הסיבתי של מחלת צ'אגאס (ChD), מחלה אנדמית בעלת חשיבות לבריאות הציבור באמריקה הלטינית המשפיעה גם על מדינות רבות שאינן אנדמיות בשל העלייה בהגירה. מחלה זו משפיעה על כמעט 8 מיליון בני אדם, כאשר מספר הנדבקים החדשים מוערך ב-50,000 בשנה. בשנות ה-60 וה-70 של המאה ה-20 הוצגו שתי תרופות לטיפול ב-ChD: ניפורטימוקס ובנזנידזול (BZN). שניהם יעילים בתינוקות ובשלב החריף של המחלה אך לא בשלב הכרוני, והשימוש בהם קשור לתופעות לוואי חשובות. עובדות אלה מדגישות את הצורך הדחוף להגביר את החיפוש אחר תרופות חדשות נגד T. cruzi.
T. cruzi מועבר דרך וקטורים של חרקים hematophagous של משפחות Reduviidae ו- Hemiptera. ברגע שהוא נמצא בפונדקאי היונקים, הוא מתרבה באופן תוך-תאי כצורת האמאסטיגוטה הלא-מודבקת ומבדיל לתוך הטריפומסטיגטה, הצורה ההדבקה הלא-מכפילה את זרם הדם. בתוך וקטור החרקים, טריפומסטיגוטים הופכים לשלב האפימסטיגוטה ומתרבים באמצעות ביקוע בינארי.
מאמר זה מתאר בדיקה המבוססת על מדידת הפעילות של הציטופלסמית β-גלקטוזידאז המשתחררת לתרבית עקב ליזה של טפילים באמצעות המצע, כלורופנול אדום β-D-גלקטופירנוזיד (CPRG). לשם כך, זן T. cruzi Dm28c עבר טרנספקטציה עם פלסמיד בעל ביטוי יתר של β-גלקטוזידאז ומשמש לבדיקה פרמקולוגית במבחנה בשלבי אפימסטיגוטה, טריפומסטיגוטה ואמאסטיגוטה. מאמר זה מתאר גם כיצד למדוד את הפעילות האנזימטית באפימסטיגוטים בתרבית, בתאי Vero נגועים ב-amastigotes ובטריפומסטיגוטים ששוחררו מהתאים בתרבית באמצעות תרופת הייחוס, benznidazole, כדוגמה. בדיקה קולורימטרית זו מבוצעת בקלות וניתן לשנות את קנה המידה שלה לתבנית בתפוקה גבוהה ולהחיל אותה על זנים אחרים של T. cruzi .

בעקבות הפרוטוקול שתואר לעיל, β-galactosidase-מבטאי Dm28c epimastigotes היו דגירה עם 6 ריכוזים של BZN (2.5, 5, 10, 20, 40, 80 μM) (או תרכובות עניין) (או תרכובות עניין) במשך 72 שעות. לאחר תקופה זו נוסף ריאגנט CPRG יחד עם חומר ניקוי, אשר מזיז את התאים ומשחרר β-גלקטוזידאז. CPRG נבקע על ידי β-גלקטוזידאז כדי לייצר כלורופנול אדום, מה ש...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃŽÂ²-galactosidase at JoVE.com

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing ÃƒÅ½Ã‚Â²-galactosidase

אנו מתארים בדיקה קולורימטרית בתפוקה גבוהה המודדת את פעילות β-גלקטוזידאז בשלושה שלבי מחזור חיים של טריפנוזומה קרוזי, הגורם הסיבתי של מחלת צ'אגאס. ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לזהות תרכובות טריפנוצידיות בצורה קלה, מהירה וניתנת לשחזור.

במבחנה בדיקת סמים נגד כל שלבי מחזור החיים של טריפנוזומה קרוזי באמצעות טפילים המבטאים β-גלקטוזידאז

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

פרוטוקול זה מתאר בדיקה קולורימטרית בתפוקה גבוהה בשלושת שלבי מחזור החיים של טריפנוזומה קרוזי כדי לזהות מועמדים חדשים לתרופה למחלת צ'אגאס. ניתן להשתמש בו כדי לזהות תרכובות טריפנוצידיות בצורה קלה, מהירה וניתנת לשחזור. מי שתדגים את ההליך תהיה רומינה מנארין, טכנאית תרביות תאים במעבדה של פמלה.התחילו על ידי גידול בטא גלקטוזידאז המבטא את טריפנוזומה קרוזי אפימסטיגוטס בבקבוק תרבית רקמה T-25 ודגירה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס לגידולם באופן אקסני. באמצעות תא נויבאואר, לכמת את צמיחת הטפיל לפני תת-התרבות. לשמירה על התרביות בשלב לוג, תת-תרבות כל 48 עד 72 שעות בחמישה מיליליטרים של מדיום LIT בתוספת 10% FCS וגנטיקאין בסולפט בריכוז סופי של 200 מיקרוגרם למיליליטר.לאחר מכן סגרו היטב את הכובע לפני דגירה בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס במצב אנכי. מתרבית שלב הלוג, יש לבצע השעיה של אפימסטיגוטה במדיום LIT בתוספת גנטיקאין וסולפט בריכוז הסופי של 200, 000 תאים למיליליטר אפימסטיגוטה למיליליטר אפימסטיגוטה למיליליטר. לאחר חלוקת 100 מיקרוליטרים של מתלים לכל באר של צלחת באר 96, איפור נפח סופי של 200 מיקרוליטרים עם בינוני.הפוך את ההשעיה של תאי Vero ב- DMEM לתוספת עם 2%FCS בריכוז הסופי של 100, 000 תאים למיליליטר. זרע 100 מיקרוליטרים של ההשעיה לכל באר בצלחת תרבית רקמה 96 באר. דגירה של התאים למשך הלילה לצורך היצמדות ולמחרת, התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ.למחרת, לשטוף את monolayer תא Vero שלוש פעמים עם 100 microliters של PBS סטרילי. הוסף טריפומסטיגוטים מטא-מחזוריים שהתקבלו בעבר. הוסף ריבוי של זיהום או MOI של 10-1 מתוך 100 מיקרוליטרים של DMEM בתוספת 2% FCS לכל באר ודגירה במשך שש שעות כפי שהוכח בעבר.בסוף הדגירה, שטפו את הצלחת פעמיים עם PBS והוסיפו 100 מיקרוליטרים של DMEM ללא פנול אדום בתוספת 2%FCS. לאחר ביצוע ההשעיה של תאי Vero ב- DMEM מוסיפים את הריכוז הסופי של 1 מיליון תאים למיליליטר. זרע 800, 000 תאים בחמישה מיליליטרים של המדיום בבקבוקי T-25 ודגירה למשך הלילה להדבקת תאים.לאחר שטיפת הבקבוקון ב-PBS, הוסיפו טריפומסטיגוטים, הוסיפו MOI של 10-1 בחמישה מיליליטרים של DMEM בתוספת 2%FCS ודגרו למשך הלילה כפי שהוכח בעבר. בסוף הדגירה, לשטוף את הבקבוק פעמיים עם PBS. הוסיפו חמישה מיליליטרים של DMEM טרי עם תוספת של 2% FCS ודגירה למשך ארבעה ימים.בסוף הדגירה, לאחר התבוננות בסופרנאטנט לנוכחות טריפומסטיגוטס תחת מיקרוסקופ אופטי. לכמת את הטריפומסטיגוטים באמצעות תא נויבאואר. אספו את הסופרנאטנט בצינור 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-7, 000 פעמים G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט והחזירו את הכדור ב-DMEM ללא פנול אדום בתוספת 2%FCS כדי לקבל ריכוז של 1 מיליון טריפומסטיגוטים למיליליטר. זרע 100 microliters של מתלה טריפומסטיגוט לכל באר בצלחת 96 באר. הוסיפו תמיסת בנזנידזול לאפימסטיגוטים, תאי Vero עם אמסטיגוטים, או טריפומסטיגוטים כמתואר בכתב היד של הטקסט.לאחר מכן דגירו את האפימסטיגוטים, קבעו 28 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות ואת הטריפומסטיגוטים או את תאי ה-Vero הדביקו באמהסטיגוטים במשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. עבור הבדיקה הצבעמטרית, הגדר את הבארות הריקות על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של PBS או מדיום מתאים. לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטרים של תמיסת מצע CPRG ו -10 מיקרוליטרים של תמיסת חומרי הניקוי לכל באר לקבלת ריכוז סופי של 200 מיקרומולר CPRG ודטרגנט של 0.1% בנפח סופי של 250 מיקרוליטרים בכל באר.לאחר הדגירה, ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, למדוד ספיגה ב 595 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר microplate. בתוכנה, צור פרוטוקול חדש על-ידי בחירת ספיגה כשיטת הזיהוי ונקודת הסיום כסוג הקריאה ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר מכן, הוסף שלב קריאה.הקלד את אורך הגל שנבחר ולחץ על אישור. במקטע פריסת הלוח סמן את הבארות שיש לקרוא, לחץ על אישור ולחץ על לוח הקריאה, המתן עד שהערכים יופיעו על המסך וייצא אותם לגיליון אלקטרוני כדי לנתח את התוצאות ולחשב את ערכי הספיגה באמצעות חיסור כמתואר בכתב היד. בתוכנת ניתוח סטטיסטי, התווה את ריכוז ה- BZN לעומת הספיגה ב- 595 ננומטר בטבלת XY.המיר את ריכוזי ה-BZN לערכים לוגריתמיים על-ידי לחיצה על נתח, בחירה באפשרות הטרנספורמציה ולחיצה על אישור. לקבלת ערכי IC50, לחץ על נתח, ומתוך רשימת ניתוח XY בחר התאמה של עקומת רגרסיה לא ליניארית, ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר מכן, עבור אל חלון הפרמטרים, בכרטיסיית המודל, עבור אל קבוצת עיכוב תגובת המינון של משוואות מובנות, בחר מעכב יומן לעומת שיפוע משתנה תגובה לפרמטרים מכיוון ששיטת תגובת המינון השאר את כל הכרטיסיות האחרות בערכי ברירת המחדל ולאחר מכן לחץ, בסדר.לחץ על סעיף התוצאות כדי למצוא את הערך IC50, את ה- SD ואת טובת ההתאמה. לחץ על מקטע הגרף כדי למצוא את גרף XY של הריכוז הלוגריתמי של התרופה לעומת ערכי הספיגה ולוודא שהתאמת העקומה מופיעה גם בצבע אחר. במחקר הנוכחי, הערך IC50 שהתקבל עבור אפימסטיגוטים היה כ -20 מיקרומולאר, בדומה למחקרים קודמים.בנוסף, התוצאות הצביעו על פעילות הבטא גלקטוזידאז של האפימסטיגוטים לאורך זמן. חשוב מאוד לבצע לפחות שכפולים של כל מצב שנבדק ושגיאות ממוזערות בניהול אמצעי אחסון.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

צעד אחד ראפיד סינתזה האנזימטית-כל מימית טיהור של אנלוגים trehalose

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

שיטה ערכי צבע מוחלטים למדידת תכולת ברזל צמחים

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

שיחזור התנודות מחזור התא ב- Microemulsions של תמציות ביצה ללא תא צפרדע רפואית

Real-time measurement of oscillations at the single-cell level is important to uncover the mechanisms of biological clocks. Although bulk extracts ...

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

בידוד F1-ATPase מ פרוטיסטים טפילי Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

קינטי הקרנה של פעילות Nuclease באמצעות חומצות גרעין רגשים

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

הקרנה עבור התרמוטוגה מארימה ממברנה מאוגדות פירופוספטאז מעכבי

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

הקרנה לפיטואסטרוגנים באמצעות קולטן אסטרוגן מבוסס תאים β הכתב Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

גניבות של גבישי חלבון עם I3C באמצעות הקרנת מטריצת מיקרו-זרעים אקראית

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...